RAW2647小鼠巨噬细胞protocol.docx
- 文档编号:28397462
- 上传时间:2023-07-13
- 格式:DOCX
- 页数:24
- 大小:1.11MB
RAW2647小鼠巨噬细胞protocol.docx
《RAW2647小鼠巨噬细胞protocol.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《RAW2647小鼠巨噬细胞protocol.docx(24页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
RAW2647小鼠巨噬细胞protocol
RAW264.7细胞株的相关信息
ATCC:
美国模式培养物集存库(Americantypeculturecollection)的简写
收到冷冻管细胞的处理方式
1.收到细胞株包裹时,请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形,若有请立即通知。
细胞株请尽速开始培养,或立即冷冻保存(置于–70℃,隔夜后,移到液氮)。
2.收到T25flask细胞的处理方式
于寄送过程中,为避免起泡造成细胞脱落死亡,T25flask均加满培养基。
2.1. 检查flask外观,并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象,若有任何问题,不要打开盖子,请立即通知细胞实验室。
2.2. 将原封之T25flask静置于37℃,5%CO2培养箱中,使细胞回温至37℃,并让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。
2.3. 隔天后,于无菌操作箱内取出flask内之培养基,(取出之培养基可以再使用),仅留约5-10ml培养基于flask内,依一般培养方式再将细胞置入培养箱中,或细胞已长满盘,则将细胞做传代培养。
RAW264.7细胞株的CellCulture
一、RAW264.7细胞培养的特点
1、RAW264.7细胞一般为圆形或椭圆形,功能活跃时,可呈多突形。
细胞核为圆形或椭圆形,染色较深。
贴壁特别牢固。
2、RAW264.7具有很强的吞噬能力,当吞噬抗原后,细胞会释放趋化因子,进一步促进细胞伸出伪足,增强粘附攀爬能力。
细胞吞噬抗原过多、培养环境恶劣都会促进该细胞呈现梭形、长梭形,镜下会看到具有细长伪足的小细胞被类似上皮的梭形大细胞取代。
3、每次传代都很难消化下来。
用力过大则对细胞损伤较大,这种细胞传代时接种密度要大,否则容易使巨噬细胞向终末细胞分化,细胞变成长形,并且不能回复,这是培养这种细胞时最需要注意的问题。
4、对于RAW264.7细胞他的声场时喜欢结伴。
正常生长状态应该是一小片一小片的生长,片片之间不连接,等到长到更多更密的时候会连成大片,并且会叠加成层。
所以,要很好地控制好细胞的生长速度,不要等到叠加成层的时候再传代。
5、RAW264.7细胞传代后贴壁时间较短,半小时就能贴很多,刚贴壁是细胞呈圆形,折光度很好,镜下观察如小珍珠状一个个地散落于瓶底面。
生长一段时间后,部分细胞会变成类似四角形,伸出伪足之类的。
这个时候就是提醒你注意传代了,这部分细胞如再不传代,很容易就老化掉。
二、RAW264.7细胞传代
1)将培养瓶内旧的培养液弃掉,然后用D-Hanks液洗两次,(一定要洗干净,以免影响胰酶的消化作用)
2)加入0.25%胰酶-EDTA消化,25cm培养瓶加0.4ml,37度消化5min,镜下看到细胞变圆,间隙增大。
(值得注意的是该细胞对机械损伤比较敏感)
3)立即加含10%FCS的培养液终止消化,用细胞刮刀轻刮,注意,这时候用吸管吹不下来,但是刮刀却很容易刮下来,而且对细胞的损伤极小
4)离心,弃上清,加新的培养液(10%FCS),小心吹匀,分装入新的培养瓶
三、RAW264.7细胞冻存及复苏
(一)细胞冻存
1.配制冻存培养液;(通用的为培养基:
血清:
DMSO=7:
2:
1,但其中的血清可进行调整,如上面的仁兄用的4:
5:
1,比例过高)
2.取对数生长期的细胞(冻存前一天换液),用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来,悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中;
3.离心1000rpm,5min;
4.去除胰蛋白酶及旧的培养液,加入适量配制好的冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml~1×107/ml;
5.将细胞分装入冻存管中,每管1~1.5ml(不超过冻存管容量的80%);
6.在冻存管上标明细胞的名称,冻存时间及操作者;
7.冻存:
标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/min;当温度达-25℃以下时,可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃时,则可迅速浸入液氮中。
也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h,然后放入-70℃冰箱中过夜,取出冻存管,移入液氮容器内。
(具体操作为4°C20min,-20°C30min,-70℃过夜,转入液氮中)
(二)细胞复苏
1.从液氮容器中取出冻存管,直接浸入37℃温水中,并不时摇动令其尽快融化。
(1min以内溶解完毕,不能将口进入水面下)
2.从37℃水浴中取出冻存管,打开盖子,用吸管吸出细胞悬液,加到离心管并滴加10倍以上培养液,混匀;
3.离心,1000rpm,5min;
4.弃去上清液,加入含10%小牛血清培养液重悬细胞,计数,调整细胞密度,接种培养瓶,37℃培养箱静置培养;(复苏时细胞密度稍大,可提高复苏效率)
5.次日更换一次培养液,继续培养。
(可更换一半培养液,避免跨度太大,影响细胞状态)
(三)接种
四、RAW264.7细胞形态不好时的处理方法
1.倒掉旧的培养基,加入3ml新的培养基(有无血清的都可)洗涤一次,用滴管吸走,然后再加入3ml的培养基,进行预吹打,控制吹打力度,轻轻地大概沿着瓶底过一遍,然后吸走。
这时侯再开始正式的消化、吹打。
2.把吹打下来的细胞悬液加入到新的培养瓶内,培养瓶事先加入培养基,放入培养箱内培养,按时间点观察细胞贴壁情况。
10分钟观察一次,20分钟,30分钟观察一次。
选择一个时间点,已经有部分细胞贴壁的情况下,重新置于洁净台,底面朝上迅速倒出其中的培养基,加入3ml新培养基再轻轻洗一次。
然后加入完全培养基培养。
后续观察细胞生长情况以及形态。
我称之为“二传”。
3.如果一次效果还不理想,可重复多次。
直到找到细胞完美形态。
其中要注意,结合细胞喜欢的生长情况。
喜欢多一点数量长得好的细胞就等贴壁细胞比较多点的时候再传。
反之亦然。
不明之处:
培养之前,一切与细胞接触的玻璃器皿和器具都要进行过去热源处理。
(200-250℃烘烤4-6h)?
?
RAW264.7细胞株CellCulture的材料
(一)仪器
1.净化工作台
2.离心机
3.恒温水浴箱
4.冰箱(4℃、-20℃、-70℃)
5. 倒置相差显微镜
6.培养箱
7.液氮冰箱
(二)玻璃器皿
1.吸管(弯头、直头)
2.培养瓶
3.玻璃瓶(250ml、100ml)
4.废液缸
(三)塑料器皿
1.吸头
2.枪头
3.胶塞
4.移液管(10ml)
5.15ml离心管
6.冻存管(1~2ml)
(四)其他物品
1.微量加样枪
2.红血球计数板
3.记号笔
4.医用橡皮膏
5.移液枪
(五)试剂
1.D-Hanks液
2.胎牛血清
3.培养液
4.双抗(青霉素、链霉素)
5.胰蛋白酶(0.25%)
6.7.4%NaHCO3
7.DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油
附1.胎牛血清品牌整理
第一类,最高级别,是专门用于干细胞的特级胎牛血清
1、Hyclone的特级胎牛血清
目前,性能最好的血清,还是要说说Hyclone的特级胎牛血清,货号是SH30070.03,它是Hyclone的“招牌菜”。
Hyclone特级胎牛血清(DefinedFBS),货号SH30070,是世界上唯一经过40纳米过滤的顶级胎牛血清,极佳的促细胞生长作用及产品稳定性。
内毒素含量≤10EU/ml,血红蛋白含量≤10mg/dl。
此血清可以广泛用于各种细胞培养,包含任何干细胞系的培养。
2、Gibco的特级胎牛血清
稍次一点的是Gibco公司在美国原装生产的特级胎牛血清,这款血清,货号是16000-044,是100nm过滤3次,内毒素和血红蛋白含量都可以与Hyclone的SH30070.03相媲美。
也可以用于培养大部分的干细胞系。
同样是美国来源,所以渠道特殊。
3.TCB的特级胎牛血清
TCB(TissueCultureBiologicals)公司作为一家生物行业类的著名供应商,成立于1978年,大部分血清的采集和加工都在加利福尼亚。
每一批的原材料都经过严格筛选,所有的产品都在FDA认证的cGMP车间进行!
4.Bioind特优级胎牛血清
血源来自北美和澳大利亚BioInd公司的生产完全符合GMP的要求,并通过ISO9000:
2001和ISO13485:
2003质量认证。
以安全,稳定,高效为原则的BioInd公司,所有的产品质量均完全符合国际标准。
BiologicalIndustries主营细胞培养类产品,BioInd工厂加工的胎牛血清均符合USDA标准及欧洲标准血清。
根据美国农业部标准,原始血清均采自未发生疯牛病(BSE)和口蹄疫(FMD)疫情的国家。
BiologicalIndustries三步滤菌处理法,最后的过滤步骤为连续通过三个100纳米的滤膜。
血清生产的洁净级别为100级。
所有分装工作台都通过高效微粒空气过滤器过滤,并保持正压分装环境要对总微粒、悬浮微粒数和压力进行监控。
分装之后,终产品迅速-20度冻存,并隔离,直到所有的质量控制检测完成。
第二类,优等胎牛血清
1.Hyclone的加拿大优等胎牛血清
性价比最高的是Hyclone加拿大优等胎牛血清(CharacterizendFBS)SH30396.03血清采自加拿大,由hyclone公司总部的员工采集加工,采集方法,加工过程,检定标准与美国原产优等胎牛血清完全一致,市场价格低于美国原产的。
经过3次100nm过滤,内毒素含量≤25EU/ml,血红蛋白含量≤25mg/dl
2、Hyclone的南美优级胎牛血清
大体与加拿大的优等血清是一样的,级别也非常相似,货号是sv30087.02,该胎牛血清来源于南美洲,以封闭的心脏穿刺方式采集,产品经3次100nm过滤,经严格检测确保无支原体,细菌病毒检测依据美国药典(USP)和美国联邦法规第九篇(9CFR),内毒素含量≤10EU/ml,血红蛋白含量≤20mg/dl,完全符合美国HyClone®优等胎牛血清的检测标准。
3、Gibco的澳大利亚胎牛血清
情况和Hyclone的澳大利亚胎牛血清差不多,市场价也是3200元/500ml左右。
这一级别的血清,也能用于干细胞培养,可是,不象特级胎牛血清那么优秀。
因为,此胎牛血清属于澳大利亚生产的,不在疫区,可以正常报关进口,目前没有受到任何影响,所以,就目前而言,算是最好的胎牛血清了,有不少客户都此血清来培养干细胞,效果还是比较不错。
4、TCB的优级胎牛血清
情况和Hyclone的澳大利亚胎牛血清差不多,市场价也是2300元/500ml左右。
这一级别的血清,也能用于干细胞培养,可是,不象特级胎牛血清那么优秀。
第三类,一般级别的进口胎牛血清
1、Hyclone的南美胎牛血清
目前,市场上用的最多的Hyclone血清是南美胎牛血清(FBS)SV30087,此血清采自南美,在国内(兰州)过滤并测试检验,经三次100纳米过滤,根据中国商标法的规定标贴中文标签,内毒素含量≤10EU/ml,血红蛋白含量≤20mg/d。
此血清广泛用于各种肿瘤细胞的培养,还没有资料记载能够用于干细胞,也听说有少数人用于干细胞培养的,不过,因为本身血红素比较高,所以,最好不要用于干细胞,
2、Gibco的南美胎牛血清
这款血清,是Gibco针对Hyclone南美胎牛血清做的,价格比较贵,好像是1780元/500m。
3、Gemini的胎牛血清
4、TCB的胎牛血清
5、PAA的胎牛血清
6、JRH澳洲胎牛血清
第四类,国产的各种系列胎牛血清
国产的胎牛血清,国内没有严格意义的胎牛血清,胎牛血清本身是需要穿刺取血的,而国内都是剖腹产出胎牛,8小时左右取血,然后,进行过滤分装。
所以,国产的胎牛血清不是严格意义的胎牛血清。
价格便宜但是遇到的问题非常多。
附2.Hyclone液体培养基
普通液体培养基列表
描述
货号
包装
储存温度
BME培养基(BasalMediumEagle)
EBSS*,含L-谷氨酰胺。
●SH30157.01
500ml
2-8°C
○SH30157.02
1000ml
2-8°C
DMEM培养基(Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium)
高糖,含4.0mML-谷氨酰胺,不含丙酮酸钠。
●SH30022.01B
500ml
2-8°C
●SH30022.FS
6x500ml
2-8°C
●SH30022.02B
1000ml
2-8°C
●SH30022.LS
6x1000ml
2-8°C
高糖,不含L-谷氨酰胺与丙酮酸钠。
●SH30081.01
500ml
2-8°C
●SH30081.FS
6x500ml
2-8°C
●SH30081.02
1000ml
2-8°C
●SH30081.LS
6x1000ml
2-8°C
○SH30081.03
20L袋装
2-8°C
○SH30081.04
10L袋装
2-8°C
高糖,含4.0mML-谷氨酰胺、丙酮酸钠。
●SH30243.01B
500ml
2-8°C
●SH30243.FS
6x500ml
2-8°C
●SH30243.02
1000ml
2-8°C
●SH30243.LS
6x1000ml
2-8°C
○SH30243.03
10L袋装
2-8°C
○SH30243.04
20L袋装
2-8°C
高糖,含L-谷氨酰胺、HEPES,不含丙酮酸钠。
●SH30249.01
500ml
2-8°C
●SH30249.02
1000ml
2-8°C
高糖,不含钙、镁。
●SH30262.01
500ml
2-8°C
○SH30262.02
1000ml
2-8°C
高糖,含L-谷氨酰胺,不含酚红与丙酮酸钠。
●SH30284.01
500ml
2-8°C
●SH30284.02
1000ml
2-8°C
高糖,含丙酮酸钠,不含L-谷氨酰胺。
●SH30285.01
500ml
2-8°C
●SH30285.FS
6x500ml
2-8°C
●SH30285.02
1000ml
2-8°C
●SH30285.LS
6x1000ml
2-8°C
○SH30285.03
20L袋装
2-8°C
○SH30285.04
10L袋装
2-8°C
高糖,改良型,不含酚红、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺。
○SH30585.01
500ml
2-8°C
●SH30585.02
1000ml
2-8°C
高糖,改良型,不含酚红、L-谷氨酰胺,含丙酮酸钠。
●SH30604.01
500ml
2-8°C
●SH30604.02
1000ml
2-8°C
高糖,含丙酮酸钠,不含L-谷氨酰胺、甲硫氨酸、胱氨酸。
○SH30606.01
500ml
2-8°C
○SH30606.02
1000ml
2-8°C
高度改良,含丙酮酸钠、25mMHEPES,不含L-谷氨酰胺。
○SH30563.01
500ml
2-8°C
○SH30563.02
1000ml
2-8°C
高糖,含丙酮酸钠,不含L-谷氨酰胺、磷酸盐。
○SH30607.01
500ml
2-8°C
低糖,含4.0mML-谷氨酰胺、110mg丙酮酸钠。
●SH30021.01B
500ml
2-8°C
●SH30021.FS
6x500ml
2-8°C
●SH30021.02
1000ml
2-8°C
含2.50mML-谷氨酰胺、15mMHEPES。
●SH30023.01B
500ml
2-8°C
●SH30023.FS
6x500ml
2-8°C
●SH30023.02
1000ml
2-8°C
含HEPES,不含L-谷氨酰胺。
●SH30126.01
500ml
2-8°C
●SH30126.FS
6x500ml
2-8°C
○SH30126.02
1000ml
2-8°C
含L-谷氨酰胺、HEPES、丙酮酸钠。
●SH30261.01
500ml
2-8°C
●SH30261.02
1000ml
2-8°C
含L-谷氨酰胺,不含HEPES。
●SH30271.01
500ml
2-8°C
●SH30271.FS
6x500ml
2-8°C
●SH30271.02
1000ml
2-8°C
含L-谷氨酰胺,不含HEPES、酚红。
●SH30272.01
500ml
2-8°C
●SH30272.02
1000ml
2-8°C
Ham"s培养基(Ham’sNutrientMixture)
F10培养基,含L-谷氨酰胺。
●SH30025.01
500ml
2-8°C
○SH30025.02
1000ml
2-8°C
F12培养基,含1.00mML-谷氨酰胺。
1X
●SH30026.01B
500ml
2-8°C
●SH30026.FS
6x500ml
2-8°C
●SH30026.02
1000ml
2-8°C
F12培养基,Kaighn"s改良型。
●SH30526.01
500ml
2-8°C
○SH30526.02
1000ml
2-8°C
昆虫培养基(InsectMedia)
Grace"s无添加剂培养基
○SH30610.01
500ml
2-8°C
○SH30610.02
1000ml
2-8°C
TNM-FH培养基
●SH30280.02
500ml
2-8°C
●SH30280.03
1000ml
2-8°C
IMDM培养基(Iscove"sModifiedDulbecco"sMedium)
含L-谷氨酰胺、HEPES,不含α-硫代甘油。
●SH30228.01B
500ml
2-8°C
●SH30228.FS
6x500ml
2-8°C
●SH30228.02
1000ml
2-8°C
不含L-谷氨酰胺。
●SH30259.01
500ml
2-8°C
●SH30259.02
1000ml
2-8°C
Leibovitz培养基(LeibovitzMedium)
L-15培养基,含2.05mML-谷氨酰胺。
●SH30525.01
500ml
2-8°C
●SH30525.02
1000ml
2-8°C
M199培养基(Medium199)
EBSS*,含L-谷氨酰胺。
●SH30253.01B
500ml
2-8°C
○SH30253.FS
6x500ml
2-8°C
●SH30253.02
1000ml
2-8°C
HBSS*,含L-谷氨酰胺。
○SH30233.01
100ml
2-8°C
○SH30233.02
500ml
2-8°C
HBSS*,含L-谷氨酰胺、L-氨基酸。
○SH30330.01
500ml
2-8°C
○SH30330.02
1000ml
2-8°C
McCoy"s5A培养基(McCoy"s5AMedium)
含L-谷氨酰胺。
●SH30200.01
500ml
2-8°C
●SH30200.FS
6x500ml
2-8°C
●SH30200.02
1000ml
2-8°C
含L-谷氨酰胺,不含酚红。
●SH30270.01
500ml
2-8°C
○SH30270.02
1000ml
2-8°C
含L-谷氨酰胺、HEPES。
○SH30602.01
500ml
2-8°C
○SH30602.02
1000ml
2-8°C
○SH30602.03
100ml
2-8°C
MEM培养基(MinimumEssentialMedium)
EBSS*,含2.0mML-谷氨酰胺。
●SH30024.01B
500ml
2-8°C
●SH30024.FS
6x500ml
2-8°C
●SH30024.02
1000ml
2-8°C
●SH30024.LS
6x1000ml
2-8°C
EBSS*,含L-谷氨酰胺,用于悬浮培养。
○SH30235.01
500ml
2-8°C
○SH30235.02
1000ml
2-8°C
EBSS*,不含L-谷氨酰胺。
●SH30244.01
500ml
2-8°C
●SH30244.FS
6x500ml
2-8°C
●SH30244.02
1000ml
2-8°C
○SH30244.LS
6x1000ml
2-8°C
α改良型,含L-谷氨酰胺、核糖核苷及脱氧核糖核苷。
●SH30265.01B
500ml
2-8°C
●SH30265.02
1000ml
2-8°C
●SH30265.FS
6x500ml
2-8°C
α改良型,不含L-谷氨酰胺、核糖核苷及脱氧核糖核苷。
●SH30568.01
500ml
2-8°C
○SH30568.FS
6x500ml
2-8°C
○SH30568.02
1000ml
2-8°C
Richter"s改良型,不含酚红。
○SH30600.01
500ml
2-8°C
○SH30600.02
1000ml
2-8°C
Richter"s改良型,含L-谷氨酰胺、酚红。
●SH30601.01
500ml
2-8°C
○SH30601.02
1000ml
2-8°C
用于悬浮培养,不含L-谷氨酰胺、氯化钙及镁。
○SH30603.01
500ml
2-8°C
○SH30603.02
1000ml
2-8°C
RPMI1640培养基(RPMI1640Medium)
1X,含2.05mML-谷氨酰胺(同SH30091)。
●SH30027.01
500ml
2-8°C
●SH30027.FS
6x500ml
2-8°C
●SH30027.02
1000ml
2-8°C
●SH30027.LS
6x1000ml
2-8°C
1X,含2.05mML-谷氨酰胺(同SH30027)。
○SH30091.01
20L袋装
2-8°C
○SH30091.02
10L袋装
2-8°C
不含L-谷氨酰胺
●SH30096.01
500ml
2-8°C
●SH30096.FS
6x500ml
2-8°C
●SH30096.02
1000ml
2-8°C
○SH30096.LS
6x1000ml
2-8°C
○SH30096.04
10L袋装
2-8°C
○SH30096.0
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- RAW2647 小鼠 巨噬细胞 protocol