猪流感病毒H1亚型HA蛋白特异性单克隆抗体的研制.docx
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猪流感病毒H1亚型HA蛋白特异性单克隆抗体的研制
猪流感病毒H1亚型HA蛋白特异性单克隆抗体的研制
(作者:
___________单位:
___________邮编:
___________)
作者:
李洪涛,刘明,刘春国,杜金玲【摘要】 目的:
研制猪流感病毒抗H1亚型HA特异性单克隆抗体(mAb)。
方法:
构建H1亚型猪流感病毒A/Swine/Guangdong/LM/2004(H1N1)HA基因表达质粒,基因免疫6~8周龄雌性BALB/c小鼠,加强免疫后取其脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0进行融合。
通过ELISA、HI试验筛选阳性克隆。
应用ELISA、HI试验和Westernblot试验测定mAb的反应性和特异性。
结果:
共获得3株分泌抗H1亚型猪流感病毒HA蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为8C4、8C6、9D6。
mAb腹水ELISA效价在1∶16000~1∶256000之间;HI效价为1∶512~1∶256000;对A/Swine/Guangdong/LM/2004的中和效价分别为:
10-2.83、10-6.4、10-5.8。
Westernblot分析结果显示,3株mAb只与H1亚型猪流感病毒HA蛋白反应。
结论:
HA蛋白特异性mAb的研制为H1抗原变异分析及H1亚型猪流感诊断方法的建立奠定了物质基础。
【关键词】猪流感;基因免疫;单克隆抗体;血凝抑制 [Abstract]AIM:
Topreparethemonoclonalantibodies(mAb)againsttheHAproteinofsubtypeH1ofswineinfluenzavirus(SIV).METHODS:
ToconstructrecombinantexpressionplasmidsubtypeH1ofSIVHAgeneofA/Swine/Guangdong/LM/2004(H1N1).BALB/cmiceof6-8weeksoldwereimmunizedendemicallywiththerecombinantplasmid.ThesplenocytesfromtheimmunizedmicewerefusedwithSp2/0myelomacellsafterthelastimmunization.HybridomacellswerescreenedbyELISAandhemagglutinationinhibition(HI)tests.TheactivityandspecificityofmAbswereevaluatedbyHItestandWesternblotassay.RESULTS:
ThreehybridomacelllinessecretingspecificmAbsnamed8C4,8C6,and9D6weredeveloped.TheELISAtiterofthesemAbswas1∶16000-1∶256000,theHItiterwas1∶512-1∶256000;Theneutralizedtiterof8C4,8C6,and9D6toA/Swine/Guangdong/LM/2004(H1N1)was10-2.83,10-6.4and10-5.8.WesternblotanalysconfirmedthatmAbsonlyreactedwithHAproteinofsubtypeH1ofSIV.CONCLUSION:
ThesemAbscanbeusedasausefultooltoanalyzetheantigenicvariation.TheyalsoprovidetheeffectivereagentsfortherapiddetectionofsubtypeH1ofSIV. [Keywords]swineinfluenza;geneimmunization;monoclonalantibody;hemagglutinin 猪流感是规模化养猪场普遍存在且难以根除的猪群发性疾病,不仅可直接引起患猪死亡,而且使猪群生产性能下降,对养猪业危害极大。
更值得重视的是,猪流感病毒(swineinfluenzavirus,SIV)是“猪呼吸道病综合症”的原发性致病原,并且猪是人源、禽源和猪源流感病毒的惟一共同易感宿主,因此SIV也具有重要的公共卫生学意义[1]。
在SIV的检测方法中,血凝抑制试验(HI)和荧光抗体技术(FA)是最为快速和简便的血清学检测技术。
单克隆抗体(mAb)以其特异性高、敏感性强被广泛用于各类疾病病原的血清学检测和诊断中[2]。
在动物体内由于免疫力的作用,流感病毒表面血凝素基因(hemagglutinin,HA)非常容易发生抗原漂移[3],常导致待测病毒与标准检测抗体的交叉反应性差,给检测工作带来许多困难。
因此,研制针对SIVHA蛋白mAb,对快速准确地检测SIV具有重要的应用价值[4]。
另外HA蛋白因其具有良好的免疫原性使其成为基因工程疫苗的首选[5]。
1材料和方法 1.1材料 A/Swine/Guangdong/LM/2004(H1N1)毒株由本实验室分离鉴定,小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0由本实验室保存。
鸡胚、BALB/c小鼠(8周龄,雌性)均购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心。
鉴定所用毒株均为本实验室保存。
辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠二抗购自中杉金桥公司;聚乙二醇(PEG)购自Sigma公司;mAb亚型鉴定试剂盒购自SouthernBiotech公司;次黄嘌呤氨基蝶呤胸苷培养基(HAT)、次黄嘌呤胸苷培养基(HT)购自Gibco公司;细胞培养用牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司;其他普通生化试剂均为国产分析纯。
1.2方法 1.2.1引物设计与合成 参照GenBank上已发表的H1亚型SIVHA基因序列设计引物,序列:
P1:
5′CGCGCTAGCATGAAGGCAATACTAGTGTTC3′,P2:
5′CGCTCGAGTTAGATCGCCAAAATTTGGTAAAT3′由上海博亚生物技术有限公司合成,预计目的片段长度1700bp。
1.2.2H1HA基因PCR扩增 按常规PCR方法扩增,程序为:
94℃4min,94℃30s,54℃30s,72℃2min,30个循环后,72℃10min。
扩增产物10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.2.3重组质粒的构建 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后与pCIneo质粒分别用NheⅠ/XhoⅠ双酶切,酶切产物电泳回收纯化、连接后、转化DH5α感受态细胞,37℃摇床培养1h,涂Amp平板,37℃温箱过夜培养,挑单个菌落接种于LB液体培养基,PCR鉴定。
扩大培养阳性菌,用质粒抽提试剂盒抽提重组质粒,用NheⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定。
1.2.4抗原制备及免疫 按文献[6]所述的方法制备抗原。
根据文献[7]免疫方法稍作改进,以25μg/只肌肉免疫6周龄小鼠,每隔2周免疫1次,共免疫3次。
融合前3d全病毒加强免疫1次。
1.2.5间接ELISA方法的建立 采用方阵法确定抗原最佳包被浓度、二抗最佳工作浓度、抗原包被条件、封闭液、封闭时间、被检血清最佳稀释度、待检血清反应时间、酶标二抗反应时间、底物反应时间,间接ELISA方法阴性值和阳性值临界值的确定。
1.2.6细胞融合及筛选 饲养层细胞、免疫脾细胞的制备以及细胞融合按参考文献[8]进行。
当杂交瘤细胞生长至1/3~1/2孔底面积时,吸取上清液,采用已建立的间接ELISA方法检测,对检测为阳性孔的细胞扩大培养并冻存,同时按有限稀释法亚克隆,经过至少3次克隆,待检测全部孔为阳性时,确定建立mAb细胞株。
1.2.7小鼠mAb腹水的制备 10周龄BALB/c小鼠腹腔注射0.5mL液体石蜡。
1周后,每只小鼠再腹腔注射杂交瘤细胞悬液0.5mL(约106个细胞)。
7~10d后,无菌采集腹水,离心,间接ELISA、HI检测后分装,置-20℃冻存备用。
1.2.8mAb生物学特性的测定 ①抗体类和亚类的鉴定:
按照Southernbiotech公司mAb亚型鉴定试剂盒说明书进行。
②抗体效价的测定:
间接ELISA检测、血凝抑制试验按文献[6]操作进行。
③mAb分泌稳定性测定:
杂交瘤细胞连续传代3个月液氮冻存后复苏,取培养上清检测ELISA及HI效价。
④mAb特异性鉴定:
取杂交瘤细胞培养上清,分别检测其与H3亚型SIV分离株、H5亚型AIV标准株、新城疫病毒、鹅腺病毒和鸡产蛋下降综合征病毒有无交叉反应。
⑤mAb中和活性的测定:
对SIV(H1N1)中和活性的测定按照文献[6]中固定病毒稀释血清法(β法)进行。
以MDCK细胞为载体,分别测定半数细胞培养物感染量(TCID50)以及半数保护量(PD50),结果以ReedMuench法计算。
⑥SDSPAGE和Westernblot试验:
试验操作按文献[8]进行。
2结果 2.1HA基因PCR扩增及重组质粒的构建、鉴定 经PCR扩增出目的片段,大小1700bp,重组质粒经酶切鉴定后得到1700bp和5400bp两个目的片段,说明质粒构建成功(图1、2)。
2.2ELISA检测方法的建立 抗原包被浓度为纯化病毒作250倍稀释,酶标二抗最佳工作浓度为2000倍稀释,阳性血清稀释浓度为1000倍稀释,阴性对照以Sp2/0上清作为对照,抗原包被条件为37℃感作2h,封闭液为500g/L脱脂乳,37℃封闭2h,杂交瘤细胞上清37℃感作1.5h,酶标二抗37℃感作1h,洗涤过程均是洗涤3次,每次5min,以邻苯二胺(OPD)底物显色,37℃10min,2mol/L硫酸终止反应,用酶标仪490nm读取A值,阴性血清A值0.2,P/N≥2.1判为阳性。
2.3杂交瘤细胞株的建立 以HI和间接ELISA法同时筛选,获得了3株(8C4、8C6、9D6)抗H1亚型SIV的mAb杂交瘤细胞株,经3个月稳定传代后仍能稳定分泌抗体;冻存于液氮中,3个月后复苏,细胞生长良好,抗体分泌水平未见明显改变。
2.4mAbHI、ELISA效价测定与mAb亚类鉴定结果 3株杂交瘤细胞上清、腹水HI效价最高分别为256、256000最低分别为8、512;ELISA效价最高分别为256、256000最低分别为64、16000;亚类鉴定均为IgG2a(表1)。
表1HI、ELISA检测结果及亚类鉴定结果(略) 2.5mAb特异性反应结果 HI试验结果表明,3株mAb株与H3亚型SIV、H5亚型AIV、H9亚型AIV分离株反应均呈阴性;仅与人A/PR/8/34(H1N1)亚型流感病毒有HI活性,HI均为28;与新城疫病毒、鹅腺病毒和鸡产蛋下降综合征病毒等均无交叉反应。
2.6WesternblotWesternblot试验结果表明3株mAb在Mr70000处有特异性反应条带,进一步说明所获得的3株mAb为抗H1亚型HA蛋白的特异性mAb(图3)。
2.7mAb的中和活性 SIV对MDCK细胞的半数组织细胞感染量(TCID50)值为10-1/L。
在mAb与相应病毒作用后,接种感染细胞,并以HA检测病毒在细胞上的生长情况。
3株mAb8C4、8C6、9D6均具有中和活性,它们对MDCK细胞的半数保护量(PD50)分别为10-2.83、10-6.4、10-5.8。
说明所获得的这3株mAb8C4、8C6、9D6不仅具有HI活性同时还具有中和活性。
3讨论我们注意到很多文献中使用葡萄糖、丁哌卡因等佐剂对小鼠做预处理,同时免疫剂量一般每次为100μg/只[9]。
在本试验中,小鼠经过3次,每次25μg/只免疫后,小鼠血清HI效价就能达1∶128,而且本实验室在已进行的近10个批次基于基因免疫制备mAb的过程中都是采取相同的操作,也都取得了满意效果。
这说明可能对BALB/c小鼠以较少的质粒剂量和较少的免疫次数依然能获得理想的免疫效果,同时推测实验取得较好的免疫效果与所用的pCIneo质粒有关,有待于相关试验进一步验证。
实验所得到的3株mAb均是抗HA蛋白,根据血凝抑制实验和中和实验的结果,推测抗HA蛋白mAb上具有血凝活性和中和活性的抗原表位存在一定的关联。
由实验结果可以得出,用基因免疫制备mAb比传统的全病毒或者蛋白免疫制备mAb所需周期短、特异性好、操作简便;同时对于难于筛选的mAb是一种有效的制备方法。
确诊猪流感必须进行实验室诊断,包括检测病毒和检测血清两种方法,目前已建立的诊断方法有血清学诊断、病毒分离鉴定、RTPCR技术等,由于病毒变异性强,用血清学方法仍有交叉反应,而病毒分离由于实验周期长,难以胜任快速诊断的需要;RTPCR方法虽然灵敏,也由于多种因素干扰,不能作为惟一判定依据。
因此,急需建立快速灵敏的诊断方法。
我们获得3株针对H1亚型SIVHA蛋白的mAb8C4、8C6、9D6,为猪流感病毒的研究和快速特异诊断方法的建立提供了技术保障和物质基础。
特别是8C4、8C6、9D63株mAb同时具有血凝活性和中和活性的抗体,这对于流感病毒的深入研究、基因工程重组猪流感疫苗的研究等方面均有重要价值。
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(2):
202-205.
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