高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用规范化专家共识全文.docx
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高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用规范化专家共识全文
2021高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用规范化专家共识(全文)
快速准确的微生物鉴定技术始终是临床微生物关注的焦点。
传统微生物检验,诸如形态学、培养、抗原抗体及靶向核酸检测等方法在解决疑难及未知病原微生物上存在局限性[1,2]。
新型宏基因组下一代测序(metagenomicsnext-generationsequencing,mNGS)技术直接针对样本中所有核酸进行无偏性测序,结合病原微生物数据库及特定算法,检测样本中含有的可能病原微生物序列。
随着该技术的社会经济成本不断降低和技术的不断完善,已逐渐从科研走向临床应用,成为临床疑难和未知病原微生物检验的重要手段[3]。
利用mNGS技术进行病原微生物检测需经样本前处理、核酸提取、文库制备、上机测序并满足测试的质量控制要求后,采用特定算法软件与专用的病原微生物数据库进行比对,实现对病毒、细菌、真菌、寄生虫及非经典微生物等的检测[1,4,5]。
mNGS技术不依赖培养,对常见病原微生物检验阴性、经验治疗失败、不明原因的危急重感染的病原学诊断以及新发突发传染病的病原体发现具有独特价值[6,7]。
为进一步规范mNGS技术在感染性疾病诊断中的应用,提高危急重症和疑难感染性疾病的诊疗水平,在多项国家科技专项的支持下,参考国内外相关文献、共识与规范[8,9,10,11,12,13,14,15],特别借鉴了《高通量测序技术临床检测规范化应用北京专家共识(第一版通用部分)》[16],组织本领域有关专家起草了本共识,以促进mNGS技术的规范应用和良性发展。
本共识中声明的内容为专家讨论并推荐的要点。
一、临床应用的基本要求
(一)适应证
基于医学决策的mNGS病原微生物检测申请,一般用于传统检验方法未能给出明确病原学结果从而影响患者准确诊疗的感染性疾病、新发突发传染病、验证常规检验结果或排除其他发热疾病。
推荐临床通过拟诊先行传统微生物检验及聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)检测拟诊疑似常见病原微生物,不盲目使用mNGS技术。
在必要或紧急情况下,如危急重症、疑难感染、群体性感染事件等,可考虑作为一线检测方法。
表1列出了mNGS临床应用适应性说明。
临床上在选择mNGS进行病原微生物确认时应注意如下事项:
1.mNGS检测申请表:
mNGS检测实验室应提供适合临床使用的申请表。
除患者基本信息外,申请单应包括标本类型、拟诊、现病史、既往史、流行病学史、关注的病原体、抗菌药物使用史等。
另外,申请表中应列出不同测序项目及适用范围供医生选择。
2.靶向基因测序:
基于高通量测序技术的病原微生物检测,除无偏倚的mNGS外,还包括原核生物的16SrRNA基因、真菌(5SrRNA基因两端的ITS1、ITS2及25-28SrRNA基因中的D1及D2区等)以及特定病原微生物靶基因等[17]。
如怀疑沙眼衣原体可选momp(主要外膜蛋白基因),怀疑结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)可选rpoB等靶向基因测序[18,19,20,21]。
临床医生通过测序实验室提供的项目清单选择适宜的项目,切忌大撒网式排查。
3.DNA测序与RNA测序的选择:
mNGS技术理论上可检测以核酸为遗传物质的所有病原微生物。
若临床上已排除病毒感染,可直接进行DNA测序。
考虑到DNA测序受人源基因组影响较大,为避免因死亡微生物DNA残留影响现症感染判断,可进行RNA测序[14,22,23]。
当怀疑病毒感染,尤其对呼吸道、脑脊液(cerebrospinalfluid,CSF)及血液标本,或临床表现复杂,无特定怀疑方向时,需要同时对样本中的DNA和RNA进行测序。
mNGS技术本身是一种核酸检测技术,由于不同微生物类别本身结构差别,其核酸释放效率差异明显,尤其是真菌、分枝杆菌等核酸提取需要特定的破壁处理,对于疑似真菌或分枝杆菌感染时也应特别提出,在检测过程中增加必要的样本处理过程。
4.mNGS技术的局限性:
受临床mNGS技术本身、测序成本及数据库等影响,常规mNGS策略常无法获得样本中所有微生物的序列,临床标本中低浓度致病微生物可能会漏检,同时针对特定的耐药或毒力基因的分析亦较难实现[5]。
如果需要对耐药基因或毒力基因进行分析,可以采用特定方法去除部分人源宿主核酸以提升微生物基因组比例,或者结合耐药相关基因或毒力基因进行靶向捕获富集后进行。
申请者如有特殊要求应加以注明。
(二)标本类型及采集规范
理论上,凡存在于临床标本中的病原微生物均可通过mNGS检出,但该技术的准确性依赖标本中微生物的核酸质量及含量,也依赖于不同类别微生物核酸的提取效率。
1.血液及高凝标本:
持针器肘静脉采集3~5ml[实验室提供专用采血管,即游离DNA样本保存管,内含乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA)抗凝剂和保护剂,可抑制血浆中核酸酶及有核细胞中DNA的释放]。
采血时皮肤需彻底消毒,采血至刻度,上下颠倒混匀5~10次,条码标记或编号。
切忌在输液处或导管处采集血标本。
此外,高凝状态的关节液、胸腹腔积液,甚至CSF也可采用此方法。
如果增加RNA测序应同时采2管。
2.支气管肺泡灌洗液及痰液:
严格按操作规程采集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid,BALF),弃去前段可能污染的部分,回收10ml置无菌螺帽管(塑料或玻璃质地均可)中,内含支气管末梢和肺泡中的分泌物。
咳痰标本需在医护人员协助下,患者用生理盐水漱口2~3次,弯腰90°,用力咳出深部痰3~5ml置无菌螺帽管中。
若无法自行咳痰,可通过吸痰器从气道采集。
咽拭子只适用于呼吸道病毒检测。
检查容器有无渗漏,紧盖后封口膜密封,条码标记或编号。
3.CSF、房水及其他体液:
经专科医生标准化采集方法获得,无菌螺帽管封口膜密封。
CSF(留取第2管或第2管后标本)、关节腔积液、胆汁等检测病原微生物DNA或RNA需采集1ml,如同时进行DNA及RNA测序应采集2ml。
房水至少采集200μl。
骨髓单独进行DNA或RNA测序,0.5ml标本即可,如果同时进行DNA及RNA测序则至少采集1ml。
这些临床标本采集困难,切记防污染,避免经引流管采集。
胸腹腔积液需富集后提核酸,至少采集10ml[24]。
4.脓肿及深部组织:
(1)开放性脓肿需清创后采集深部伤口或溃疡基底部分泌物拭子置无菌管中。
(2)封闭的脓肿需对病灶局部的皮肤或黏膜表面彻底消毒,注射器抽取脓液,若少于3ml,应采集最大标本量送检。
(3)深部组织感染需手术取材,置于无菌螺帽瓶中。
多数情况下组织中病原微生物含量低于脓液,尽可能取脓肿边缘组织。
5.粪便标本:
至少黄豆粒大小的新鲜标本,稀便3~5ml,置螺帽容器中。
6.标本转运:
若标本在24h内到达实验室并开始检测,可考虑冰袋低温运输;若运输时间在24~72h内,应干冰运输,并立刻进行标本前处理和核酸提取;血液标本4℃冰箱保存不得超过7d(专用采血管),在运输过程中避免剧烈晃动;其他临床标本如需长期保存,应按如下原则执行:
(1)DNA测序:
-20℃保存不超过7d。
(2)RNA测序:
应置-80℃。
(3)避免标本反复冻融,一般不得超过3次。
(4)理论上-80℃可长期保存。
(5)若怀疑高致病性或新发突发传染病,严格按照国内传染病法等相关法律要求包装及转运。
尽可能在医院生物安全防护条件下抽提核酸后再送测序。
建议1:
原则上,临床怀疑病原微生物感染,常规方法未得到明确病原学证据而影响临床救治时,可利用mNGS进一步确认。
鼓励临床在排除常见病原微生物后有目的选择mNGS。
申请单应填写临床表现、症状体征、治疗经过、现病史、流行病学史及既往史等。
测序实验室应让申请者知晓不同类型感染性疾病的标本选择、采集时机、采集方式、送检量、转运及储存条件、不同mNGS检测策略的适用范围。
疑为传染病应符合国家相关生物安全标本采集及转运要求。
申请者可提出重点关注的病原体,如呼吸道病毒、结核分枝杆菌、真菌及寄生虫等。
实验室应提供适宜临床使用的申请单,内容应包括不同mNGS测序策略及对应的适应证。
(三)报告解读原则
目前病原微生物的确认依然遵循Koch法则,即:
(1)该微生物存在于同类疾病患者中,健康个体则无此微生物。
(2)该微生物必须能够被分离、培养、纯化。
(3)该微生物接种于易感动物可引起相同疾病,并可从被接种的动物体内分离到此微生物。
(4)该微生物可引起每一个个体发病[25]。
但是,作为一种临床检验方法,利用mNGS确认的感染病例并不能够完全满足传统Koch法则,作为该法则的补充,mNGS具有如下特征。
1.mNGS结果分析:
理论上,凡存在于标本中的微生物均可检出,但因不同类型微生物基因组长度和测序平台等差异,导致无法针对所有微生物建立统一的阴阳性判读标准[7,26,27,28]。
实验室应根据预期用途、标本类型、检测目标和技术特点,建立并验证阳性阈值及判读标准。
原则上mNGS的临床意义同核酸检测。
另外,决定一个序列是否来自于某种微生物,很大程度上取决于用于比较的参考微生物序列数据库,如果数据库中未包括该物种以及与其进化距离较近物种的基因组序列可能造成结果不准确。
2.mNGS结果确认:
如果检出的微生物符合疾病特征则可能是引起感染的病原微生物,但不能只从序列数多少确认,需考虑序列在基因组上的覆盖度、特异性及保守性[11,14]。
该病原微生物可通过PCR等方法得到验证,如呼吸道标本中的流感病毒、腺病毒及新冠病毒等;粪便标本中的志贺菌、沙门菌及诺如病毒等;CSF中的肠病毒、单纯疱疹病毒及西尼罗河病毒等;血液中的布鲁菌、巴尔通体及人类免疫缺陷病毒等。
如果检出高序列数的某种未命名微生物,应高度警惕新物种的出现。
3.mNGS阳性阈值及判读标准:
报告单中的阳性阈值以百万分子序列数确定。
阳性阈值的确定不依赖某个单一的指标,包括但不限于特定微生物的检出序列数、归一化每百万序列(readspermillion,RPM)的比值、检出物种的基因组覆盖度等。
病毒因极少存活于环境中,因此,少量的特异序列检出即可判为阳性(如少于3条特异序列)[26]。
避免报出与临床不相关的环境菌、共生菌及条件致病菌等。
一般序列数越高病原微生物的可能性越大(数十条特异性序列)。
对于结核分枝杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌等临床关注度高、且较难检测的病原菌可采用独立的判读标准,即检出1条特异序列即可判为阳性[7,28]。
寄生虫基因组因较为复杂,且与人源基因组相似,应在严格确认序列特异性之后再行判读[14]。
如果检出序列为新发物种,则可不受阈值限制,但需给出同源性比对结果。
4.微生物种群致病:
无菌部位脓肿标本可见多种病原微生物共检出现象。
如脑脓肿、颈间隙脓肿、咽旁脓肿、口腔脓肿等,所检出的微生物序列数均可能达到阳性阈值,多数为严格厌氧菌与兼性厌氧菌共生。
这种因微生物种群而致病的现象称为一个种群或一个微生物生态系统引起一种疾病,而非Koch法则的一种病原菌引起一种疾病。
尽管种群致病的理论还需进行深入探讨,但随着深度测序技术的广泛应用,这种现象在临床上将得到更多验证[29]。
5.不可培养或难培养微生物的结果验证:
mNGS针对标本中所有病原微生物核酸序列,不可培养或难培养微生物不能通过传统培养方法再现,且这类病原微生物同样缺乏血清学或抗原检测。
除病毒、螺旋体、立克次体、寄生虫外,这些微生物可通过核酸检测验证,测序同样是诊断的金标准。
6.致病菌、定植菌和污染菌:
当确定条件致病菌为病原菌时应考虑患者免疫状态、基础疾病及标本来源。
若出现大量背景菌或杂菌序列而无主导微生物应首先考虑污染,其次考虑条件致病菌。
如果外科手术或其他有创操作后,无菌部位来源的标本,表现为细菌单一,序列数可能不高,应结合临床考虑医院感染,此时应与背景菌区分,不可一味认为污染。
mNGS不能区分微生物是定植还是感染。
mNGS检测阴性对排除感染有意义,但也应结合临床表现作出正确的诊断[14,28]。
7.高度传染性微生物:
针对具有高度传染性的特殊病原微生物,实验室应根据相关卫生行政部门的规定制定特殊报告程序,标本上传疾病预防控制中心(CenterforDiseaseControlandPrevention,CDC),如当出现像疑似O1群或O139群霍乱弧菌、鼠疫耶尔森菌、埃博拉病毒或新型病原微生物等,应尽快采用其他方法验证,如PCR、血清学等,如果支持测序结果应迅速反馈临床和CDC系统。
8.提高测序深度:
mNGS常规数据量对耐药和毒力基因检测有局限性[8,30],因其得到的微生物序列数不足样本总序列的5%,特异性序列覆盖度不到微生物基因组1%,在这种情况下进行耐药基因、毒力岛基因、转录组及代谢通路分析几乎不可能。
目前,有以下几种做法可提高测序深度:
(1)在常规测序深度下已明确了病原微生物,再提高测序数据量至可覆盖该物种基因组80%,但花费巨大不适合普及。
(2)在宏基因组基础上叠加固定的若干种耐药基因进行靶向测序。
(3)研发降低人源核酸比例的创新方法,获得更多微生物测序数据量[4,7,31]。
建议2:
mNGS作为一种新型检测方法,其临床意义仍未超出核酸检测范畴,它补充了传统病原微生物确认的Koch法则。
mNGS可检测难培养、罕见或新发病原微生物,可同时给出多种病原微生物信息,因此,在一份无菌部位来源的临床标本(尤其脓肿)中检出微生物种群(包括不同类别或同类不同种属)不应轻易视为污染。
如果这些微生物的存在符合临床诊断,应给予抗菌药物全覆盖,这恰好体现了该技术对全面认识病原微生物的优越性。
mNGS常规数据量对耐药和毒力基因检测有局限性,如需耐药和致病信息需提高测序数据量。
建议3:
如果检出的病原微生物符合临床预期,应确认序列结果的准确性和特异性。
为提高结果的特异性,降低错误率,即使病原微生物也应建立阳性阈值。
阳性阈值建立在微生物特异序列数及其在基因组覆盖度上。
临床医生在解读条件致病菌时,应排除污染和背景微生物,考虑患者免疫状态及与临床表现的符合性。
mNGS结果不能作为临床决策的唯一依据,结果阴性也需结合临床排除感染。
二、mNGS检测病原微生物的实验室要求
mNGS是NGS技术的一种,多数实验室采用边合成边测序方法[32]。
该方法使单个DNA分子扩增成大量相同的DNA,然后同步复制,以此增强荧光信号强度,从而读出DNA序列。
因此,mNGS具有通量高、读长短、流程复杂、操作环节多、对实验环境及人员要求高的特点。
因此,对实验室设施要求高,需要严格遵守临床基因扩增检验实验室管理暂行办法的相关规定。
(一)实验室分区及人员要求
1.基本原则:
即各区独立、注意风向、因地制宜、方便工作,以达到工作有序、互不干扰、防止污染、报告及时[16]。
mNGS检测分“干、湿实验”,“湿实验”指从样本处理到测序数据产生的整个测序过程,需要在标准的测序分区实验室完成。
一般“测试分区实验室”分试剂准备区、标本处理与核酸提取区、文库构建区及测序区。
“干实验”指测序数据的生物信息学分析。
2.单向工作流程:
若实验室设有缓冲间,缓冲间统一为正压或负压。
若未设缓冲间,从试剂准备区到测序区压力依次递减。
为避免相互干扰,DNA和RNA操作(核酸提取)应分开。
如在同一实验室应分两个区域,主要仪器耗材包括生物安全柜、核酸提取仪、移液枪、离心机、试剂及耗材等不可混用。
如使用琼脂糖凝胶电泳检查核酸及文库质量,则需有单独的电泳区。
靶向测序PCR应在单独的扩增区进行[33]。
3.污染防控:
应定期进行环境评估,为了监控污染需制定试剂、仪器和实验室物表定期消毒的标准作业程序(standardoperationprocedure,SOP)。
还应对无模板参考品或阳性对照中可能出现的污染物进行连续跟踪,并使用保守的阈值标准(见第一章第三部分报告解读原则3),最大程度减少假阳性结果产生[9]。
4.实验室人员能力:
实验室人员应参加相关培训,并获得国家要求的相应资质[27,34]。
检验人员应具备mNGS项目制定和质量控制能力。
报告签发人员应具备临床医学、微生物学和分子生物学背景,掌握相关临床诊疗指南。
疑难报告的签发及结果解释需咨询相关领域专家。
开展mNGS实验室自建检测项目(laboratory-developedtests,LDT)的实验室同时还应具备生物信息学分析的专业人员,生物信息学分析人员需熟练掌握mNGS检测原理及生物信息软件,具备数据信息维护和管理、开发新算法及更新数据库的能力。
建议4:
微生物检测非靶向mNGS实验室至少应包括试剂准备区、样本制备区、文库制备区及测序区。
实验室工作流程应为单向。
若实验室设有缓冲间,缓冲间统一为正压或负压。
若未设缓冲间,压力从试剂准备区到测序区依次递减。
DNA和RNA核酸提取分区域进行。
若开展靶向扩增NGS测序,应额外增加扩增区及电泳区。
若同时开展遗传及肿瘤NGS,核酸提取及建库过程不宜与之混用。
报告签发人员应具备临床医学、病原微生物或分子生物学背景,罕见病原微生物结果解释可咨询相关领域专家。
若配备有生物信息学分析人员,需掌握mNGS微生物检测软件应用,具备数据信息维护和管理、开发新算法及更新数据库的能力。
(二)检测平台
1.建立标本前处理及核酸提取方法:
标本预处理方法和核酸提取技术在使用前需经过验证。
2.测序平台的选择:
包括仪器设备的选择、测序平台质量的评价及主流测序平台类型3个方面。
配备开展高通量测序检测项目所需的所有仪器设备:
优先选择国家药品监督管理局(NationalMedicalProductsAdministration,NMPA)批准的测序平台和配套试剂。
测序平台应达到临床预期:
除开展满足临床需求的项目外,测序通量、序列的准确率、支持读长、仪器性能验证、内部质控、测序周期及批量检测能力等也是评价测序平台质量的重要指标。
主流测序平台:
目前,mNGS主流测序方法有边合成边测序、DNA纳米球测序及半导体测序[3,32]。
实验室根据需要选择适宜的检测平台,使用模拟样本或临床已知微生物样本验证测序全流程。
表2列出了不同类型测序平台的技术特点及环境要求。
3.自动化测序平台:
mNGS微生物检测的灵敏度与标本背景有关,如组织标本中含有大量人源基因组,导致微生物序列数占比减少,通过高效自动化测序平台,增加测序深度可提高检测灵敏度。
自动化过程降低人工操作、减低外源污染,实验室分区简化。
已有文献报道实现了血液、CSF、尿液等标本,从文库构建到报告发放全自动化过程[26]。
自动化平台应包括标本前处理、核酸提取、文库构建、高通量测序、生物信息分析和报告发送。
(三)生物信息平台
生物信息学分析(也称“干实验”)是mNGS检测中的重要部分,是对测序产生的原始数据进行处理和分析,包括但不限于数据质控、人源序列比对过滤、微生物物种检测等过程[35,36,37]。
目前尚无统一的标准化数据分析程序及软件[3]。
数据分析流程由多种分析软件配套完成,包括数据质控软件(如Fastp、Trimmomatic、FastQC等)、比对软件(如Bowtie2、BWA、MAQ、SOAP2、Blast等)、物种分析软件(如SURPI、Taxonomer、MegaBLAST等)[26,38,39]。
人源基因组和微生物基因组检测数据库有美国国家生物技术信息中心、美国病原体系统资源整合中心[40]、真核生物病原体数据库[41]及病毒病原数据分析资源库[42]等,在构建物种比对数据库时可予以选择,还有耐药基因分析可考虑抗性基因数据库[43,44,45],毒力基因分析可使用毒力基因分析数据库[46,47]等。
随着mNGS产品的体外诊断化发展,结合人工智能技术的自动化的数据分析系统已经能够提供给临床实验室。
建议5:
实验室构建mNGS技术平台以拟开展的检测项目及科研工作为依据,充分论证不同检测平台的适用性,包括生物信息平台。
技术平台的建设应包含标本处理、核酸提取、文库构建(DNA和RNA文库)、高通量测序、核酸扩增、产物分析、数据分析等全流程。
采用模拟样本或临床已知病原体样本对所有技术环节进行验证,包括检测灵敏性、测序通量、序列质量、读取准确率、支持读长、仪器性能验证、内部质控、测序周期及生物学信息分析能力。
比对数据库应满足各类微生物检测需求。
三、mNGS微生物检测方法的建立
(一)标本前处理
标本液化、浓缩及去除宿主核酸等前处理方法和设备使用应标准化。
所有标本应具有唯一标识,防止在信息录入和标本分拣过程中交叉污染。
根据申请要求提前准备被检测微生物所需的文库资料及生物信息分析软件。
建立临床标本的前处理程序,包括复杂标本、微量标本和组织标本的前处理程序,针对真菌和/或分枝杆菌等特殊微生物的破壁处理程序。
建立RNA病毒、微生物游离核酸测序的前处理方法。
建立组织标本研磨方法,具体方法见表3。
(二)核酸提取
1.使用经性能确认的核酸提取试剂:
临床标本中存在不同类型的病原微生物,核酸提取方法的可重复性和提取效率对保证核酸的完整性及纯度至关重要。
实验室应根据临床标本类型和微生物种类建立针对性的标准化提取程序。
建议使用经性能验证的商品化提取试剂及设备。
2.核酸质量验证:
(1)高质量的DNAA260/A280应在1.7~1.9,A260/A230应>2,可用1%琼脂糖凝胶电泳验证DNA质量(无杂带、无拖尾、背景无蛋白污染)。
(2)DNA完整性(如Agilent2100Bioanalyzer)检测,如果大部分片段在200nt(血浆游离DNA除外,140nt)以下说明DNA降解严重,需重提。
(3)高质量的RNAA260/A280应在1.8~2.0,A260/A230应>2。
(4)微量的核酸采用Qubit荧光染料法进行定量测定[15]。
3.核酸含量极低样本的处理:
如CSF、房水等,应在标本中加50μlATL(DX)研磨珠,低频震荡10min,离心后取150μl。
加入150μl裂解液和8μl蛋白酶K,涡旋震荡混匀30s,56℃恒温震荡15min(若无恒温震荡仪,可用金属浴代替,期间每3min混匀1次);取裂解后的样本300μl,加入磁珠240μl,震荡混匀,室温静置5min,上清提核酸。
按照商品化的操作说明进行。
4.去除人源DNA的方法:
多数临床标本存在大量宿主细胞和宿主游离核酸,微生物核酸丰度相对较低。
因此,在核酸提取环节中可考虑建立高效去宿主DNA方法,提高mNGS微生物检测的灵敏度[4,48],去除人源核酸的方法选择需要结合临床检测目的,举例如下。
去污剂处理:
因人源细胞的细胞膜较微生物外壁脆弱,在核酸提取前用温和去污剂(如皂苷)裂解宿主细胞释放DNA,再用脱氧核糖核酸酶Ⅰ降解人源DNA,通常可使微生物富集效率提高1000倍[49]。
低渗溶液破坏宿主细胞:
使用细胞膜不透性的叠氮碘化丙锭结合暴露在溶液中的宿主DNA[48]。
抗甲基化DNA磁珠:
因人源DNA甲基化程度高,大多数微生物基因组中缺乏甲基化DNA,使用抗甲基化DNA磁珠可有效去除人源DNA,可实现3~5倍富集[26]。
使用CRISPR-Cas9(基因编辑技术)剥离目标序列:
此法对构建RNA文库较为有利,可提高非编码rRNA序列含量,但对DNA文库构建意义不大,不推荐花费更大财力去除全部人源DNA。
5.qPCR预估人源核酸的去除效率:
去除宿主DNA后,对宿主及微生物常用的标志基因,如β肌动蛋白基因、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因和16SrRNA基因等,进行实时荧光定量PCR(qu
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