维生素B2片剂中核黄素含量的荧光光谱检测.docx
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维生素B2片剂中核黄素含量的荧光光谱检测
摘要
核黄素,常称为维生素B2微溶于水,具有较强的生物活性,与人体的代谢活动密切相关。
当其缺乏时,人体器官会发生一系列的病变导致疾病,如口角炎、唇炎、舌炎、眼结膜炎和阴囊炎等。
现在对药品含量的检测方法有很多,荧光分析法一直广泛应用于药品分析,具有快速、准确、直观等优点,并且可以同时检测多种药物含量。
本文通过荧光发射光谱法检测维生素B2类药品中核黄素的含量。
在做好实验的前期工作后,配制核黄素标准液和维生素B2药品样液并检测其荧光强度。
研究核黄素的激发谱和发射谱,确定最佳激励波长468nm和最佳荧光波长523nm。
由得到的数据绘制核黄素标准液浓度与荧光强度关系的标准曲线,根据检测的维生素B2药品样液的荧光强度值,代入核黄素标准液曲线表达式得到样液核黄素浓度,进而计算出药品中核黄素的含量。
实验结果令人满意,药品核黄素实际含量为5.3753mg/片,稍高于标示值。
该方法具有成本低,检测简单快速、灵敏度高等特点。
关键词:
药物检测;核黄素;荧光分析;激发波长;发射波长;标准曲线
ABSTRACT
Riboflavin,whichiswidelyknownasvitaminB2,isslightlysolubleinwater.Itiscloselyrelatedtothebody'smetabolicactivitiesandpossessstrongbiologicalactivity.Withthelackofit,thehumanorganwillundergoaseriesofleisions,leadingtodiseasessuchasangularstomatitis,cheilitis,glossitis,conjunctivitisandoscheitis.etc.
Nowtherearemanymethodsforthedetectionofdugs,Fluorescenceanalysishasbeenwidelyusedindruganalysis,withfast,accuracy,visualizationandotheradvantages,anditcansimultaneouslydetectavarietyofpharmaceuticalcomponents.InthispaperthejodwasdonethroughthefliorescencespectrometricanalysisofvitaminB2drugsinthedetectionofriboflavincontent.Afterpreparingthepreliminarywork,thenextstepispreparationofRiboflavinstandardsolutionandsamplesolution,andfinishthefluorescenceintensitydetectionofthem.Throughtheexperimentaldetectionoffluorescencespectra,theresultsshowtheoptimalemissionwavelengthof523nmandthebestexcitationwavelengthof468nm.ThenusingtestdatatodrawacurveaboutfluorescenceintensitytoRiboflavinsolutionconcenteation.Accordingtothedataofsample,Riboflavinsolutionconenteationofsamplecanbedeterminedthroughsubstitutingthedataintothecurvilinearexpression.,andRiboflavincontentintabletsisobtained.Theresultsweresatisfactory,theactualcontentofdrugriboflavinis5.3753mg/piece.,,whichisslightlyhigherthanindicatedvalueof5.0mg/piece.Themethodhasthecharacteristicsoflowcost,simpleandrapiddetectionandhighsensitivity.etc.
Keywords:
drugdetection;riboflavin;fluorescenceanalysis;excitationwavelength;emissionwavelength;standardcurve
1绪论
1.1课题研究背景
药品是指用于预防、治疗、诊断人的疾病,有目的地调节人的生理机能并规定有适应症或者功能主治、用法和用量的物质,包括中药材、中药饮片、中成药、化学原料药及其制剂、抗生素、生化药品、放射性药品、血清、疫苗、血液制品和诊断药品等。
药物作用是指药物与机体相互作用产生的反应,即药物接触或进入机体后,会促进体表与内部环境的生理化功能发生变化,或抑制病原体入侵,提高机体抗病能力,从而达到防治疾病效果。
然而药物作用具有两重性,既能防病、治病,同时也会导致不良反应或是对人体器官有损害,不少药物的使用有着严格的规定,针对不同人群。
加上,有一些企业图利贩制假药,危害人民的生命安全。
因而药物含量的检测分析有很重要的意义。
本课题所研究的维生素B2类药品,摄取过多可能会引起瘙痒、麻痹、刺痛、灼热感等,也会降低某些正在服用药物的疗效。
1.2维生素
1.2.1维生素介绍
维生素(俗称维他命)是人和动物从食物中获取的在物质代谢中起重要调节作用的一类微量有机化合物。
由于这类物质在体内不能合成或是合成量不足,人和动物需要从外界摄取,每日需求量少。
各类维生素的化学结构和性质不相同,却有着一些共同点:
1.在食物中均以维生素原形式存在;
2.不属于机体组织和细胞的组成成分,不产生能量,主要作用是调节机体代谢;
3.多数维生素,机体无法合成或是合成量少,难以满足机体需要,必须经常从食物中摄取;
4.人对维生素需求量小,日需求量在毫克或微克数量级,但不能缺乏,否则会引起相应维生素缺乏症,损害人体健康;
迄今为止,人们已经发现了数十种维生素,其中有13种为人体所必需,被称为必需维生素。
必需维生素分成两大类:
4种脂溶性维生素(维生素A、维生素D、维生素E、维生素K)和9种水溶性维生素(8种维生素B、维生素C)。
必需维生素需要满足的特点:
外源性、微量性、调节性、以及特异性。
外源性:
人体自身无法合成,必需从食物中摄取。
微量性:
在人体中只需要极小的量便可以起到巨大作用。
调节性:
必需能够调节人体新城代谢或控制能量转变。
特异性:
一旦缺乏特定维生素后会引发相应病症。
1.2.2维生素检测意义和方法
维生素常被作为食品营养强化的添加剂,广泛存在于谷类、果蔬、肉禽和蛋类等加工食品中。
市场上,食品添加剂像药品一样有明确剂量标注,这类添加剂的用量与食品安全有着紧密联系。
EuropeanDirective2002/46EC制定了一系列关于食品添加剂标识及添加含量的法规,我国国家标准GB5413-2010对婴幼儿配方食品与维生素含量也有明确规定。
食品与药品中维生素的含量与人的身体健康关系密切,特别是婴儿和正在发育中的青少年以及身体机能大幅度下降的老年人。
因此维生素检测对食品、饲料、医药领域都有很重要的意义。
维生素检测的方法有很多。
传统的鉴定方法大都步骤繁琐、检测周期长、操作费时、易受干扰、灵敏度不高。
新型的方法具有准确、方便、快速等特点,然而实验设备价格不菲。
1.传统经典方法—微生物法
微生物法依据维生素是细菌生长所必需的原理,用细菌繁殖程度或代谢产物定量出维生素含量,适用于检测多种衍生物的总和
2.仪器方法—HPLC液相色谱法及LC-MS-MS液质联用法
HPLC高效液相色谱法根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离,分离过程是一个分配平衡过程。
该方法具有灵敏度高、特异性强、分离速度快、效果好等特点,可一次性分析多种水溶性维生素。
LC-MS-MS液质联用法基于质谱分析,先将物质离子化,按离子的质荷比分离,随后测量各离子谱峰强度,从而实现分析目的。
不纯的样品要用色谱和质谱联用仪,通过色谱分离,质谱作色谱的检测器。
3.其他方法
除了微生物法及HPLC法和LC-MS-MS液质联用法外,还有灵敏度和特异性很高的ELISA酶联免疫试剂盒及酶法检测试剂盒。
酶法试剂盒检测为MEBAKCommision检测果汁等食品中维生素C的标准方法。
而德国拜伐生产的ELISA酶联免疫试剂盒能快速、方便、准确定量检测食品中维生素B12、生物素、叶酸等成分,节省实验时间和成本。
1.3荧光
1.3.1荧光介绍
荧光(“萤光”),指的一种光致发光的冷发光现现象。
荧光是物质吸收光照或其他电磁辐射后发出的光。
多数情况下,发出光比吸收光波长长,能量低。
1575年西班牙内科医生和植物学家N.Monardes在阳光下观察菲律宾紫檀木切片的黄色水溶液,其呈现出了极为可爱的天蓝色。
17世纪,Boyle和Newton等一些著名科学家也观察到了荧光现象。
17世纪到18世纪一些荧光材料和溶液相继被发现,但却没有强有力的理论解释这类荧光现象。
1852年,Stokes在研究奎宁和叶绿素的荧光时,通过分光计意外发现荧光的波长比入射光稍长,才意识到这类荧光现象并不是光的漫射引起的,而是物质在吸收光能后会发射出其他波长的光,建立起荧光是光发射的概念。
他从发荧光的矿石—“萤石”获得灵感,提出“荧光”这一术语。
1867年,Coppelsroder用铝—桑色素配合物的荧光对铝进行测定,这是历史上首次荧光分析工作。
1880年,Liebeman提出了最初的关于荧光与化学结构关系的经验法则。
直至19世纪末,人们已经发现了包括荧光素、曙红、多环芳烃等600种以上的荧光化合物。
到了20世纪,荧光现象有了更多发现。
1905年Wood发现了共振荧光现象;1914年Frank和Hertz利用电子冲击发光进行定量研究;1922年Frank和Cario发现了增感应光;1924年Wawillow做了荧光产率的绝对测定;1926年Gaviola做了荧光寿命的直接测定。
1928年Jette和West研制了第一台光电荧光计。
Dutto和Bailey于1943年提出了荧光光谱手工校正步骤。
1948年Studer设计出第一台自动光谱校正装置。
1955年制成第一台荧光光度计。
60年代开始了真实荧光光谱、荧光效率和荧光寿命的测量。
70年代引进了计算机技术、电视技术、激光技术、显微镜技术。
80年代,荧光分光光度计大多配有微型计算机-数据处理器,能对荧光光度值进行积分、微分、除法、减法和平均等运算。
1.3.2荧光机理
物质经光照射吸收光能后,其构成分子的原子核周围的一些电子发生了轨道跃迁,即从基态跃迁到能量较高的激发态,处于激发态的分子不稳定,会通过几种方式向外释放能量。
处于激发态的分子间相互碰撞或与其它溶剂分子碰撞等去活化的过程而消耗能量,回到第一激发态的最低振动能级,这种情况称为无辐射跃迁,它不会发光。
当电子由激发态的最低振动能级跃迁回基态的不同振动能级时并产生了光子,这一过程称为荧光。
一般在室温下物质分子大部分处于基态的最低振动能级。
当电子吸收一定频率的电磁辐射发生能级跃迁时,可上升至不同激发态的各振动能级,其中大部分分子上升至第一激发单重态(S1),这一过程称为激发。
处于激发态的分子不稳定,它可以通过不同的途径回到基态,这一过程称为去活化。
去活化过程有以下几种:
(1)振动驰豫溶液中分子间碰撞机会很多,通过碰撞溶质分子将过剩的能量转移给溶剂分子,通过非辐射跃迁而降至同一能态的最低振动能级,这一过程称为振动驰豫。
(2)内部转换同一多重态的不同电子能级间可能发生内部转换。
S2到S1或T2到T1。
条件:
当S2较低振动能级与S1较高振动能级的能量相当,且发生重叠时分子才有可能S2到S1或T2到T1。
(3)荧光发射处于第一激发的最低振动能级的分子,跃迁回基态的各振动能级,这一过程称为荧光发射。
(4)体系间跨越跃迁分子从激发单重态转至能量较低的激发三重态的过程,称体系间跨越跃迁。
三重态:
电子自旋方向相同
单重态:
电子自旋方向相反
这些分子从第一激发三重态的最低振动能级下降至第一基态的各振动能级,所发出的辐射即为磷光。
传递途径
图1-1处于激发态的荧光分子能量变化途径
图1-2荧光分子能量转换图
1.3.3荧光光谱
荧光光谱包括激发谱和发射谱。
激发谱是对应荧光物质用不同波长的光激发作用下测得的某一波长处荧光强度的变化情况,也是不同波长激发光的相对效率;发射谱对应某一特定波长的光激发作用下荧光强度位于不同波长处的分布情况,也是荧光中不同波长处光的相对强度。
激发谱与发射谱呈正相关。
由于激发态与基态有着相似的振动能级分布,并且从基态振动能级跃迁到第一电子激发态各振动能级的几率与从第一电子激发态的最低振动能级回迁到基态各振动能级的几率相近,因此激发谱与发射谱图像轮廓上大致成镜像关系。
1.3.4荧光衰减
荧光寿命:
去掉激发光后,分子荧光强度衰减为激发时最大强度的1/e所需消耗的时间,惯常用τ来表示。
荧光强度的衰减符合如下指数衰减的规律;
(1-1)
其中It、I0分别为激发态时t=0和t时刻的荧光强度,k为衰减系数,荧光寿命常在10-10~10-8s。
图1-3荧光强度衰减曲线
1.3.5荧光量子产率
荧光量子产率是物质荧光特性最基本的参数之一,代表发射荧光的本领。
有几种表示方法,即荧光发射量子数与被物质吸收量子数之比,或者荧光发射强度与被吸收的光强之比,或者荧光发射速率与吸收速率之比,常用
表示,即:
(1-2)
若分子跃迁的整个过程中没有振动弛豫、内转换、系间窜越等的非辐射跃迁,则荧光量子产率为1,但实际上测得的数据在0~1之间。
1.3.6荧光与分子结构
通常情况下,长共轭分子具有较强吸收紫光的能力,因具有的较强紫外线吸收带(K带),具有刚性平面结构的分子有着较高的荧光效率,建立在共轭体系上的取代基也对荧光光谱和荧光强度具有较大影响。
1.长共轭结构
共轭结构是指两个以上的双键(或双键)以单键相联结。
高中课本曾介绍过单双键(或三键)交替联结方式。
这种结构能使得电子活动范围增大(离域效应)。
绝大多数的荧光物质都含有芳香环或杂环结构,因为这种结构有长共轭的π→π*跃迁。
π电子共轭程度越大,荧光效率越高,荧光强度也越大,荧光波长也长移。
除芳香环和杂环结构,含有长共轭双键的分子也可能产生荧光,但这类化合物数目并不多。
2.分子刚性
分子构型不会或很难发生变化的分子称作刚性分子,通常含有双键、三键、或环状结构。
刚性分子不存在化学键振动。
然而刚性分子只是理想模型,实际上的分子都不是完全刚性的,部分结构可以自由转动,分子会呈现不一样的形状。
在长共轭分子中,分子具有越强的刚性,其荧光效率也越高,发射荧光波长也更长。
刚性平面结构可以有效减少分子的振动,减少分子与溶剂或是溶质分子之间的相互作用,这样便减少了能量外转换的损失。
同时,平面结构使得分子具有较大的光接触面积,增大了摩尔吸光系数,可以增强荧光强度。
像萘与维生素A都具有5个共轭π键,然而前者为平面刚性结构,后者非刚性,相同条件下前者的荧光强度是后者的数倍。
3.取代基
取代基对荧光体的荧光特性以及荧光强度都具有很大的影响,特别是对于芳香族化合物,表现出的效果很明显。
依据影响规律的不同将这些取代基分为三类:
第一类为给电子取代基,能增加π电子共轭程度,加强荧光,如—OH、—NH2、—OCH3、—NHR、—NR2、—CN等;第二类为吸电子取代基,减弱π电子共轭程度,减弱荧光,如—COOH、—CHO、—NO2、—SH、—Cl、—Br、—NHCOCH3等;第三类取代基对π电子共轭体系作用较小,对荧光影响小,如—R、—SO3H、—NH3+等。
1.3.7影响荧光因素
PH影响:
可离子化的荧光化合物受PH影响很大。
如未解离的苯酚和苯胺分子能产生荧光,而两者的离子却不能。
苯酚在PH=1的溶液里荧光最强,但在PH=13的溶液中却无荧光;苯胺在PH值7到12的溶液中有荧光,在PH<2或PH>13的溶液中无荧光。
温度影响:
一般情况下荧光物质溶液的荧光强度和荧光效率与溶液温度呈负相关。
溶液温度上升时,介质粘度减小,荧光物质与分子碰撞频率加剧,去活化几率加大,荧光强度降低;溶液温度下降时各情况相反。
浓度影响:
样品浓度较高时,荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子间容易发生分子相互作用,导致溶液的荧光强度降低,荧光强度与浓度不再呈现出线性关系,这种现象称为荧光猝灭效应。
再则,样品浓度过大会使得荧光在样品池中分布不均匀,以及发出的荧光在射出样品池前又被未激发的荧光物质吸收,这种现象称为内滤效应,溶液浓度越大效应就会越明显。
溶剂极性影响:
同一荧光体在不同溶剂中的荧光光谱的位置和强度可能会有着显著的不同。
溶液中溶质和溶剂分子间存在着静电相互作用,而溶质分子基态和激发态电子分布不同,具有不同的偶极距、极化率,使得这两种状态的溶质分子与溶剂分子的相互作用程度有差距,影响荧光的光谱和强度。
许多荧光体,尤其是有极性取代基的芳香化合物,荧光光谱易受溶剂影响。
溶剂影响可分为一般溶剂效应和特殊溶剂效应。
一般溶剂影响指的是溶剂的折射率和介电常数的影响,常用Lippert方程式解释:
(1-3)
其中
与
为荧光分子的吸收波数和发射波数,两者差代表吸收光和发射光能量差别;ε为溶剂介电常数;h为普朗克常量;c为光速;a为溶剂中荧光分子所占空穴半径,
与μ为荧光分子处于基态与激发态的偶极距,将
称为定向极化率(orientationlarizability)∆f。
许多共轭芳香族化合物受到激发时发生了π→π*跃迁,其荧光光谱受溶剂影响较大。
这些分子受激发时,其激发态比基态极性更大,随着溶剂极性增大,对激发态比对基态产生更大的稳定作用,这使得荧光光谱随溶剂极性增大(定向化极率∆f数值增大)向着长波长方向移动
特殊溶剂效应是指氢键形成和配合作用。
荧光物质与溶剂分子或其他物质间的氢键作用有两种情况:
一种为荧光物质基态分子与溶剂分子或其他溶质分子产生氢键配合物,荧光物质的吸收光谱和荧光光谱都受生成的氢键配合物影响;另一种则是荧光物质激发态分子与溶剂分子或其他溶质分子产生氢键配合物,只有荧光光谱受氢键配合物影响。
除荧光物质分子与溶剂分子间的碰撞可引起猝灭外,溶液中其他成分,若含有顺磁性物质,将使得猝灭效应加剧。
1.3.8荧光分析法及其现状
荧光分析法:
某些物质经紫外光照射后会产生一系列波长的荧光,这些波长有相对应的分子,通过检测某分子对应的荧光性质及强度,可以对该物质进行定性和定量的分析。
荧光分析法有三大特点:
高灵敏度、强选择性、使用方便,常用于食品与药品的检测。
该方法一般用来检测有机物,但由于一些无机元素可与有机物发生特异反应产生的化合物也具备荧光检测的条件,因而可以间接测量这些无机元素的含量。
自斯托克斯提出“荧光”概念以来,几百年间,人们在荧光分析这块有了很大的发展,从常规荧光分析法到新型荧光分析法,再到与其他技术相结合的分析方法。
1.常规荧光分析法
(1)直接荧光法:
直接测定药物本身荧光成分确定含量。
该方法快速、准确、简便。
(2)荧光衍生物法:
用特定试剂与荧光较弱或不具荧光的物质结合生成具有明显荧光的衍生物。
该方法重现性好、选择性好、高灵敏度。
(3)化学引导荧光法:
将不能产生荧光的化合物通过化学方法(氧化还原、水解、缩合反应等)转换成荧光化合物,然后再检测。
2.新型荧光分析法
(1)光猝灭分析法:
一些物质有着能使荧光物质发生荧光熄灭的性质,利用这种性质,可以间接测定其含量。
(2)胶束增敏荧光法:
表面活性剂(如十二烷基磺酸钠)的胶束溶液有着能让荧光物质增溶、增敏及增稳的特点,能将荧光较弱、不稳定以及溶解度小的物质溶解在表面活性剂的胶束溶液中测定荧光,这样可以提高灵敏度和稳定性。
(3)同步荧光分析法:
在多组分混合物中能同时对多种分子进行检测,有着谱图简化、选择性高、光散射干扰少等特点。
目前该方法常用恒波长法和恒能量法。
(4)导数荧光分析法:
借助数学思想将光谱微分求导,使得峰变窄、谱带变锐,进而提高分辨率,还有利于抑制背景信号干扰。
(5)三维荧光光谱分析法:
获得激发与发射波长以及其他变量同时变化时荧光强度的信息,将荧光强度表示为激发(发射)波长或是波长—时间以及波长—相角等含有两个变量的函数。
通过研究样品的三维荧光光谱图,分析样品的荧光特征与干扰或是无效荧光的特点之间的异同。
(6)荧光偏振(免疫)分析法:
荧光物质经过单一平面的蓝偏振光照射后进入激发态,回复至基态时会发出单一平面的偏振荧光,该偏振荧光强度与荧光分子大小呈正相关,与其受激发的转速呈负相关。
此种方法常用于药物、激素检测。
(7)荧光探针技术:
利用探针分子与识别客体之间产生特异性反应导致反应前后荧光信号的区别,从而对目标分子进行分析。
该方法灵敏高、特异性强,精确性也很有保证。
(8)时间分辨荧光免疫分析法:
;依据镧元素螯合物发光特点,用镧系元素标记目标,利用时间分辨技术测量荧光,检测波长和时间两个参数,经过信号分辨消除杂质与背景荧光信号以及排除非特异荧光干扰,提高了信噪比,可分辨测定混合物中光谱重叠、荧光寿命有差异的组分。
(9)动力学荧光分析法:
依据化学反应速率与反应物浓度以及一定情况下还与催化剂、活化剂、阻化剂、解阻剂浓度相关。
因此可以通过对反应速率的测量推出确定目标物质含量。
(10)化学计量方法:
运用化学、数学、计算机科学等其他学科理论充分分析以及挖缺获得的测量数据,优化化学测量过程。
该方法可解决荧光信号复杂、易受干扰、散射、信号重叠等难题,可与三维荧光法、动力学荧光分析法以及同步荧光法联用。
3.荧光分析与其他技术联用
(1)薄层色谱—荧光联用:
先通过薄层色谱法将被测组分从试品中分离,再通过荧光分析方法对组分进行分析。
该方法适用于作微量分析。
如文欣欣等人利用这种方法分析黄连及香连丸中小檗碱含量。
(2)凝胶色谱—荧光联用:
先用凝胶色谱法将被测组分从试品中分离,再利用荧光检测方法对组分进行分析。
如王文东等通过这种联用技术对水中单核铝以及无机单核铝等各态铝进行了分析。
(3)高效液相色谱—荧光联用(HPLC):
先通过高效液相色谱法对目标进行分离,再用荧光分析方法进行检测。
如张烁等用这种联用技术检测课维生素保健品中VB2含量。
(4)流动注射—荧光检测技术:
以适当液体(可以是反应试剂或水)作连续流动的载液,将一定体积的待测样品注入其中,此间样品会与载液混合、反应,生成物流经检测器得到记录分析。
如马红燕等提出的测定依诺沙星含量的检测方法。
1.4章节安排
本文属于实验性论文,利用荧光分析法检测市面维生素B2药物中核黄素含量。
第一章介绍课题背景、维生素相关知识以及荧光分析基础
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