PCR正式标准操作文件SOP.docx
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PCR正式标准操作文件SOP.docx
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PCR正式标准操作文件SOP
浙江省
XX医院
临床基因扩增检验实验室
管理程序和标准操作程序(SOP)
起草人:
XXX
批准人:
XXX
起草日期:
2003年2月10号
1.目录---------------------------------------------------1
2.C001手套使用及左右手分开原则------------------------3
2.C002实验耗材的质检方法--------------------------------5
3.C003试剂的质检操作程序--------------------------------6
4.C004实验室常用溶液的配制标准程序----------------------7
5.C005标本的验收和保存标准程序--------------------------9
6.C006样品编号操作程序---------------------------------12
7.C007实验台摆放规范-----------------------------------15
8.C008样品处理操作程序---------------------------------17
9.C009核酸扩增荧光检测实验和结果分析标准操作程序-------19
10.C010实验有效性判断----------------------------------23
11.C011实验室室内质控标准操作程序----------------------25
12.C012实验室化学试剂及废弃物处理,生物防护措施--------30
13.I001LightCycler的使用、维护和校准操作程序-----------33
14.I002加样器使用、维护和校准的标准操作程序-------------37
15.I003离心机的使用、维护和校准操作程序----------------42
16.I004超净工作台使用和维护的标准操作程序--------------45
17.I005恒温水浴箱使用和维护的标准操作程序---------------46
18.I006旋涡振荡器使用和维护的标准操作程序--------------48
19.I007冰箱使用和维护的标准操作程序--------------------49
20.I008仪器故障时的标记、放置的标准操作程序------------50
21.I009检验结果报告标准操作程序------------------------51
22.I010实验室清洁标准操作程序--------------------------53
23.M001核酸扩增荧光检测实验室规章制度-------------------54
24.M002内务制度----------------------------------------57
25.M003实验室人员的培训程序----------------------------60
26.M004实验人员行为规范--------------------------------61
27.M005抱怨处理----------------------------------------63
28.M006记录管理文件------------------------------------65
XX医院
临床基因扩增检测实验室
手套使用
及左右手分开原则
编号:
C001
第一版
第1页共2页
1目的
核酸扩增荧光检测实验室中,实验人员常要接触各种传染性标本(如乙肝病毒、结核杆菌等),作为一项最基本的防护措施,实验过程中必须戴手套操作,这是要遵守的原则。
而为了防止污染,实验过程中还要注意左右手分开。
2适用范围
本原则贯穿于核酸扩增检测实验的人员工作全过程。
3操作人
XXX
4原则要求
a)实验过程中要戴一次性手套,手套要保持完整、不破损。
b)接触样本前戴上手套,将化验单和试管/离心管依次编好号后,弃去手套。
c)手套一旦疑有污染,立即更换。
d)做RNA类实验时,实验人员不能为了方便把手伸入手套而用手反复搓揉手套或用口吹胀手套,这样都有可能让手套表面沾染上RNAase,破坏样本RNA。
如接触“脏的”器皿或其它物品后,手套就可能沾染上RNAase,及时更换手套。
e)在实验中应遵循左右手分开原则:
左手用于接触样本,右手用于使用移液器、接触和操作仪器。
f)接触仪器均用右手,严禁用接触过样品的左手触摸任何器材或工作室门把手等。
XX医院
临床基因扩增检测实验室
手套使用
及左右手分开原则
编号:
C001
第一版
第2页共2页
g)使用离心机时,用左手将离心管全部配平,按顺序置于离心机中相应位置,右手操作离心机。
离心完毕后,左手取出离心管。
5本原则的变动程序
本原则的变动,可由任一使用该文件的工作人员提出,报上级负责人决定。
如通过则公布实行。
起草人
批准人
启用日期
XXX
XXX
2003年2月10号
XX医院
临床基因扩增检测实验室
实验耗材的质检
标准操作程序
编号:
C002
第一版
第1页共1页
1目的
保证每批用于临床实验的耗材的质量良好,符合要求。
2适用范围
各种用于临床实验的核酸扩增荧光检测耗材:
1.5ml离心管、0.5ml离心管、毛细扩增管、移液器吸头等。
3操作人
XXX
4操作步骤
4.1由本院的采购中心负责向三证[营业许可证、经营许可证(如为厂家则有生产许可证)、注册证]齐全的公司采购合格的产品。
4.2到达实验室的耗材由实验室人员抽样目测。
4.3抽样原则:
一箱里面抽取10个。
5本SOP的变动程序
本SOP的变动,可由任一使用该文件的工作人员提出,报上级负责人决定。
如通过则公布实行。
起草人
批准人
启用日期
XXX
XXX
2003年2月10号
XX医院
临床基因扩增检测实验室
试剂的质检
标准操作程序
编号:
C003
第一版
第1页共2页
1目的
保证每批用于临床实验的试剂的质量良好,符合。
2适用范围
各种用于临床实验的核酸扩增荧光检测试剂(现仅包括HBV、HCV、TB、CT试剂盒)。
3操作人
XXX
4操作步骤
4.1由本院的采购中心负责向三证[营业许可证、经营许可证(如为厂家则有生产许可证)、注册证]齐全的公司采购合格的产品。
4.2收到试剂后检查其是否处于冰冻状态,包装是否有破损。
4.3及时将试剂按照其说明书转移到相应的地方保存。
5本SOP的变动程序
本SOP的变动,可由任一使用该文件的工作人员提出,报上级负责人决定。
如通过则公布实行。
起草人
批准人
启用日期
XXX
XXX
2003年2月10号
XX医院
临床基因扩增检测实验室
实验室常用溶液配制
标准操作程序
编号:
C004
第一版
第1页共2页
1目的
保证实验中用到的各种溶液符合实验要求。
2适用范围
核酸扩增荧光检测实验室常用溶液:
4%NaOH溶液、75%的酒精(由医院提供)、1%新洁尔灭溶液(由医院提供)。
3操作人
XXX
4配制
4.1用具
干燥洁净的200ml量桶一只,5ml量桶一只,三角烧瓶两只,天平一架,250ml、1000ml广口瓶各一只。
4.2配制步骤
4.2.1配制NaOH溶液
a)用天平称取4克分析纯的NaOH固体,置于一只三角烧瓶中。
b)用200ml量桶准确取100ml水,缓缓注入盛放NaOH固体的三角烧瓶中。
c)摇荡三角烧瓶使NaOH固体充分溶解。
d)然后缓缓倾倒入250ml广口瓶中密封保存备用。
4.2.2配制1%新洁尔灭溶液(可以由医院提供)
a)用5ml量桶准确取2ml新洁尔灭原液,缓缓注入一只三角烧瓶中。
b)用200ml量桶准确取198ml水,缓缓注入盛放新洁尔灭的三角烧瓶中。
XX医院
临床基因扩增检测实验室
实验室常用溶液配制
标准操作程序
编号:
C004
第一版
第2页共2页
c)摇荡,混匀溶液。
d)将混匀的溶液转移入广口瓶中。
e)重复a~d步的操作,制备1000ml的1%新洁尔灭溶液储存备用。
5本SOP的变动程序
本SOP的变动,可由任一使用该文件的工作人员提出,报上级负责人决定。
如通过则公布实行。
起草人
批准人
启用日期
XXX
XXX
2003年2月10号
附:
注意事项
每份配制好的溶液保质期为14天。
XX医院
临床基因扩增检测实验室
标本的验收和保存的
标准操作程序
编号:
C005
第一版
第1页共3页
1目的
保证所收集的标本符合实验要求。
保证标本的保存质量。
2适用范围
核酸扩增荧光检测验室现行检测项目:
HBV、HCV、TB、CT。
3操作人
XXX
4验收、保存程序
4.1验收步骤
4.1.1签收
严格对各类样本的查对和签字制度,对病房各样本及时进行验收,查对,不符合要求的样本一律退回,并有书面记录。
4.1.2分类验证
4.1.2.1一般内容
进入实验室的样本在进行编号、离心前,工作人员应再次认真查对姓名,联号,住院号,病区床号,项目等。
对不符合要求者应作记录,并及时通知采样科室,正确及时地补采样本,以免延误病人的检测结果报告。
对书写不清楚的申请单,当事者要及时与病房联系(可电话联系),明确受检者姓名,住院号,性别,年龄,病区,床号和检验项目等。
4.1.2.2按检测项目验证标本
a)HBV:
所需标本类型为未溶血的血清。
XX医院
临床基因扩增检测实验室
标本的验收和保存的
标准操作程序
编号:
C005
第一版
第2页共3页
b)HCV:
所需标本类型为未溶血的血清。
c)CT:
病患部位的棉拭子。
d)TB:
晨起第一口痰(不能为唾液)、胸腹水、脑脊液、脓液或穿刺液。
4.1.3符合拒检的不合格病人标本的范围
未正确使用抗凝剂的标本;严重溶血及静脉营养时严重脂血并影响检测结果的血标本;血量不足检验需要量的标本;经查对,标本的病人姓名、年龄、性别、及检验号联等不相符者;采集的标本将严重影响检验结果者(例如检测项目TB的标本是唾液而不是晨痰)。
4.1.4拒检程序
a)对拒检的不合格标本应登记在不合格标本处置记录本上。
b)在原申请单空白处写上标本不合格原因,并将之送返送检科室/单位。
c)必要时电话告之相关科室/单位的医生或护士。
4.2标本的保存
a)HBV:
全血样本在3小时内分离出血清,保存于-20℃。
b)HCV:
全血样本在3小时内分离出血清,保存于-20℃。
c)TB:
液化的痰标本如果不立即用于核酸提取,保存于-20℃。
处理后的痰或胸腹水、脑脊液、脓液用于TB检测的标本可置于4℃下短期保存。
长期保存于-70℃下。
d)CT:
处理后的棉拭子标本置于-20℃下短期保存。
4.3特殊标本处理
对暂不检测的项目和规定时间外收到的零散样本,要随时登记和交班,以免漏检,遗失和延误检验。
对特殊样本或特殊病人的样本,实行“首接”负责制,
XX医院
临床基因扩增检测实验室
标本的验收和保存的
标准操作程序
编号:
C005
第一版
第3页共3页
所谓特殊样本是指难于采集的样本,以及特殊病人的样本一律实行“首接”负责制,无论那位工作人员,一旦收到样本后,均须负其责任,不得以任何借口推托,及时和正确保管和转送样本到有关实验室或有关人员,同时作交班记录和双签名。
对于做长期病情动态考察的病人标本一律置于-70℃下长期保存,使用时再按需取出检测。
5本SOP的变动程序
本SOP的变动,可由任一使用该文件的工作人员提出,报上级负责人决定。
如通过则公布实行。
起草人
批准人
启用日期
XXX
XXX
2003年2月10号
XX医院
临床基因扩增检测实验室
标本前处理
标准操作程序
编号:
C006
第一版
第1页共3页
1目的
保证标本处理标准化、规范化,使不规范操作因素对实验结果造成的影响减至最小。
2适用待处理标本范围
乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、沙眼衣原体、结核杆菌。
3操作人
XXX
4标准操作程序
4.1乙型肝炎病毒(DNA血清)
a)双手戴上手套,从冰箱取出标本,弃去手套。
b)双手换上新手套,用镊子(夹取灭菌物品专用)取出0.5ml离心管,对应标本编号,置于离心管架上。
c)将移液器调到50µl,先混匀DNA浓缩提取液,再吸取50µl加入到排好顺序的离心管中,然后再加入50µl血清,加盖编号,混匀(注意每吸取一份血清标本应更换一次枪头),室温放置2min,10000rpm离心10分钟,弃上清,加入20ul裂解缓冲液,震荡混匀,2000rpm短暂离心,然后将转移到已经加热好的干浴锅内,100℃干浴10分钟。
d)干浴完成后将离心管取出,转至离心机中,10000rpm离心10分钟,取上清液2µl加样上机。
e)收拾台面至准备状态。
XX医院
临床基因扩增检测实验室
标本前处理
标准操作程序
编号:
C006
第一版
第2页共3页
4.2丙型肝炎病毒(RNA血清)
a)双手戴上手套,从冰箱取出标本,弃去手套。
b)双手换上新手套,用镊子(夹取灭菌物品专用)取出0.5ml灭菌离心管,对应标本编号,置于离心管架上。
c)吸取150µl裂解液加入已经排好顺序的离心管中,再加入50µl血清,吸头反复吸打混匀,然后加入50ul氯仿,震荡5秒(也可用手颠倒混匀),13000rpm,4℃离心15分钟。
d)吸取100ul无色上清于另一已加入-20℃预冷异丙醇100µl的离心管中,颠倒混匀,13000rpm,4℃离心15分钟,去上清,倒置于吸水纸上,沾干液体。
加入300ul75%乙醇,小心颠倒混匀,13000rpm,4℃离心10分钟,去上清,倒置于吸水纸上,沾干液体。
e)4000rpm离心10sec,将管壁上的残余液体甩到管底部,用微量加样器尽量将其吸干(注意吸头不要碰到有沉淀一面),室温干燥5min(不宜过于干燥,以免RNA不溶)。
f)加入15µl的DEPC水溶解沉淀,2000rpm离心5秒,冰上保存备用。
以此15ulRNA溶液作为PCR反应模板,加样上机。
g)收拾台面至准备状态。
4.3沙眼衣原体(棉拭子)
a)双手带上手套,从冰箱取出标本,弃去手套。
b)双手换上新手套,用镊子(夹取灭菌物品专用)取出0.5ml离心管,对应标本编号,置于离心管架上。
c)取样品300ul于已经排好顺序的离心管中,13000rpm离心10分钟,弃上清,将离心管倒置吸水纸上吸干残液。
d)加入裂解缓冲液20ul,震荡混匀后作短暂离心,100℃干浴10分钟,
e)13000rpm离心10分钟,取上清2ul进行PCR反应,上机。
f)收拾台面至准备状态。
XX医院
临床基因扩增检测实验室
标本前处理
标准操作程序
编号:
C006
第一版
第3页共3页
4.4结核杆菌(痰液)
a)取晨痰加入4倍体积4%氢氧化钠待其充分液化(30分钟),液化过程中,振荡2~3次,如痰液粘稠,可延长液化时间。
b)取900ul消化液加入离心管,13000rpm离心10分钟。
c)弃上清留沉淀,加入1ml灭菌生理盐水振荡悬浮,13000rpm离心10分钟。
d)重复c操作,留沉淀,加入30µlDNA提取液,混匀后作短暂离心。
e)100℃干浴10分钟。
f)13000rpm离心10分钟,取上清2µl点样上机。
5本SOP的变动程序
本SOP的变动,可由任一使用该文件的工作人员提出,报上级负责人决定。
如通过则公布实行。
起草人
批准人
启用日期
XXX
XXX
2003年2月10号
XX医院
临床基因扩增检测实验室
样品编号
标准操作程序
编号:
C007
第一版
第1页共2页
1目的
保证样品编号的唯一性,也是准确发放报告的基础。
2适用范围
使用核酸扩增荧光检测实验室所开展的四种检测项目:
乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、沙眼衣原体、结核杆菌。
3操作人
XXX
4编号方法
4.1基本原则
4.1.1按检测类型分类标记
根据检测项目的不同,每种检测项目对应标记一种唯一的代号。
如乙型肝炎病毒标记为B、丙型肝炎病毒标记为C、结核杆菌标记为T、沙眼衣原体标记为CT等。
4.1.2按验单接收顺序编号
在同种检测类型的化验单中,按化验单顺序编号(项目+日期+两位序列号)。
如2002年10月21号第一个检测乙型肝炎病毒的验单编为B02102101、第二个检测乙型肝炎病毒的验单编为B02102102、第三个检测结核的验单编为T02102103等。
4.1.3特殊标本的编号
如有特殊情况,应在标记前面增加特异字母区别开,如其它医院送来的单和本医院的单要区分开,其它医院送来的单编号在最后+S,如2002年12月23号第30个外院HBV-DNA验单编为B02122330S等。
XX医院
临床基因扩增检测实验室
样品编号
标准操作程序
编号:
C007
第一版
第2页共2页
4.2编号步骤
a)先统计所有当天送来的标本,根据编号的基本原则,按类型、按顺序给
当天的标本编好号,每个样本的每个检测项目对应一个唯一的编号。
b)用标记笔在每张验单和对应的样品管上作好相同的标记。
c)在样本统计簿上作好记录,每个样本的记录都应包括以下信息:
送检时间、医院、科室、医生、病人姓名、临床诊断、门诊号/住院号、实验结果(当天实验后填上)等。
d)模拟扩增仪反应槽,在一张检验信纸上按类型、顺序排好各样本的位置,同时排好阴阳性对照、阳性质控品、阳性标准品的位置。
e)处理好样品、加样后,将反应管放入扩增仪上相应位置,开始扩增。
f)扩增得到结果后,先在统计簿上填入结果,作好记录,再一一把实验结果填入相应验单。
g)发放结果报告单。
5本SOP的变动程序
本SOP的变动,可由任一使用该文件的工作人员提出,报上级负责人决定。
如通过则公布实行。
起草人
批准人
启用日期
XXX
XXX
2003年2月10号
XX医院
临床基因扩增检测实验室
实验台摆放规范
编号:
C008
第一版
第1页共2页
1目的
使实验操作过程达到最优,保证检测工作的正常进行。
2适用范围
核酸扩增荧光检测实验室中用来处理样品的实验台及置于其上的实验用具,包括移液器架、标本架、吸头盒、离心管盒等物品。
3操作人
XXX
4摆放规范
核酸扩增荧光检测实验室中用来处理样品的实验台上各种物品的摆放必须遵照一定的规则。
实验物品须排放整齐,实验前和做实验时的摆放要有区别,要区分相对洁净区和相对污染区。
4.1做实验前实验台面的摆放应如图1所示
图1
XX医院
临床基因扩增检测实验室
实验台摆放规范
编号:
C008
第一版
第2页共2页
说明:
移液器架上从左到右放200~1000µl、40~200µl、5~40µl、0.5~10µl、0.1~2µl的移液器;移液器架左边摆放离心管架和弃液缸,是相对污染区;枪架右边摆放常用的实验试剂(如双蒸水、生理盐水、NaOH等)和枪头盒,是相对洁净区。
4.2做实验时实验台面的摆放应如图2所示
图2
说明:
做实验时,枪头盒放置枪架前;弃液缸移至右手易打掉枪头的位置(注
意与常用实验试剂隔开一定的距离,实验后其摆放位置用75%酒精擦拭);标本在正前方和左手边区域处理。
5本SOP的变动程序
本规范的变动,可由任一使用该文件的工作人员提出,报上级负责人决定。
如通过则公布实行。
起草人
批准人
启用日期
XXX
XXX
2003年2月10号
XX医院
临床基因扩增检测实验室
核酸扩增荧光检测
实验和结果分析
标准操作程序
编号:
C009
第一版
第1页共4页
1目的
保证扩增及结果分析的标准化、规范化。
2使用范围
使用LightCycler型扩增仪的核酸扩增荧光检测实验室。
3操作人
XXX
4标准程序
4.1核酸提取、纯化、扩增、产物分析的具体操作见项目SOP文件及仪器使用SOP文件;
注:
目前,SOP文件的主要依据是生产厂家提供的检测试剂盒说明书。
4.2核酸提取、纯化、加模板在样本处理区完成;
4.3扩增反应体系的配制、分装在试剂处理区进行;
4.3制备好的扩增混合液由传递窗转移至扩增区,上机扩增;
4.5扩增程序的编程:
日常检测活动中,操作者必须遵循仪器使用SOP文件规定的路径。
编程或修改路径参照仪器说明书;
4.6标本标识的传递:
以标本唯一性标识中的“序列号”作为检测过程中的“检验号”进行传递;
4.7工作安排:
每一项目每周至少完成一个批次的检测;
4.8在移取所需体积的血清及痰液后,立即盖紧原始标本管盖,将标本继续保存于-20℃冰箱;
4.8.1原始标本保存一周后丢弃;
4.8.2如患者及医生对标本结果有异议,则需在一周内及时提出意见,以便重新检测复核结果;
XX医院
临床基因扩增检测实验室
核酸扩增荧光检测
实验和结果分析
标准操作程序
编号:
C009
第一版
第2页共4页
4.9结果分析标准程序
对于LightCycler结果曲线的分析,应按以下步骤进行:
全部曲线——阴性对照——阳性对照——阳性室内质控品——阳性标准品——逐个分析(标出阳性标本和可疑标本)——调整参数,获得较好的标准曲线,显示定量结果——登记,发报告。
4.9.1整体曲线的观察
将所有曲线选中进行整体观察
a)观察是否存在污染情况(包括标本污染和试剂污染),特别应注意大量曲
线在同一Ct值出现上涨的情况。
b)观察是否有光路传导阻滞或电压波动等机器原因形成的异常曲线。
4.9.2阴性对照的分析
阴性对照:
试剂中加入与待检标本进行同样处理的已知阴性标本。
作用:
用以监测实验室和前处理过程中是否存在污染。
4.9.3阳性对照的分析
阳性对照:
试剂中加入与待检标本进行同样处理的已知阳性标本。
作用:
用以监测实验能否正常检出阳性标本,避免假阴性的出现。
4.9.4阳性室内质控品的分析
阳性室内质控品:
试剂中加入与待检标本进行同样处理的已知或未知浓度的阳性室内质控血清。
作用:
用以监控日常实验的精密度。
XX医院
临床基因扩增检测实验室
核酸扩增荧光检测
实验和结果分析
标准操作程序
编号:
C009
第一版
第3页共4页
4.9.5阳性标准品的分析
a)各梯度曲线的分布是否均匀,若各梯度曲线均未分开,则表明阳模稀释可能存在问题,提示实验中存在较大人为误差。
b)观察各曲线的Ct值是否在平日的正常位置。
情况1:
若出现低拷贝标准品做不出,而各
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