凯基TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒.docx
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凯基TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒
凯基TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒
凯基TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒(通用)
(BIOTIN标记POD法,适用于细胞、组织样本)
使用说明书
一、TUNEL制品说明
凯基TUNEL细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况,其原理是生物素(biotin)标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdTEnzyme)的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3‘-OH末端,并可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素(Streptavidin-HRP)特异结合,在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺(DAB)的存在下,产生很强的颜色反应(呈深棕色),特异准确地定位正在凋亡的细胞,因而在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞;由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3'-OH形成,很少能够被染色。
本试剂盒适用于组织样本(石蜡包埋、冰冻和超薄切片)和细胞样本(细胞涂片)的凋亡原位检测。
本试剂盒特点
●操作简便:
使用Ready-to-Use型试剂,并配有ProteinaseK和DAB。
●高灵敏度:
可以单一检出初期的凋亡细胞。
●高特异性:
能特异性染色凋亡细胞。
●快速操作:
整体操作约需3小时。
●用途广泛:
可应用于组织切片、细胞样本等。
●方便观察:
使用光学显微镜观察实验结果。
●高正确性:
有阳性对照片的制备方法,可以确认试剂盒的有效性
使用注意事项
1.使用前请认真阅读本说明书,提前准备好相关试剂。
2.因本试剂盒中组分均为微量,使用前请离心集液。
3.为避免试验误差、降低试剂的损耗,建议使用精密度高的进口微量移液枪及枪头。
4.TdT酶反应液最好在使用前根椐样本数量集中配制,再分别滴加于各样本片上,避免每个样本单独配制而产生的试剂损耗。
5.为防止样本脱落,请使用硅烷(Silane)处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。
6.固定好的样本可以在-20℃的70%乙醇中放置30分钟或至过夜,以改善细胞的渗透性。
7.使用PBS清洗细胞样本时,不要直接加在细胞样本上,以防止细胞样本的脱落。
8.进行PBS清洗时,以5分钟清洗3次为标准。
9.DAB为固体粉末,使用前加入PBS配制成20×DAB(10mg/ml)后,按说明书显色使用。
二、TUNEL试剂盒组分
组份
Cat:
KGA702
20assays
Cat:
KGA703
50assays
Cat:
KGA704
100assays
储存条件
EquilibrationBuffer
1.0mL
2.5mL
5.0mL
-20℃
Biotin-11-dUTP
20μL
50μL
100μL
-20℃
TdTEnzyme
80μL
200μL
400μL
-20℃
50×ProteinaseK
40μL
100μL
200μL
-20℃
Streptavidin-HRP
10μL
25μL
50μL
4℃避光
DAB
2mg
5mg
10mg
-20℃
试剂盒以外自备仪器和试剂
光学显微镜、37℃孵箱、微量移液器、染色湿盒、盖玻片、载玻片、染色缸。
二甲苯、多聚甲醛、PBS、H2O2、TritonX-100、柠檬酸钠、复染染液:
苏木素或甲基绿等。
三、操作流程概览
细胞涂片、贴壁细胞爬片等细胞样本
固定
样本通透性的促进
TdT酶的作用下Biotin-dUTP与样本DNAD的标记反应
加入Streptavidin-HRP及底物DAB的显色反应
光学显微镜观察
四、检测样本的预处理
TUNEL检测时样本的预处理是试验的关键所在,本说明书推荐的条件仅为普遍情况,用户需根椐自已的样本材料及首次试验结果来调整各个条件(参照Page9),如处理时间、处理浓度等,来优化出适合自身样本的试验条件,从而做出客观的试验结果。
1.细胞样本的准备
操作注意事项:
1.为防止样本脱落,请使用硅烷(Silane)处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。
2.使用PBS清洗细胞样本时,不要直接加在细胞样本上,以防止细胞样本的脱落。
3.进行PBS清洗时,以5分钟清洗3次为标准。
4.固定液、PBS、封闭液、通透液、染色缸需用户自备,请按上述方法配制。
五、标记和显色反应
操作注意事项:
1.进行PBS清洗时,以5分钟清洗3次为标准。
2.PBS清洗后,为了各种反应的有效进行,请尽量除去PBS溶液后再进行下一步反应
3.在载玻片上的样本上加上实验用反应液后,请盖上盖玻片或保鲜膜,或在湿盒中进行,这样可以使反应液均匀分布于样本整体,又可以防止反应液干燥造成实验失败。
4.TdT酶反应液即用即配,短暂于冰上保存。
不宜长期保存,长期保存会导酶活性的失活。
5.如果20×DAB溶液颜色变深成为紫色,则不可使用,需重新配制。
6.苏木素复染:
将切片放入苏木素染液,染色30s-10min(根据样本做适当调整),蒸馏水冲洗干净后放入盐酸甲醇溶液中5s,立即用蒸馏水冲洗干净。
分别用70%、85%、95%、无水乙醇浸泡5分钟。
用二甲苯浸泡10分钟,更换二甲苯后再浸泡10分钟。
晾干后在切片上加中性树胶,加盖玻片。
六常见问题的原因及推荐解决方案
现象
可能原因
建议
非特异性染色(例如:
非凋亡细胞的强染色)
Biotin-dUTP的非特异性结合
勿使细胞干涸
在TdT酶反应之后,再用含0.1%TritonX-100和1mg/mlBSA的PBS洗三次。
TdT酶的浓度过高
用TdTdilutionbuffer*作1:
2——1:
10稀释,
内源过氧化物酶未被封闭
封闭液室温(15-25℃)封闭10min(封闭液:
3%H2O2溶于甲醇)
光照紫外线导致包埋试剂的聚合(如:
甲基丙烯酸会导致样本DNA的断裂)
尝试改用其它包埋材料或其它聚合试剂
在固定组织时样本DNA已断裂(内源核酸酶的作用)
确保样品取样后立即固定或通过肝静脉灌注固定
固定后某些核酸酶活性依然较高导致DNA断裂
用含有dUTP和dAPT的溶液封闭
染色背景较高
福尔马林固定导致某些含黑色素前体的细胞染成黄色
尝试以甲醇固定,但可能会降低检测的敏感性。
内源过氧化物酶未被封闭
封闭液室温(15-25℃)封闭10min(封闭液:
3%H2O2溶于甲醇)
Biotin-dUTP的非特异性结合
在TdT酶反应之后,再用含0.1%TritonX-100和1mg/mlBSA的PBS洗三次。
样本被支原体污染
使用支原体检测试剂盒检测,如阳性则制备未被污染的新样本
标记反应试剂(TdT酶及dUTP)的浓度过高
稀释50%,以降低标记反应的浓度
细胞处于高度增殖期
在非高增殖期取样检测
DAB孵育时间过长
减少DAB染色时间
标记率低、染色淡至无
如果以乙醇或甲醇固定的样本则标记效率较低(因为在固定时染色质未能与蛋白质交联,而在操作中丢失)
用溶于PBSPH7.4中的4%多聚甲醛固定
或福尔马林或戊二醛固定。
过度的固定导致与蛋白过度交联
缩短固定时间,或用溶于PBSPH7.4的2%多聚甲醛固定
促渗条件不佳,以致于试剂不能到达靶分子或浓度过低
● 增加通透剂促渗时间
● 增加通透剂的作用温度(15-25℃)
● 优化蛋白酶K的作用浓度和作用时间(如:
以400ug/ml作用5min)
● 0.1M的柠檬酸钠70℃作用30min。
复染信号较弱
选择的染料不合适
用溶于0.1M醋酸巴比妥的3-5%甲基绿PH4.0,或苏木素复染
阳性对照没有信号
DNaseI的浓度过低
● 冷冻切片使用3U/mL的DNaseI
● 石蜡切片使用1500U/mL的DNaseI
● 一般样本使用10U/mlDNaseI
● 反应缓冲液:
10mMTris-HCl(PH7.9),10mMNaCl,5mMMnCl2,10mMCaCl2,25mMKCl2,37℃反应30min,PBS洗去。
组织样本从载玻片脱落
组织样本被酶从玻片消化下来
降低蛋白酶K的处理时间
*TdTdilutionbuffer:
60mMKPB缓冲液(pH7.2),150mMKCl,1mM2-mercaptoethanol,50%Glycerol
非离子表面活性剂
TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)免疫细胞化学中,TritonX-100常用浓度为1%和0.3%,但通常是先配制成30%的TritonX-100储备液,临用时稀释至所需浓度。
30%TritonX-100的配制:
试剂:
TritonX-10028.2ml
0.1mol/LPBS(pH7.3)或0.05mol/lTBS(pH7.4)72.8ml
配制方法:
取TritonX-100及PBS(或TBS)混合,置37℃~40℃水浴中2~3h,使其充分溶解混匀。
用前取该储备液稀释至所需浓度。
TritonX-100是一种非离子型表面活性剂(或称清洁剂),分子量为646.86(C34H62O11)。
它能溶解脂质,以增加抗体对细胞膜的通透性。
1%的TritonX-100常用于漂洗组织标本,0.3%的TritonX-100则常用于稀释血清,配制BSA等。
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- 凯基 TUNEL 细胞 原位 检测 试剂盒