肝细胞肝癌中STAT3和cmyc作用的初步研究.docx
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肝细胞肝癌中STAT3和cmyc作用的初步研究
肝细胞肝癌中STAT3和c-myc作用的初步研究
兰州大学硕士学位论文
肝细胞肝癌中STAT3和c.myc作用的初步研究
中文摘要
目的
(1)检狈IJSTAT3蛋白及c.myc蛋白在肝癌SMMC.7721细胞以及肝细胞肝癌组织中
的表达。
(2)抗体干预后观察STAT3及c-myc对肝癌SMMC一7721细胞增殖和凋亡的影响以及两者的相互关系,探讨两者在肝癌发生发展中的作用。
方法
(1)免疫细胞化学及RT.PCR方法观察STAT3,及c.myc在肝癌细胞SMMC.7721中
的表达。
(2)免疫组织化学方法检测STAT3蛋白及c.myc蛋白在肝细胞肝癌组织中的表
达。
(3)分别单独应用STAT3及c.myc的抗体及两种抗体联合应用后,MTT法检测肝癌细胞SMMC.7721的增殖情况,应用流式细胞仪检测细胞凋亡,RT-PCR技术检测STAT3及c.mycmRNA表达的变化。
结果
(1)STAT3/3f..c—myc在肝癌细胞sMMc.7721中均有表达。
sTAT3蛋白和c—myc蛋白均主要表达于细胞浆。
(2)应用抗STAT3抗体干预后检测到肝癌细胞SMMC.7721增殖受到抑制,呈现时间、剂量依赖性。
201ag/mL处理组和40I-tg/mL处理组与lOLug/mL处理组比较,抑制率具有显著差异(尸<0.05)。
201ag/mL处理组和4%g/mL处理组比
较,抑制率无显著差异胗O.05)。
(3)应用抗c.myc抗体干预后SMMC.7721细胞增殖受到抑制,细胞活力下降,呈现时间、剂量依赖性,20pg/mL处理组君lJ4009/mL处理组与10pg/mL处理组比较,抑制率具有显著差异(尸 2%g/mE处理组和40pg/mL处理组比 较,抑制率无统计学差异(P>0.05)。 (4)联合应用抗STAT3及抗c.myc抗体干预后,MTT结果显示对细胞增殖的抑制 兰州大学硕士学位论文 作用呈时间、剂量依赖性。 在24h处理组和48h处理组,联合应用抗体对SMMC.7721细胞增殖的抑制率高于单用一种抗体处理组,具有统计学差异(氏0.05)。 72h处理组与单用一种抗体处理组相比,抑制率无统计学意义 胗O.05)。 (5)流式细胞术检测显示单独应用抗STAT3和抗c.myc抗体及两者联合应用后,细胞的早期凋亡率从对照的0.88%增加到7.12%、10.6%和15.5%,晚期凋亡细胞比率从对照的1.00%增加到3.12%、5.32%和7.14%,联合应用抗STAT3及抗c.myc抗体处理的细胞凋亡率高于单用一种抗体处理组。 (6)RT.PCR{佥i贝WJ显示应用抗STAT3抗体作用于细胞48h,c-mycmRNA的表达下降;联合应用两种抗体处理细胞48h,c.mycmRNA的表达明显降低,(7)联合应用抗体作用于细胞48h,RT-PCR检测显示STAT3mRNA的表达较对 照组降低。 (8)STAT3在33例肝细胞肝癌组织中表达,c.myc在32例肝细胞肝癌组织中 表达,不同分化程度的肝细胞肝癌中STAT3,c.myc的表达差异有统计学意 义(P 结论 (1)肝癌细胞SMMC.7721中存在STAT3及c.myc信号的过度激活。 (2)抑制STAT3基因或者c-myc基因以及同时抑制STAT3和c-myc基因可以抑制 肝癌SMMC.7721细胞增殖,诱导细胞凋亡。 提示STAT3基因和c.myc基因在 肝癌的发生发展中发挥了重要作用。 (3)STAT3: g]c-myc基因在人肝细胞肝癌组织中过表达,STAT3,c-myc的表达强度与肝细胞肝癌的病理分级呈正相关,提示STAT3和c.myc基因参与了肝癌的恶性转化。 (4)抗STAT3抗体作用于肝癌SMMC.7721细胞,可以抑专fJc-myc基因的表达,提 示STAT3可能通过上调C.myc而抑制肝癌细胞凋亡,促进细胞增殖。 关键词肝细胞肝癌;STAT3;c.myc;增殖;凋亡;免疫组织化学;MTT;流式细胞 术: RT.PCR Ⅱ 兰州大学硕士学位论文 ThestudyofeffectofSTAT3andc-mycinHeDatocellularcarcinoma ABSTRACT objective (1)ToinvestigatetheexpressionofSTAT3andc—mycproteinsinSMMC一7721celllineandhumanHepatocellularcarcinoma. (2)ToevaluatetheeffectsonthecellproliferationandapoptosisbytheinhibitionofantibodiesandtoexplorethecorrelationofthetwogenesandtheeffectsonthedevelopmentofHepacellularcarcinoma. Methods (1)STAT3andc-mycproteinandmRNAlevelsinSMMC一7721cellwere detectedusingimmunocytochemistryandsemi·quantityRT-PCR. (2)TheexpressionofSTAT3andc-mycproteinsinhumanHepacellularcarcinomaweredetectedbyimmnohistochemistrialstaining. (3)Thecelllinewastreatedwithanti·STAT3antibodyoranti-C—mycantibodyorthecombinationofanti—stat3andanti—C—myc.antibodiesrespectivelyThecellproliferationandapoptosisweredetectedbyMTTandFlowcytometry.RT-PCRwasappliedtoinvestigatetheexpressionchangesofSTAT3andc-mycmRNA. Results (1)ImmunocytochemicalanalysisshowedthatboththeproteinofSTAT3andc—mycproteinwasmainlylocalizedinthecytoplasm. (2)TheproliferationofSMMC一7721cellwasinhibitedinatime—anddose dependentmannerbyusinganti—STAT3antibody.Theinhibitionrateof20Bg/mLgroupsand40pg/mLgroupshadasignificentdifferencecomparingwiththatof10¨g/mLgroups(P<0.05).Nostatisticdifferenceofinhibitionratewasfoundbetween20IIg/mLgroupsand4099/mLgroups p0.05) Ⅲ 兰州大学硕士学位论文 (3)ThegrowthabilityofSMMC.7721cellwasinhibitedinatime.anddose-dependentmannerbyusinganti-c-mycantibody.Theinhibitionrateof20pg/mLgroupsand40I.tg/mLgroupshadasignificentdifferencecomparing withthatof10pg/mLgroups伴O.01).Nostatisticdifferenceofinhibitionrate wasfoundbetween20Bg/mLgroupsand4099/mLgroups(P>O.05). (4)MTTshowedthatthemixedtreatmentofanti—c—mycantibodyandanti.STAT3antibodyhadaninhibitioneffectonSMMC一7721celltimeanddosedependently.Thegroupsofcombinedanti—STAT3andanti-c·mycantibodieshadahigherinhibitionratethanthesingletreatmentgroupsofanti—c—mycantibodyoranti—STAT3antibodyonSMMC一7721cellin24hand48h(P comparingwithusingasinglekindofantibodyin72hp0.05). (5)Thecelllinewastreatedwithanti—STAT3oranti—C.mycorthecombinationofanti—STAT3andanti—c—myc,theearlyapoptosisrateincreasedfromO.88%inthecontrolcellsto7.12%,10.6%and15.5%respectively.thepercentageoflateapoptosiscellsincreasedfrom1.00%inthecontrolstoeither3.12%,5.32%and7.14%.Theapoptosisratesblockingbycombinedanti-STAT3andanti—c—mycantibodieswerehigherthanthatofusingasinglekindofantibody (6)Themixedtreatmentofanti—STAT3andanti-c—mycantibodiesin48hhadamoreremarkabledeclineinthemRNAlevelofc-mycthanthesingletreatmentofanti—STAT3antibodyinSMMC一7721celllinebyRT—PCRanalysis. (7)RT-PCRanalysisalsoshowedthattheSTAT3mRNAlevelblockingbycombinedanti-·STAT3andanti·-C·-mycantibodiesin48hdecreasedascomparingwiththecontrol’SinSMMC一7721cellline. (8)STAT3proteinsweredetectedin33casesofHepatocellularcarcinoma.c—mycproteinsweredetectedin32casesofHepatocellularcarcinoma.TheexpressionofSTAT3andc·mycproteinsshowedastatisticsignificancewiththedifferentiateddegreeofHepatocellularcarcinoma(P<0.05). Conclusions (1)STAT3andc—mycproteinsareallactivatedinSMMC.7721cellline. (2)BlockingSTAT3proteinorc—mycproteinorinhibitingSTAT3proteinand IV 兰州大学硕士学位论文 c-mycproteincombinedlycaninhibittheproliferationandinducetheapoptosisofSMMC一7721cell,suggestingthatSTAT3proteinandc-mycproteinplayacrucialroleininitiationanddevelopmentofHepatocellular carcinoma. (3)TheexpressionofSTAT3andc—mycproteinsallcanbedetectedinHepatocellularcarcinoma,andtheexpressionofSTAT3andc—mycproteinsispositivecorrelationwiththedifferentiateddegreeofHepatocellularcarcinoma,suggestingthatSTAT3andc-mycproteinsarerelatedwiththeprogressionofHepatocellularcarcinoma. (4)ToblockSTAT3genecaninhibitc-mycgeneexpressioninSMMC一7721 cell,suggestingthatSTAT3mayup—regulatec-mycgenetoinhibit SMMC-7721cellsapoptosisandtofacilitatetheirproliferation. KeywordsHepatocellularCarcinomacelllineSMMC一7721;STAT3;c—myc;Proliferation;Apoptosis;Immunocytochemistry;MTT;Flowcytometry;RT.PCR V 原创性声明 本人郑重声明: 本人所呈交的学位论文,是在导师的指导下独立进行研究所取得的成果。 学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的成果、数据、观点等,均已明确注明出处。 除文中已经注明引用的内容外,不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。 对本文的研究成果做出重要贡献的个人和集体,均己在文中以明确方式标明。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名: 主盈坐日期: 塑: £堑 关于学位论文使用授权的声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品,知识产权归属兰州大学。 本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的规定,同意学校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版,允许论文被查阅和借阅;本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用任何复制手段保存和汇编本学位论文。 本人离校后发表、使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时,第一署名单位仍然为兰州大学。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名: 猛盔Z导师签名: 日期: 型堑! 鲨‘ 兰州大学硕士学位论文 —1上..jL. 刖舌 信号转导和转录激活因子(SignalTransducersandActivatorsofTranscription,STATs)是研究干扰素诱导基因转录时首次发现的一个胞浆蛋白家族。 因为这一信号分子具有双 重作用,既可以作为受体与细胞核之间的信号传导子(SignalTransducer),也可以作为转录因子(TranscriptionFactor),因此将其命名为信号传导与转录激活因子。 迄今为止,已有7个STAT相继被克隆,即哺乳动物中的STATl(a/13)、STAT2、STAT3(e./13/? )、STAT4、 STAT5(a/b)、STAT6和果蝇中的D.STATIMl。 在正常生理状态下,STATs的激活仅持续数分钟至几小时,对于正常细胞的生理功能,如胚胎发育、器官形成、免疫功能的完善、细胞的生长、分化等,起着关键性作用【3】。 近年来研究发现,STATs具有强烈的抑制细胞凋亡,促进细胞增殖的作用,参与了人类恶性肿瘤的发生、发展和演进,其中以STAT3尤为活跃。 STAT3包括STAT3a、STAT313和STAT37=种异构体。 其中STAT30t主要与细胞的增殖和转化有关,STAT313贝IJ对粒细胞集落刺激因子介导的细胞分化更为重要,而活化的STAT37主要短暂地存在于已分化的中性粒细胞中,可能是调节成熟的骨髓细胞中受控的蛋白水解机制的前增殖蛋白成员141。 近几年的研究【5川已证实STAT3的异常活化与中枢神经系统疾病、肿瘤、白血病、心血管疾病、肥胖、肝细胞再生等多种病理生理过程有着密切的关系。 STAT3编码基因在鼠科动物定位于第11号染色体,在人类定位于第12号染色体。 由750"-'795个氨基酸组成,可分为7个功能区,1)位于第600"-'700位氨基酸之间的Src2型同源物(Srchomology-2.sin)区,是STAT3蛋白中最保守也是对其功能最重要的区段。 主 要有两个功能,一是参与STAT3蛋白的酪氨酸磷酸化,二是在STAT3-二聚体的形成中具有 重要作用;2)位于第500"-'600位氨基酸之间的SH3区,保守性较差,功能尚不清楚;3)位于羧基端第705位的酪氨酸磷酸化位点,当该位点磷酸化后,STAT3呈活化状态,通过SH2区的作用导致STAT3二聚体的形成,进入核内并结合DNA,激活靶基因的转录;4)DNA结合区,位于高度保守的第400"--'500位氨基酸之间,STAT3的最佳结合序列为TTCC(G/C)GGAA;5)保守性较差的竣基端,该区域含有转录激活区(Transcriptional ActivationDomain,TAD),和转录激活有关;6)位于第727位的丝氨酸磷酸化位点,可能由有丝分裂原激活的蛋白激酶(MitogenActivatedProteinKinase,MAPK)磷酸化后激活STAT3,使STATs途径$llRas途径发生联系;7)保守的氨基酸序列,为STAT3和其他转录 兰州大学硕士学位论文 因子之间的作用、STAT3二聚体的形成及与细胞因子受体间的结合等功能所必需【8驯。 STAT3传导信号和活化转录的详细机制尚未完全明确,大致为: 细胞因子与细胞表 面相应的受体结合,使其二聚体化。 缺乏内在酪氨酸激酶活性的受体聚集JAK家族成员,使其发生自身磷酸化而激活,因此该通路又被称为JAK.STAT3信号通路。 激活的JAK激酶继而磷酸化受体胞浆区的酪氨酸残基,使受体的构象发生改变,活化的受体或JAKs募集胞浆内的STAT3并使其磷酸化,STAT3活化后离开受体,两个STAT3单体通过分子间SH2区与酪氨酸磷酸化位点的相互作用,STAT3单体的第705位磷酸化的酪氨酸与另一个STAT3单体分子的SH2区第608位的精氨酸结合,在胞浆内形成同源或异源二聚体,迅速移位入核,结合于特定基因的启动子上,活化相应基因的转录110】。 STAT3成员完成特定的信号传递后,被一种未知的酪氨酸磷酸酶去磷酸化,并重新回到胞质中【111。 通过上述过程,STAT3可将细胞因子激发的短暂胞浆信号转化为长期的基因表达改变,从而调控细胞的多种生理功能。 研究发现多种信号可激活STAT3.包括: ①细胞[]q: (Cytokine): IL.6、IL.11、抑瘤素M(OSM)、睫状神经营养因子(CiliaryNeurotrophicFactor,CNTF)、白血病抑制因子(LeukaemiaInhibitoryFactor,LIF)、瘦素(Leptin)等: ②生长因子: 表皮 生长因子受体(EpidermalGrowthFactorReceptor,EGFR)、血小板源性生长因子 fPlatelet.DerivedGrowthFactor,PDGF)等: ③非受体酪氨酸激酶: c/v.Src、v—Abl、Tel.Jak、v-Sis等: ④G蛋白: 促甲状腺激素(Thyroid.StimulatingHormone,TSI-1)、巨噬细胞炎症蛋白.1(MacrophageInflammatoryProtein,MIP.1)等【12】。 活化的STAT3蛋白可通过调节凋亡抑制基因(Mcl—l,Bcl.xL,Survivin等),细胞周期调节基因(CyclinDl/D2,C.myc等)和 血管生成因子(! ZlWascularEndothelialGrowthFactor,VEGF)以及肿瘤转移相关基因(如 MatrixMetallo—Proteinases,MMPs)等多种途径参与肿瘤发生【13.18】.STAT3作为一种癌基因,其功能性激活与肝细胞肝癌(HepatocellularCarcinoma,HCC)的发生发展紧密相关。 Yoshikawa等119J在肝癌细胞系SNU-387和HuH—l中发现甲基化诱发的SOCSl沉默引起的JAK2磷酸化和STAT3的持续激活,STAT3的激活可能是SOCSl沉默导致肝癌发生的一个重要因素。 Yang等【20】研究了P.STAT3(tyr705)在肝细胞肝癌中的表达,发现在49.3%的 肝细胞肝癌标本中P.STAT3呈强阳性,而仅有5.8%的癌周组织的肝实质细胞呈强阳性 表达。 并发现P.STAT3在肝细胞肝癌中的表达与微血管密度密切相关,因而推测STAT3 可能通过这个途径而参与了肝细胞肝癌的发生和进展。 Feng: 等121】发现肝细胞肝癌组织中 2 兰州大学硕士学位论文 P.STAT3的阳性率为74.5%,明显高于癌周肝组织的23.6%,认为STAT3的激活可能是肝癌发生的早期事件。 原癌基因c.myc最早是作为禽类髓细胞增多症逆转录病毒(AvianMyelocytomatosisRetrovirus)癌基因v.mycl舰l胞同源基因被发现的【221。 人类c.myc基因定位于第8号染色体的长臂8q24I-.,由439个氨基酸组成。 根据功能不同,完整的c.myc蛋白可分为三个结构区域: 羧基末端区域(CTD),氨基末端区域仆汀D)和中间区域(CD)。 其中,羧基末端区域 包含三段重要的结构: 1)基本区域(BR),识别和结合特殊的
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- 肝细胞 肝癌 STAT3 cmyc 作用 初步 研究