最新版葡萄WRKY13参与对植株生长调控及对ABA的应答毕业设计.docx

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最新版葡萄WRKY13参与对植株生长调控及对ABA的应答毕业设计

青岛农业大学

毕业论文（设计）

题目：

葡萄WRKY13参与对植株生长调控

及对ABA的应答

姓名：

学院：

生命科学学院

专业：

生物技术

班级：

201002

指导教师：

刘新教授

2014年6月15日

目录

中文摘要……………………………………………………………………………………….1

Abstract…………………………………………………...…………………………………....2

引言………………………………………………………………………………………….....4

1材料与方法.............................................................................................................................6

1.1实验材料..............................................................................................................................6

1.1.1菌株及载体........................................................................................................................6

1.1.2常用酶、化学药品、试剂盒...........................................................................................6

1.1.3实验仪器...........................................................................................................................6

1.2实验方法..............................................................................................................................6

1.2.1材料培养...........................................................................................................................6

1.2.2材料处理...........................................................................................................................6

1.2.3培养基的配置...................................................................................................................7

1.2.4重组质粒的鉴定...............................................................................................................7

1.2.5根癌农杆菌（GV3101）感受态细胞的制备及转化.........................................................7

1.2.6花芽浸蘸法转化拟南芥及阳性植株的筛选...................................................................8

1.2.7气孔开度测定...................................................................................................................8

1.2.8实时定量PCR...................................................................................................................8

2结果与分析.............................................................................................................................9

2.1葡萄WKRY13的异源表达植株的获得.............................................................................9

2.1.1p-Super1300-WRKY13重组质粒的构建.........................................................................9

2.1.1.1p-Super1300-WRKY13重组质粒的菌落PCR鉴定.....................................................9

2.1.1.2p-Super1300-WRKY13重组质粒的酶切鉴定............................................................10

2.1.2p-Super1300-WKRY13重组质粒转入农杆菌菌落PCR鉴定.......................................10

2.1.3转基因植株的筛选.........................................................................................................11

2.1.4转基因植株的PCR鉴定................................................................................................11

2.1.5转基因植株的WRKY13基因相对表达量...................................................................11

2.2葡萄WRKY13异源表达植株生长的变化......................................................................12

2.2.1葡萄WRKY13异源表达植株的种子萌发率...............................................................12

2.2.2葡萄WRKY13异源表达植株根系的生长...................................................................13

2.2.3葡萄WRKY13异源表达植株主根的长度...................................................................13

2.2.4葡萄WRKY13异源表达植株侧根的数目...................................................................14

2.2.5葡萄WRKY13异源表达植株侧根的长度...................................................................14

2.3葡萄WRKY13异源表达植株对ABA的应答反应.........................................................14

2.3.1ABA对WRKY13异源表达种子萌发率影响................................................................15

2.3.2ABA对WRKY13异源表达植株根系生长影响...........................................................15

2.3.3ABA对WRKY13异源表达植株气孔开度的影响........................................................16

2.3.4葡萄WRKY13异源表达植株ABA相关基因的表达量.............................................16

3讨论.......................................................................................................................................17

致谢...........................................................................................................................................19

参考文献...................................................................................................................................20

葡萄WRKY13参与对植株生长调控及对ABA的应答

生物技术专业孙常明

指导教师刘新（教授）

摘要：

葡萄作为一种具有高营养价值和经济价值的果树，对探明其生长发育的机制，提高产量和品质具有极为重要的现实意义。

研究表明，转录因子和脱落酸（abscisicacid，ABA）都能参与调控拟南芥植株生长发育，并且二者存在着联系，但尚未见葡萄转录因子WRKY13与ABA在调控植物生长发育作用的报道。

本实验综合应用植物生理学和分子生物学等现代生物学技术，获得WRKY13异源表达植株，探究了葡萄WRKY13对植物生长发育的影响以及对ABA的应答反应。

结果表明：

葡萄WKRY13异源表达植株的种子萌发延迟，侧根数目增多并且种子萌发、根系和气孔表现出对ABA的不敏感性，ABA能够显著提高WKRY13异源表达植株的ABA合成基因（ABA1、ABA2）和其信号途径的相关基因（ABI1、ABI3）的表达量，但差异不显著。

关键词:

葡萄;WRKY13;脱落酸;生长发育

VvWRKY13regulatesplantgrowthandrespondstoABA

StudentmajoringinbiologicalsciencesSunchangming

TutorProf.LiuXin

Abstract:

AsakindofthatWRKYtranscriptionfactorsandtheplantArabidopsisthalianacouldbeinvolvedinregulationofplants’growthanddevelopment.Inaddition,theWRKYtranscriptionfactorscouldbe locatedintheprocessofABAsignalingpathways.Butweyetcan’tseeanyreportsaboutWRKY13andABAingrapesinfluencingplantgrowthanddevelopment.Thestudywhichappliedplantphysiology,molecularbiologyandothermodernbiologytechnologygotVvWRKY13ectopicexpressionofplants,exploredVvWRKY13plants’growthanddevelopmentandrespondedtotheABA.Inthestudy,VvWKRY13ectopicexpressionofplantshowedadelayinseedgerminationandaincreaseinlateralrootnumber.Besideswefindthatseed’sgermination,rootandstomashowednosensitivitytoABA.TheexpressionofvolumeofABA’ssyntheticgenes（ABA1,ABA2）andsignalingpathwaysrelatedgene（ABI1,ABI3）wereinfluencedbyABAtorisetodifferentextent,butthedifferencewasnotsignificant.ItcanbeshowedthatWRKY13canparticipateintheregulationofplants’growthanddevelopmentaswellastheABAsignaltransduction.

Keywords:

Vitisvinifera;WRKY13;Abscisicacid;Growth

缩略词对照表

缩写

英文名称

中文名称

ABA

abscisicacid

脱落酸

Amp

ampicillin

氨苄青霉素

OD

opticaldensity

光密度

LB

luria-bertanimedium

LB培养基

PCR

polymerasechainreaction

聚合酶链式反应

X-gal

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside

5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷

引言

葡萄是葡萄科（VitaceaeL.）葡萄属（VitisL.）的藤本落叶果树，出现在白垩纪初期，是世界上最早驯化的水果之一，在古代，葡萄就已经被大量的栽培和用于酿酒[1]。

据统计，现在世界葡萄栽培面积和产量居世界水果的第二位，并且我国葡萄产量居世界第五名。

葡萄作为一种具有高营养价值和经济价值的果树，其生长发育过程中受到诸多不利的外界环境的影响。

如夏季葡萄极易感染病害、秋季果实难以完全成熟和冬季花芽不能充分分化等等，导使我国的葡萄产量和质量无法达到较高层次，造成巨大的经济损失。

葡萄生长发育的调控及其机制的研究受到科学工作者的关注，在生产过程中，主要是通过对肥料和水利的控制，以及外施不同生长相关激素，从而达到对葡萄生长发育的调控。

在研究方面，主要集中在葡萄花的形成、芽的分化以及果实成熟过程中相关基因表达量和生理指标的变化等方面。

但是鲜见转录因子在葡萄激素调控植株生长过程中作用分子机制的研究报道。

大量的研究发现证实在与种子萌发、叶片和根系生长、开花等发育相关的基因中存在WRKY结构域。

最早发现的野生燕麦中的WRKY家族成员ABF1和ABF2参与了种子的萌发[3]；茄科中的转录因子ScWRKY1被证明在植物胚形成过程中发挥重要作用[4]；随后2005年Luo等发现拟南芥中WRKY转录因子参与了种子大小的形成[5]，特别是对拟南芥中WRKY2的功能进行研究后，发现其可以调控种子萌发过程，其对脱落酸（abscisicacid，ABA）的敏感性增强，WRKY2可以调节由ABA诱导的幼苗生长停滞[6]；在最近的报道中，2013年Kang等发现拟南芥转录因子WRKY家族成员MINISEED可以调控SYG1类蛋白SHB1的活性，从而参与到种子发育过程[7]。

而WRKY在植物花发育方面的研究也有相关的报道，在2011年Wang等发现转录因子WRKY参与了拟南芥的花粉形成[8]；而野生大豆的GsWRKY20异源过表达后，可通过影响花相关基因的表达量，从而影响了植物的开花时间[9]。

但罕见在葡萄生长发育过程中WRKY转录因子的相关报道，Terrier等2005年进行了葡萄浆果生长过程基因表达的研究，初步推测转录因子WRKY家族在这其中发挥重要作用[10]。

有报道称WRKY转录因子可以参与植株内激素等物质的生物合成，从而影响了植物的生长发育。

在最新的研究中发现，转录因子WRKY是ABA信号途径的关键组分，特别是有关于某些WRKY是ABA诱导的对种子发芽起到负作用证明，但是转录因子WRKY在ABA信号途径其他方面的作用以及作用机制一直不是很清楚。

ABA是一种重要的植物激素，在植物生长过程中发挥着重要作用，参与调控种子萌发，芽休眠，气孔运动，促进叶、花和果实脱落，引起块茎休眠、叶片衰老，促进果实产生乙烯和果实成熟等植物生长发育过程，同时参与植物体对干旱、盐胁迫和极端温度等胁迫响应[11]。

ABA调控生长发育方面发挥重要作用，前期在进行水稻愈伤组织、不定胚发育及其植株再生的研究时发现，ABA可以促进细胞的再生[12]；ABA能够调节花芽分化时期，影响花的形成[13]；黄独试管苗的生长和发育受低浓度ABA的诱导，但高浓度ABA却表现出明显的毒害作用[14]；ABA可以调控侧根的起始基因的表达、活化侧根的分生组织[15]。

近期关于ABA作用的研究有了更新的报道，内胚层的ABA可以促进盐胁迫调节下根系侧根（Quiescentcenter，QC）的细胞中细胞活性，从而影响胁迫[16]。

水稻中的OsPYLRCAR5可以在种子萌发和幼苗早期生长阶段起到促进作用[17]；HoaiNguyenNguyen等2013年发现TTG1调节的植物内黄酮醇的生物合成可以减弱ABA对根系生长的抑制作用[18]；生长素在种子休眠调控因子ABI3上游发挥作用，而且生长素的反应因子10和16通过控制ABA信号途径中的ABI3的表达调控种子休眠[19]，同年RongbinHu等研究ABA调控的种子成熟和幼苗生长时，也发现TAP46是拟南芥中调控PP2A活性的相关蛋白，从而参与了这个过程[20]。

Xiao等发现水稻的WRKY13参与调控拟南芥对生物胁迫和非生物相关的响应[21]；大豆的WRKY13异源过表达拟南芥株系对ABA敏感度下降，侧根数目和侧根长度明显优于野生型[22]。

近期在拟南芥中已经将WRKY定位于ABA信号途径过程中，并且在种子萌发过程中发挥这重要作用[23]。

此外，在拟南芥中，两个ABA受体（PYLRCAR和ABAR-ABA）是WRKY的下游组分，这些新的发现表明一些WRKY转录因子可以正向的参与ABA诱导的气孔关闭以及抗干旱胁迫[24]。

但是WRKY转录因子在ABA信号途径其他方面的作用以及机制还一直不是很清楚，而且至今未见WRKY13参与葡萄生长的研究报道以及葡萄生长过程中WRKY13和ABA之间的关系。

那么在葡萄生长过程中是否有WRKY和ABA的参与？

其功能又是如何？

本实验通过获得WRKY13异源表达植株，探究了葡萄WRKY13对植物生长的影响以及葡萄WRKY13异源表达植株对ABA的应答反应，对提高葡萄的产量和品质、增强我国葡萄在国际市场上的竞争力具有极为重要的现实意义。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1菌株及载体

菌株：

大肠杆菌菌株E.coliDH5α，农杆菌菌株GV3101由青岛农业大学植物逆境生理与分子生物学实验室提供。

克隆载体：

Super1300载体购自TaKaRa公司（大连）。

拟南芥选用哥伦比亚型。

1.1.2常用酶、化学药品、试剂盒

限制性内切酶、Ribonucleaseinhibitor、T4DNAligase、solutionI、DNaseI、TaqDNApolymerase、dNTP、ReverseTranscriptaseM-MLV、DL2000DNAMarker、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小量抽提试剂盒等均购自Takara公司（大连）；

氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）、卡那霉素（KanamycinMonosulfate，Kan）、利福平（Rifampicin，Rif）、潮霉素（Hygromycin，Hyp）等抗生素均购自Amerisco公司（U.S.A）；

其余化学试剂均为国产分析纯。

1.1.3实验仪器

Bio-RadMyCycler梯度PCR仪；Lightcycler480罗氏荧光定量PCR；Sigma台式高速离心机；EppendorfCENTRIFUGE5430R高速冷冻离心机；Amersham电泳设备；SHIMADZUUV-mini1240紫外分光光度计；自动型高温灭菌锅；-80℃超低温冰箱；振荡培养箱；哈东联紫外超净工作台；pH1211pH计；水浴锅；；恒温金属浴；Thermo微量移液器等其他常规仪器等。

1.2实验方法

1.2.1材料培养

大肠杆菌以LB培养基进行培养，添加相应抗生素后进行转化株系的筛选。

农杆菌菌以YEB培养基进行培养，添加相应抗生素后进行转化株系的筛选。

在MS固体培养基培养转基因拟南芥，添加相应的抗生素后进行筛选。

1.2.2材料处理

将同时期收获的经过在4℃条件下处理2-4d打破休眠的野生型和过表达种子（每种约150粒），点种于无菌12MS固体培养基，光照培养箱（22℃，14，后倒平板。

LB液体培养基：

胰蛋白胨10gL，酵母提取物5gL，NaCl10gL，pH7.0，灭菌锅中121℃高压灭菌20min。

YEB液体培养基：

胰蛋白胨10gL，酵母提取物1gL，蔗糖5gL，MgSO4·7H2O0.5gL，pH7.0，装瓶后在灭菌锅中121℃高压灭菌20min。

基上，铺板，37℃倒置培养10~16，电泳检测酶切效果。

1.2.5根癌农杆菌（GV3101）感受态细胞的制备及转化

活化-80℃超低温保存根癌农杆菌（GV3101）接种于3mLYEB液体培养基中（含50mgLRif），28℃振荡培养箱中振荡培养过夜。

活化后取500μL菌液加入到50mLYEB液体培养基中，28℃振荡培养箱中振荡至OD600为0.5左右（4℃，5000rpm）离心5min，收集菌体，放