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酶的工作机理读后感
环境生物化学文献读后感
班级:
环境0702
姓名:
郭雪
学号:
07233034
指导教师:
任福民
酶的作用机制及具体催化反应研究
酶催化反应机理的研究是当代生物化学的一个重要课题。
文章主要探讨酶反应的重要中间步骤以及酶工程的发展等。
通过阅读本文,我深入理解酶的结构与功能的关系,酶促反应和底物浓度关系动力学和酶抑制作用动力学,懂得米氏方程及其常数的运用,以及酶催化机理。
1酶的发展史
实际上,人类有意识地利用酶已经有好多年历史了,也经历了几个发展阶段,开始的时候,人们直接从动植物或微生物体内提取酶做成酶制剂,用于产品生产,这种方法直到现在仍被诞用。
比如说,现在我们使用的洗涤剂,大部分是加酶的,其去污力大大加强了。
此外,在制造奶酪、水解淀粉、酿造啤酒及砚烤制中,酶制剂都可以得到直接的应用。
在七十年代以后,伴随着第二代酶一一固定化酶及其相关技术的产生,酶工程才算真正登上了历史舞台。
固定化酶正日益成为工业生产的主力军,在化工医药、轻工食品、环境保护等领域发挥着巨大的作用。
不仅如此,还产生了威力更大的第三代酶,它是包括辅助因子再生系统在内的固定化多酶系统,它正在成为酶工程应用的主角。
2.酶催化机理的研究
酶的作用机制相关研究众多,且具体问题具体分析。
迁移转化机制固定化原则主张酶催化的发生是指酶紧紧结合过渡状态物其力度超过原先的反应物。
原始的概述轮廓和渐渐被接受的这种观点已经被
提出,且基本过渡状体理论也被评论。
它指出这种理论的错误观点使得已被接受关于酶的催化和绑定的表述过度简单化,同时一种修正的表达提出来了。
之后,对于过渡态绑定原则的表述的探索开始进行。
修订表述提出酶催化过程内部的分子动力学也发挥作用。
因为这种作用并非主导,他们的重要性完全不为人所知。
由于过渡态绑定原则的应用,近期发展有两个理论。
一个是锌蛋白酶机制,另一个是催化抗体的产生。
2.1过渡态稳定学说
根据过渡态理论,在任何一个化学反应体系中,反应物需要到达一个特定的高能状态以后才能发生反应。
这种不稳定的高能状态被称为过渡态。
达到过渡态要求反应物必须含有足够的能量以克服活化能,然而,一个反应系统中各反应物分子具有不同的能量,只有某些反应物才含有足够的能量去进行反应。
①1946年Pauling提出,酶与过渡态的亲和力要比对基态(底物)的亲和力高得多,酶的催化源于其对过渡态的稳定作用。
②H-Hb+Hc^Ha-Hb-Hc(过渡态)tHb-Hc+HA
反应历程
酶促反应和非酶促反应过程的自由能变化图
2.2支持过渡态稳定学说的证据
根据中间物的结构设计一种稳定的过渡态类似物,以检测它能否作为酶的抑制剂,以及抑制效果是不是比竞争性抑制剂强。
因为如果酶促反应中的确存在所谓过渡态的中间物,那么由此人工设计得到的过渡态类似物只要遇到酶就会与活性中心紧密地结合,会牢牢地卡住酶的活性中心,使之无法完成反应,即成为酶的强抑制剂。
进一步证明过渡态类似物参与催化的证据是利用过渡态类似物作为抗原或半抗原,去免疫动物,由此产生的抗体可能有类似酶的催化作用。
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过渡态
coo- NN HH 毗咯-2-竣酸毗咯碱-2-幾酸 脯氨酸消旋酶的过渡态及其过渡态类似物抑制剂图 2.3过渡态稳定的化学机制 与酶催化相关联的过渡态稳定是酶活性中心结构和反应性以及 活性中心与结合底物之间的相互作用的必然结果。 酶充分使用一系列的化学机制来实现过渡态的稳定并由此加速反应。 这些机制归纳起来主要有六种机制: (1)邻近定向效应; (2)广义的酸碱催化; (3)静电催化; (4)金属催化; (5)共价催化; (6)底物形变。 2.3.1邻近定向效应 邻近定向效应是指两种或两种以上的底物(特别是双底物)同时 结合在酶活性中心上,相互靠近(邻近),并采取正确的空间取向(定向),这样大大提高了底物的有效浓度,使分子间反应近似分子内反应从而加快了反应速度。 底物与活性中心的结合不仅使底物与酶催化基团或其它底物接 触,而且强行“冻结”了底物的某些化学建的平动和转动,促使它们 采取正确的方向,有利于键的形成。 由于化学反应速度与反应物浓度成正比,若在反应系统的某一局部区域,底物浓度增高,则反应速度也随之增高。 提高酶反应速度的最主要方法是使底物分子进入酶的活性中心区域,亦即大大提高活性 中心区域的底物有效浓度。 曾测到过某底物在溶液中的浓度为 0.001mol/L,而在其酶活性中心的浓度竟达100mol/L,比溶液中的浓度高十万倍! 因此,可以想象在酶的活性中心区域反应速度必定是极高的。 “靠近“效应对提高反应速度的作用可以用一个著名的有机化学实验来说明,双羧酸的单苯基酯在分子内催化的过程中,自由的羧 基作为催化剂起作用,而连有R的酯键则作为底物,受一C00的催化,破裂成环而形成酸酐,催化基团一COO愈靠近底物酯键则反应速度愈快,在最靠近的情况下速度可增加53000倍。 但是仅仅“靠近”还不够,还需要使反应的基团在反应中彼此相互严格地“定向”。 只有 既“靠近”又“定向”,反应物分子才被作用,迅速形成过渡态。 当底物未与酶结合时,活性中心的催化基团还未能与底物十分靠近,但由于酶活性中心的结构有一种可适应性,即当专一性底物与活性中心结合时,酶蛋白会发生一定的构象变化,使反应所需要的酶中的催化基团与结合基团正确地排列并定位,以便能与底物楔合,使底 物分子可以“靠近”及“定向”于酶,这也就是前面提到的诱导楔合。 这样活性中心局部的底物浓度才能大大提高。 酶构象发生的这种改变是反应速度增大的一种很重要的原因。 反应后,释放出产物,酶的构象再逆转,回到它的初始状态。 对溶菌酶及羧肽酶进行的X-衍 射分析的实验结果证实了以上的看法。 Jenek等人指出“靠近“及 “定向”可能使反应速度增长108倍,这与许多酶催化效率的计算是很相近的。 2.3.2广义的酸碱催化 广义的酸碱催化是指水分子以外的分子作为质子供体或受体参与催化,这种机制参与绝大多数酶的催化。 蛋白质分子上的某些侧链基团(如AspGlu和His)可以提供质子并将质子转移到反应的过渡态中间物而达到稳定过渡态的效果。 如果一个侧链基团的pKa值接近7,那么该侧链基团就可能是最有效的广义的酸碱催化剂。 蛋白质分子上的His残基的咪唑基就是这样的基团,因此它作为很多酶的催 化残基。 溶菌酶的Glu35被疏水氨基酸残基所环绕 核糖核酸酶A的广义酸碱催化 酶蛋白中含有好几种可以起广义酸碱催化作用的功能基,如氨基、羧基、硫氢基、酚羟基及咪唑基等。 其中组氨酸的咪唑基值得特别注意,因为它既是一个很强的亲核基团,又是一个有效的广义酸碱功能基。 影响酸碱催化反应速度的因素有两个,第一个是酸碱的强度,在这些功能基中,组氨酸咪唑基的解离常数约为6.0,这意味着由咪唑基上解离下来的质子的浓度与水中的[H+]相近,因此它在接近于生物体液pH的条件下,即在中性条件下,有一半以酸形式存在,另一半以碱形式存在。 也就是说咪唑基既可以作为质子供体,又可以作为质子受体在酶反应中发挥催化作用。 因此,咪唑基是催化中最有效最活泼的一个催化功能基。 第二个是这种功能基供出质子或接受质子的速度,在这方面,咪唑基又是特别突出,它供出或接受质子的速度十分迅速,而且供出或接受质子的速度几乎相等。 由于咪唑基有如此的优 点,所以虽然组氨酸在大多数蛋白质中含量很少,却很重要。 推测它很可能在生物进化过程中,不是作为一般的结构蛋白成分,而是被选择作为酶分子中的催化结构而存在下来的。 广义的酸碱催化与共价催化可使酶反应速度大大提高,但是比起前面两种方式来,它们提供的速度增长较小。 尽管如此,还必须看到它们在提高酶反应速度中起的重要作用,尤其是广义酸碱催化还有独到之处: 它为在近于中性的pH下进行催化创造了有利条件。 因为在这种接近中性pH的条件下,H+及0H的浓度太低,不足以起到催化剂的作用。 例如牛胰核糖核酸酶及牛凝乳蛋白酶等都是通过广义的酸碱催化而提高酶反应速度的。 233静电催化 静电催化是活性中心电荷的分布可用来稳定酶促反应的过渡态,酶使用自身带电基团去中和一个反应过渡态形成时产生的相反电荷而进行的催化称为静电催化。 有时,酶通过与底物的静电作用将底物引入到活性中心。 2.3.4金属催化 近三分之一已知酶的活性需要金属离子的存在,这些酶分为两 类,一类为金属酶,另一类为金属激活酶。 前者含有紧密结合的金属离子,多数为过渡金属,如Fe2+、Fe3+、CcU+、Zn2+、Mn或CO+,后者与溶液中的金属离子松散地结合,通常是碱金属或碱土金属,例如Naf、X、Mg+或CaT。 金属离子参与的催化被称为金属催化。 金属离子以5种方式参与催化: (1)作为Lewis酸起作用; (2)与底物结合,促进底物在反应中正确定向;(3)作为亲电催化剂,稳定过渡态中间物上的电荷; (4)通过价态的可逆变化,作为电子受体或电子供体参与氧化还原反应;(5)酶结构的一部分 2.3.5共价催化 共价催化是指酶在催化过程中必须与底物上的某些基团暂时形成不稳定的共价中间物的一种催化方式。 许多氨基酸残基的侧链可作为共价催化剂,例如Lys、His、Cys、Asp、Glu、Ser或Thr,此外,一些辅酶或辅基也可以作为共价催化剂,例如硫胺素焦磷酸(TPP和磷酸吡哆醛。 这种方式是底物与酶形成一个反应活性很高的共价中间物,这个中间物很易变成过渡态,因此反应的活化能大大降低,底物可以越过较低的“能阈”而形成产物。 共价催化可以提高反应速度的原因需要从有机模式反应的某些 原理谈起,共价催化的最一般形式是催化剂的亲核基团 (nucleophilicgroup)对底物中亲电子的碳原子进行攻击。 亲核基团含有多电子的原子,可以提供电子。 它是十分有效的催化剂。 亲核基团作为强有力的催化剂对提高反应速度的作用可由下面亲核基团催化酰基的反应中看出: 第一步,亲核基团(催化剂Y)攻击含有酰基的分子,形成了带有亲核基团的酰基衍生物,这种催化剂的酰基衍生物 作为一个共价中间物再起作用;第二步,酰基从亲核的催化剂上再转移到最终的酰基受体上,这种受体分子可能是某些醇或水。 第一步反应有催化剂参加,因此必然比没有催化剂时底物与酰基受体的反应更快一些;而且,因为催化剂是易变的亲核基团,因此如此形成的酰化催化剂与最终的酰基受体的反应也必然地要比无催化剂时的底物与酰基受体的反应更快一些,此两步催化的总速度要比非催化反应大得多。 因此形成不稳定的共价中间物可以大大加速反应。 酶反应中可以 进行共价催化的、强有力的亲核基团很多,酶蛋白分子上至少就有三种,即表中所指出的丝氨酸羟基、半胱氨酸巯基及组氨酸的咪唑基。 此外,辅酶中还含有另外一些亲核中心。 共价结合也可以被亲电子基团(electrophilicgroup)催化。 丝氨酸类酶与酰基形成酰基-酶;或与磷酸基形成磷酸酶,如磷酸葡萄糖变位酶。 半胱氨酸类酶活性中心的半胱氨酸巯基与底物酰基形成含共价硫酯键的中间物。 组氨酸类酶 活性中心的组氨酸咪唑基在反应中被磷酸化。 赖氨酸类酶的赖氨酸 £-氨基与底物羰基形成西佛碱中间物。 几种酶的共价催化 亲核基团 实例 共价中间物 Serf—OH) 丝氨酸蛋白酶 脂酰化酶 Cys(—SH} 半胱氨酸蛋白酶 脂酰化酶 Asp(一COO~) ATP酶 磷酸化酶 Lys(£—NH2) 乙酰乙酸脱竣酶 Schiff氏破 His(味哇墓) 磷酸甘油酸变位酶 磷酸化酶 Tyi(—OH) 谷氨酰胺合成酶 腺昔酸化酶 活化的酮基 亲核共价修饰反应 236底物形变 底物形变是指当酶与底物相遇时,酶分子诱导底物分子内敏感键更加敏感,产生“电子张力”发生形变,比较接近它的过渡态。 当酶遇到它的专一性底物时,发生构象变化以利于催化。 事实上,不仅酶构象受底物作用而变化,底物分子常常也受酶作用而变化。 酶中的某些基团或离子可以使底物分子内敏感键中的某些基团的电子云密度增高或降低,产生“电子张力”,使敏感键的一端更加敏感,更易于发生反应。 有时甚至使底物分子发生变形,这样就使酶-底物复合物易于形成。 而且往往是酶构象发生改变的同时,底物分子也发生形变,从而形成一个互相楔合的酶-底物复合物。 羧肽酶A的X-衍射分析结果就为这种“电子张力”理论提供了证据。 溶菌酶也利用这种方式进行催化: 与溶菌酶活性中心结合的6碳糖在溶菌酶的诱导下,从椅式构象变成半椅式构象而发生形变,周围的糖苷键更容易发生断裂。 H 3.酶促反应动力学 酶促反应动力是研究酶促反应速度及其影响因素的科学。 这些因 素主要包括酶的浓度、底物的浓度、pH温度、抑制剂和激活剂等。 在研究某一因素对酶促反应速度的影响时,应该维持反应中其它因素不变,而只改变要研究的因素。 但必须注意,酶促反应动力学中所指明的速度是反应的初速度,因为此时反应速度与酶的浓度呈正比关系,这样避免了反应产物以及其他因素的影响。 酶促反应动力学的研究有助于阐明酶的结构与功能的关系,也可为酶作用机理的研究提供数据;有助于寻找最有利的反应条件,以最大限度地发挥酶催化反应的高效率;有助于了解酶在代谢中的作用或某些药物作用的机理等,因此对它的研究具有重要的理论意义和实践意义。 3.1米曼氏方程式 解释酶促反应中底物浓度和反应速度关系的最合理学说是中间产物学说。 酶首先与底物结合生成中间产物,此复合物再分解为产物和游离的酶。 Michaelis和Menten在前人工作的基础上,经过大量的实验,1913年前后提出了反应速度和底物浓度关系的数学方程式,即著名的米曼氏方程式。 V=Vna)[S]/Km+[S] Vmax指该酶促反应的最大速度,[S]为底物浓度,Km是米氏常数,V是在某一底物浓度时相应的反应速度。 当底物浓度很低时,[S]《Km, 则gVmax/Km[S],反应速度与底物浓度呈正比。 当底物浓度很高时, [S]》Km此时gVmax反应速度达最大速度,底物浓度再增高也不影响反应速度。 3.2米氏方程局限性 a.其动力学只适合于单底物反应过程,对多底物多产物反应不适用。 b.对多酶体系催化的过程不能作很好的解释。 c.不适合于变构酶催化的反应。 d.不能直接用来求Vmax 3.3Km的意义及应用 a.计算反应速度v达到Vmax的百分率,确定v达到Vmax的[S]; b.判断酶和底物亲和力的大小,寻找天然底物,判断在细胞中酶催化反应的主要方向; c.寻找连锁反应的限速步骤; d.作为判断同工酶的依据。 4.固定化酶 4.1固定化酶的优点 酶经过固定化处理一般稳定性有较大提高,对热、pH等的稳定 性提高,对抑制剂的敏感性降低,有的酶具有了抗蛋白酶分解的特性; 反应完成后经过简单的过滤或离心酶就可以回收,而且酶活力降低较少,降低了生产成本; 固定化体系适合于连续化、自动化生产,催化过程容易控制,且 产品中不会带进酶蛋白或细胞,改善了后处理过程,提高了酶的利用 效率4.2固定化酶(细胞)的应用实例 工业生产,如: 拆分DL-氨基酸;利用固定的葡萄糖异构酶将葡萄糖转化为果糖。 医疗方面应用,如: 固定化酶小型人工肾。 制作生物传感器,如: 固定化葡萄糖氧化酶传感器、青霉素电极、海洛因酯酶传感器。 环保方面应用,如: 环境监测,处理工业废水 血液入口血液岀口 由微小胶襄型固定化砾酶制成小型人工肾模式国 5.酶法分析一般方法 5.1总量分析法 适合于底物类物质测定,根据被测物质的性质选择适当的工具 酶,对该物质进行作用,在反应完成后,借助物理化学方法,测出其总量变化,从而计算出被测物质实际含量或浓度。 5.2动力学法通过条件控制,使待测物(如底物、辅酶、抑制剂等)的浓度在酶反应中起决定反应速度的作用,这时酶反应速度和待测物浓度间将有确定的比例关系,于是根据测得的酶反应物速度即可求得待测物的浓度。 5.3酶偶联分析法某些酶反应的产物不易测定时,可用过量、高度专一的偶联工具酶使被测酶反应能继续进行到某一可直接、连续、简便、准确测定阶段。 例: 己糖激酶活力测定,该方法的关键是偶联工具酶应高纯度、专一且过量,以保证被测反应速度是总反应系统中速度限制因子,且和酶浓度间是线性关系。 5.4放射免疫分析法 放射免疫分析(rediolimmunoasslyRIA)是将放射性同位素作为标记物质,使之和抗原(或抗体)结合形成复合物,然后再根据待测抗体(或抗原)与复合物专一且定量的结合关系,通过测定待测抗体(或抗原)结合的同位素放射性活力,从而计算出抗原或抗体的量。 6.酶学研究的新领域 6.1抗体酶 抗体酶(abzyme)又称催化抗体(catalyticantibody),是指通过一系列化学与生物技术方法制备出的具有催化活性的抗体,它除了具有相应免疫学性质,还类似于酶,能催化某种活化反应。 抗体与酶相似,都是蛋白质分子,酶与底物的结合及抗体与抗原的结合都是高度专一性的,但这两种结合的基本区别在于酶与高能的过度态分子向结合,而抗体则与抗原(基态分子)相结合。 利用抗体能与抗原特异结合的原理可用过度态类似物作为半抗原来诱发抗体,这样产生的抗体便能特异地识别反应过程中真正的过渡分子,从而降低反应的活化能。 达到催化反应的目的,这种具有催化功能的抗体就被称为催化抗体或抗体酶。 6.2基因工程抗体酶的制备 对已产生的单抗,分析氨基酸的组成或相应基因的碱基序列,对抗体结合的部位的基因进行定位突变,在抗体结合部位换上有催化活性的氨基酸,基因工程的技术使得建立抗体基因的组合文库,并根据需要构建适当程序的基因片段成为可能。 6.3抗体酶的筛选 在抗体酶研究中,一个不可少的步骤是在细胞融合后筛选到能分泌催化抗体的细胞克隆。 一般的方法是先筛选其抗体能结合特异抗原的细胞克隆,再从纯化的抗体中筛选出有催化能力的单抗。 主要筛选方法有生物学筛选法和纯化学筛选法。 催化抗体的出现不仅为人们开创了一条人工设计酶的新方法,也使人们对催化过程中催化剂的作用机理和催化剂和底物的相互识别有了进一步认识。 目前已经发现具有催化作用的自身抗体在生物体内的存在,其不仅和疾病相关,可能还参与了生物体内的某些或基本的生物学反应有可能成为抗体酶研究的新热点 充分利用抗体的种类繁多以及抗体酶的可诱导、可改造的特点, 可望制备出具有治疗和辅助治疗某些疾病或催化某类具有特殊意义反应的抗体酶。 抗体酶的研究无疑会对化学、生物学、医学等领域产生深远影响。 6.4极端微生物和极端酶 在绝大多数微生物所不能生长的极端恶劣的环境(高温、低温、高盐、酸、硷)中能栖息生长的微生物叫做“极端微生物”(extre),大部分极端微生物古细菌,也有部分极端微生物属于最原始的细菌种类,它们在进化树上的位置可能位于根部。 从广义上讲,将那些可在非常规条件下作用的酶称为极端酶 (extremozyme),据来源可分为三种: 从极端微生物(细胞)中分离得到的酶; 来源于常规微生物(细胞)但能在极端条件下起催化作用的酶; 通过人工改良方法或人工全合成技术制造出的具有新型催化活力的酶。 极端酶之所以在极端环境下有着与普通酶不同的活力和稳定性,其根本原因是它们在三维结构上的特殊性。 嗜热酶和超嗜热酶: 高温谷氨酸脱氢酶和柠檬酸合成酶的结构的研究表明了离子相互作用在嗜热酶中的重要性,但是,高温稳定性和离子相互作用的正比关系并不是普遍存在的。 嗜冷酶: 在低温下保持活是由于具有比常温同工酶更柔软的结构,对具有低温活性的柠檬酸合成酶结构分析表明其活性部位的柔韧性来自于酶扩展的表面电荷环和酶表面上脯氨酸残基的减少,另外,嗜冷酶也必须进行结构调整以避免蛋白质的低温变性,通常是通过减少低温下的疏水相互作用和有较多的离子偶联,推测这可以用来防止低温诱导蛋白质的解折叠。 嗜盐酶: 氨基酸序列的分析比较表明嗜盐酶蛋白质比它们的普通 同工酶含的酸性氨基酸更多,X射线晶体和同源性模拟分析揭示的三维结构表明这些酶的表面有大量带负电荷的氨基酸,这种带负电荷的酶蛋白表面可以结合大量水合离子,形成一个水合层,减少它们表面的疏水性,从而减少在高浓度盐度下的聚合的趋势。 极端酶的深入研究和广泛应用预示着化学工业、食品工业和制药工业的一场革命,上述工业若采用适合各种条件下的酶法可大大减少毒副产物的生成,使其有望成为“清洁”产业。 如果能够较为清楚地了解极端酶稳定性和活力结构基础,就可以通过蛋白质工程技术及其它相关科学成果如计算机处理技术,合成新型的、作用范围更广的极端酶。 随着人们对化学反应机理研究的不断深入,利用酶对反应物过度态的稳定作用而降低活化能的原理,可设计出具有酶活性的抗体酶。 可以相信,抗体酶将成为极端酶人工合成开辟一条捷径。 7.结论 酶作用机理尤其催化作用是本世纪一个极具魅力的挑战性课题之一。 目前,许多研究工作者正致力于这一新领域的探索,人们在发掘新酶,进而对其分离提纯,深入研究结构及催化机理,用自然酶及模拟酶来催化合成新产物,以期在认识自然和改造自然的过程中,不断走向自由王国。 我们知道,人体每一个细胞中就有成千上万种酶,但是被人们鉴定和认识的酶却很少,而能够大规模生产和应用的才十多种,因此,这方面的研究无论在学术意义和应用价值方面,都具有无限广阔的前景。 我们相信,随着生物学、化学及其他学科的发展,酶催化反应的机制将会被人们认识和掌握,酶催化合成的应用也会越来越广泛,酶法和化学法相结合将会使有机合成化学真正成为一门 “艺术”这方面的突破将是令人鼓舞的。
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