用慢病毒RNA干扰系统研究精子发生相关基因znf230的功能.docx
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用慢病毒RNA干扰系统研究精子发生相关基因znf230的功能
摘要:
项目研究内容和意义简介(限400字):
RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是由双链RNA介导的序列特异性的mRNA降解所致的转录后基因沉默过程。
RNAi技术可方便快捷地研究基因的功能,并用于功能基因的筛选。
本课题拟采用RNAi及胚胎干细胞体外定向分化技术,将我室新克隆的精子发生相关基因znf230的siRNA通过慢病毒(Lentivirus)系统引入小鼠胚胎干细胞,体外模拟精子发生过程,而在细胞水平上研究znf230基因表达受抑后对生精的影响,同时结合基因表达谱芯片及蛋白组二维电泳-质谱技术实现基因功能性及蛋白质表达筛查,以期全面研究该基因的功能。
上述技术平台的建立将提供一个精子发生相关基因功能研究的模型,亦为RNAi技术的应用研究拓展了新的思路。
这一设想尚未见文献报道,如能证明其合理有效,将成为难于鉴定表型且异常表达的基因功能研究的通用模型,并在后续蛋白组学及基因相关药物的研发中发挥重要作用。
报告正文
(一)立项依据与研究内容(4000-8000字):
1.项目的立项依据(附主要的参考文献目录)
人类基因图谱解码已经完成。
进入功能基因组学时代后,疾病相关基因以及重要功能基因的分离、定位、克隆表达已日益加速。
而随着新基因的分离与鉴定,对这些基因的功能进行系统的研究将成为这一时期的主要任务。
因此,建立或开发新的或实用的基因功能研究技术平台具有重要意义。
在功能基因组研究中,酵母杂交系统、DNA芯片、反义RNA、基因敲除(geneknock-out)等技术为解读基因功能提供了有效的手段。
其中基因敲除虽是基因功能研究的经典技术[1],但由于外源及靶DNA发生同源重组的几率极低,重组体的筛选及检测即成为该技术的瓶颈,难以适应大规模的基因功能研究。
近年来发展起来的RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术作为特异性抑制基因表达的方法,已成为生命科学领域研究的热点。
其优点是可以简便地制备特定基因缺失表型的个体,较快捷地研究目的基因的功能,并使系统性、高通量功能基因筛选成为可能。
RNAi现象首先在秀丽新小杆线虫(C.elegans)中被发现。
它通过双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)介导的同源靶mRNA的特异性降解,在转录后水平使基因沉默(PostTranscriptionalGeneSilencing,PTGS)[2,3]。
RNAi技术现已成功运用于线虫、果蝇、植物、真菌和脊椎动物等生物体的功能研究中[4,5],而在哺乳动物细胞内转染21-25nt长度的siRNA也可以诱导特异性的基因沉默[6],虽然这种效应具有瞬时性。
目前,多个研究小组[7-10]已将靶向特异基因的shRNA表达质粒导入细胞,在聚合酶Ⅲ依赖性H1或U6启动子控制下获得siRNAs的持续表达并导致了靶基因特异、持续的下调,这为RNAi用于长期功能缺失型研究提供了新的思路。
然而,目前在RNAi应用研究中仍存在如下一些问题亟待解决,如:
1)shRNA表达载体对某些靶基因虽能取得较明显的RNAi效应,但多数仍呈瞬时性,且受到转染效率、细胞类型等因素的限制,难以获得长期的“knockdown”效应。
2)并非所有的组织或细胞的靶基因对RNAi敏感;某些基因的表型鉴定本身就存
在困难,一定条件下需用特定的基因传递系统在模型中加以证实。
3)目的基因序列上siRNA模板的选择无统一标准。
实际操作中往往是试探性的,选
择不同序列RNAi效应差别大,抑制率可从0~90%不等。
因此,建立高效、稳定长期表达的RNAi传递系统正是该领域目前研究的关键。
虽然逆转录病毒的运用能有效地降低靶基因的表达[11],但MMLV类病毒自身特点及对细胞类型的选择性使其应用受到一定的限制。
当前,新型第三代慢病毒(Lentivirus)系统正以其高效、稳定的特性在RNAi研究中倍受关注。
Lentivirus来源于HIV-1病毒,其宿主细胞范围广泛,包括分裂细胞、非分裂细胞、原始细胞等,且转基因在生殖系统中可稳定传递[12,13]。
Pfeifer[14]等的研究结果表明,Lentivirus介导的转基因均可在鼠胚胎干细胞(EmbryonicStem,ES)体内、外分化过程中表达,将Lentivirus感染的ES细胞注入胚泡期或桑椹期胚胎,发育的新生鼠及其子代的多种组织中均可检测到转基因。
Tiscornia[15]等将沉默GFP的Lentivirus感染GFP阳性转基因鼠卵细胞,发现新生鼠体内GFP荧光蛋白的表达明显降低。
Rubison[16]等运用CD8/CD25siRNA的Lentivirus载体转染鼠ES细胞,生成了“knockdown”转基因鼠,其效应维持长达30天之久并可传递下一代,充分显示了该方法的优越性。
精子发生是一个复杂的多阶段的细胞分化过程,涉及生精细胞的生长、分裂、分化和信号传递等,要求一系列基因表达的精确调控[17,18]。
这些基因的异常将导致精子发生障碍,表现为寡精症或无精症。
近年来我室分离克隆了一系列可能与精子发生相关的基因[19-22],目前已初步阐明了这些基因的结构与表达,如ZNF230在无精症患者睾丸组织中无表达,znf230在小鼠睾丸内特异表达且可能在精细胞(spermatid)形成阶段起重要作用[22]。
由于生精过程极其复杂,这些基因的调控及其生物学功能尚未明了。
为探索此类问题,首先需建立供研究的模型系统。
2003年末,ToshiakiNoce研究小组[23]成功地将小鼠ES细胞在体外定向分化成精子。
研究中,悬浮培养的ES细胞在BMP4刺激及拟胚体立体空间构型的影响下向原始生殖细胞(primordialgermcells,PGCs)分化,具PGCs性质的ES细胞aggregation移植至裸鼠的睾丸囊中即可发育成成熟的精子。
此外,Daley及Geijsen等研究小组[24]也报道了ES细胞体外分化成精子的新进展。
基于以上RNAi研究所取得的成果,结合鼠ES细胞体外定向分化新技术,我们设想如能将Lentivirus系统引入小鼠ES细胞使之长期稳定表达、发挥RNAi效应,则可模拟兴趣基因在特定疾病中的异常表达情况,进而确定其功能。
因此,可将ES细胞在体外定向分化成精子,即体外模拟精子发生过程,在细胞水平上研究某一精子发生相关基因表达受抑后对生精的影响,以期全面研究该基因的功能。
鉴于此,本课题在前期研究工作的基础上,拟运用生物信息学及RNAi载体构建新技术对我室新克隆的基因znf230(GenBankID:
AF353167)进行有效siRNA序列筛选、靶位证实,生成高效表达的Lentivirus载体系统并引入小鼠ES细胞,阻断znf230的表达(6个有效的shRNA串联片段使RNAi抑制率至少达90%以上)。
在精子体外分化模型的细胞水平上,为了有效地获取精子发生过程中znf230相关基因的表达、网络调控及其功能信息,将结合基因表达谱芯片技术的高通量、快速、敏捷、平行性等特点,对照研究znf230表达被抑后表达谱的变化,以实现高通量的基因功能性筛查;同时运用经典的蛋白组学二维电泳-质谱技术来研究znf230被抑制后的蛋白表达变化,实现对蛋白质的表达进行原位筛查,以期分离鉴定有功能意义的蛋白。
目前国内对RNAi的研究刚刚起步,我们利用LentivirusRNAi系统建立的znf230基因功能研究方法,在设计理论与技术上均与国际上的有关研究位于同一起点。
上述技术平台的建立将提供一个精子发生相关基因功能研究的模型,亦为RNAi技术的应用研究拓展了新的思路。
这一设想尚未见文献报道,如能证明其合理有效,将成为难于鉴定表型且异常表达的基因功能研究的通用模型,并在后续蛋白组学及基因相关药物的研发中发挥重要作用。
参考文献
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2.项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。
研究目标:
(1)通过在ES细胞水平的功能研究,阐明znf230在精子发生过程中所起的作用;
(2)利用RNAi及ES细胞体外定向分化技术,明确znf230在精子发生何阶段起作用;
(3)结合基因表达谱芯片及蛋白组二维电泳-质谱技术实现基因功能性及蛋白质表达筛查,以期获得与znf230相关的基因网络调控信息并分离鉴定有功能意义的蛋白;
(4)利用LentivirusRNAi系统建立一种精子发生相关基因功能研究的模型。
研究内容:
(1)Lentivirus高效表达载体系统的构建;
(2)Lentivirus病毒生产及感染小鼠ES细胞;
(3)ES细胞体外定向分化模型的建立;
(4)宿主鼠精子细胞的收集、分析鉴定;
(5)体外培养FACS纯化的圆形精细胞,结合基因表达谱芯片及蛋白组二维电泳-质谱技术实现基因功能性及蛋白质表达筛查。
拟解决的关键问题:
(1)Lentivirus高效表达载体系统的构建是本课题的关键:
运用生物信息学及最新载体构建技术(Lentivirus载体携带6个串联shRNA),对有效的znf230siRNA片段进行筛选、靶位证实,以使RNAi抑制靶基因的效率至少达90%以上。
我们将同专业从事RNAi的研究机构合作,开发有效的靶向znf230的Lentivirus载体系统。
(2)ES细胞体外定向分化模型的建立是本课题的关键。
操作中,我们将Lentivirus载体自身携带的GFP报告基因用于ES细胞分化过程的鉴定,代替了文献中GFP或Laczknock-in载体的构建,而只需用FACS分选即可达到同样的目的。
这将大大降低实验技术性难度,增加了操作的可行性。
分化实验中的其他技术和方法基本上是成熟的实验方法或有相关文献可以参照。
因此,ES细胞体外分化模型的建立将不存在技术难题。
(3)基因表达谱芯片技术及蛋白质二维电泳-质谱技术亦是本课题研究的关键:
基因芯片可以与专业从事芯片研究开发的公司合作;申请者所在的人类疾病基因组学研究室是教育部人类疾病生物治疗重点实验室的一部分,拥有先进的供蛋白组学研究用的设备及仪器,并有此方面丰富的经验,因此经典蛋白组学研究方面将不存在技术及方法学方面的问题。
3.拟采取的研究方案及可行性分析
研究方法:
主要研究方法包括:
RNAi、生物信息学、DNA分子克隆技术如表达载体的构建、Lentivirus病毒的包装及生成、ES细胞培养技术、RT-PCR、细胞免疫组织化学技术、流式细胞检测及细胞分选技术、Aggregates移植技术、基因表达谱芯片技术、二维电泳-质谱技术等。
技术路线:
(用下列流程图表示)
运用生物信息学设计有效的21ntznf230siRNAs,进行靶位筛选、证实,设立阴性对照,合成shRNAoligos
运用最新RNAi载体构建技术将6个shRNA串联插入Lentivirus表达载体(包括阴性及空白对照)
Lentivirus病毒生产、滴度测定
Lentivirus病毒感染ES细胞、FACS分选GFP阳性ES细胞
GFP阳性ES细胞体外与表达BMP4的M15细胞共培养至aggregation或EB形成,鉴定Mvh阳性表达的EB,FACS2次纯化1天coaggregate培养的上述混合细胞
In-vitro
孕鼠E13.5雄性胚胎性腺细胞的准备
混合培养16h,生成的aggregates移植入CD-1(ICR)雄性裸鼠睾丸囊内
生精判断
收集精子、进行鉴定
无精子产生
精子生成
分离圆形spermatid,体外培养、扩增
鉴定细胞发育阻滞在减数分裂何期?
初步确定znf230基因的生物学作用
基因表达谱芯片及二维电泳-质谱技术筛查基因及蛋白表达变化
综合分析znf230基因功能、结论
实验方案:
(1)Lentivirus载体构建:
运用计算机生物信息学,对znf230siRNA靶序列进行筛选、靶位证实,将6条最佳的shRNAs串联构建入LentiLox3.7,如下图所示。
.
(2)Lentivirus病毒生产及感染ES细胞:
利用重组LentiLox3.7及包装病毒VSVG、RSV-REV、pMDLg/pRRE按Lentivirus生成程序生产高滴度Lentivirus,感染小鼠E14TG2aES(XY)细胞,FACS分选GFP阳性克隆。
实验中包括阴性及空白对照Lentivirus感染组。
(3)ES细胞体外定向分化实验:
A)体外悬浮共培养表达BMP4的M15滋养层细胞与GFP阳性ES克隆,以生成细胞集结(aggregation)及拟胚体(Embryoidbody,EB)。
B)运用RT-PCR鉴定Oct4、Mvh、Gfp、Fragilis、Stella、BMP8b基因的表达,运用免疫组织化学技术证实GCNA1及SYCP3(原始生殖细胞特异)的表达。
C)运用FACS2次纯化A)中共培养ES细胞及M15细胞1天后混合物,使纯化率>95%。
D)获取E13.5孕鼠(Slc:
ICR)雄胚胎性腺细胞,与C)细胞共培养16h,生成的细胞集结移植入CD-1(ICR)雄性裸鼠睾丸囊内。
实验中设立性腺细胞、未分化ES细胞、未纯化ES细胞移植对照组。
(4)精子生成分析、鉴定:
移植6-8周后,分离由ES细胞发育的曲精管,观测精子的形成。
如无精子发生,制作曲精管切片,用细胞遗传学方法确定精子发生阻滞的阶段;若有精子发生,收集精子,检测相关精子生物学指标,并与对照组比较。
(5)体外培养圆形精细胞:
若有精子发生,分离圆形精细胞,FACS分选鉴定并进行体外培养、增殖。
(6)基因及蛋白表达筛查:
利用基因表达谱芯片技术,对照研究圆形精细胞基因表达的变化,并在此基础上运用2D-PAGE-质谱技术对照研究圆形精细胞蛋白表达的变化,并由此分离鉴定有功能意义的蛋白。
(
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