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关于灵杞黄斑颗粒的薄层鉴别研究
【编者按】医药论文是科技论文的一种是用来进行医药科学研究和描述研究成果的
论说性文章。
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关于灵杞黄斑颗粒的薄层鉴别研究
作者:
姚慧娟,胡道德,顾磊,金剑,刘皋林
【摘要】目的建立灵杞黄斑颗粒的质量控制方法,为控制其产品质量提供依据。
方
法采用薄层色谱法对处方中肉苁蓉、枸杞子、灵芝、当归、川芎和丹参等主要药味进
行定性鉴别研究。
结果灵杞黄斑颗粒中肉苁蓉、枸杞子、灵芝、当归、川芎和丹参的
薄层色谱上具有鉴别特征,色谱斑点清晰,Rf值适中,阴性对照无干扰。
结论鉴别方
法简便可靠,专属性强,重复性好,可用于灵杞黄斑颗粒的定性质量控制。
1
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【关键词】灵杞黄斑颗粒;薄层鉴别;肉苁蓉;枸杞子;灵芝;当归;川芎;丹参
Abstract:
ObjectiveToestablishthequalitycontrolmethodforLingqihuangbanGranules
byTLCidentification.MethodsHerbaCistanchesDeserticolae,FructusLycii,Ganoderma
Lucidum,RadixAngelicaeSinensis,RhizomaChanxiongandRadixSalviaeMiltiorrhizaein
LingqihuangbanGranuleswereidentifiedbyTLC.ResultsHerbaCistanchesDeserticolae,
FructusLycii,GanodermaLucidum,RadixAngelicaeSinensis,RhizomaChanxiongand
RadixSalviaeMiltiorrhizaeinLingqihuangbanGranulescouldbedetectedby
TLC.ConclusionThismethodissimple,accurate,selectiveandhighlyreproducible.Itcanbe
usedforthequalitycontrolofLingqihuangbanGranules.
Keywords:
LingqihuangbanGranules;TLC;HerbaCistanchesDeserticolae;Fructus
Lycii;GanodermaLucidum;RadixAngelicaeSinensis;RhizomaChanxiong;RadixSalviae
Miltiorrhizae
灵杞黄斑颗粒是在中医理论的基础上,结合眼科临床实践开发的医院制剂,主要用
于治疗干性年龄相关性黄斑变性(age-relatedmaculardegenerationARMD)疾病。
从
ARMD病理机理上分析,许多患者的病因可能与活性氧中间物的积累有关,氧自由基
过多或清除过慢,从而诱发黄斑变性[1]。
灵杞黄斑颗粒由肉苁蓉、菟丝子、枸杞子、
灵芝、当归、川芎、丹参等10味药材组方而成,具有补肾温阳、益气健脾、活血生
精、通络明目之功效。
其中提取物肉苁蓉总苷具有抗氧化、抗脂质作用[2];菟丝子具有
滋补肝肾、明目等作用[3];枸杞子多糖具有抗脂质过氧化等作用[4]。
该制剂经过多年临
2
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床实践,对ARMD有较好的疗效。
为了更好地控制药品质量,建立该制剂完善的质量
标准,本实验对方中的肉苁蓉、枸杞子、灵芝、当归、川芎和丹参6味中药进行薄层
鉴别研究。
1材料与仪器
1.1材料和试剂
灵杞黄斑颗粒(上海炼塘中药厂,三批批号分别为:
20080501、20080502、
20080503);阴性对照样品(上海炼塘中药厂提供);毛蕊花糖苷对照品(批号:
111530-
200303),原儿茶醛对照品(批号:
110810-200506),灵芝对照药材(批号:
120968-
200203),枸杞子对照药材(批号:
121072-200505),当归对照药材(批号:
120927-
200613),川芎对照药材(批号:
120918-200809),均购自中国药品生物制品检定所;硅胶
G薄层板购于中国药品生物制品检定所;所用试剂均为分析纯。
1.2仪器电子分析
天平(梅特勒-托利多仪器有限公司,型号:
AL104);台式离心机(上海安亭科学仪器
厂,型号:
TDL-60B);数控恒温浴锅(上海申胜生物技术有限公司,型号:
W2010);超声
仪(上海科导超声仪有限公司,型号:
SK3300H)。
3
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2方法与结果
2.1肉苁蓉的薄层色谱鉴别
取本品颗粒15g,研细,加甲醇20ml,超声提取30min,滤过,滤液浓缩至1ml,
作为供试品溶液。
取毛蕊花糖苷对照品,加甲醇制成每1毫升含2.5mg的溶液,作为
对照品溶液。
另取缺肉苁蓉的阴性样品15g,同供试品溶液制备方法,制备成缺肉苁
蓉的阴性对照溶液。
照薄层色谱法[5]实验,吸取供试品溶液、对照品溶液及缺肉苁蓉
药材的阴性对照溶液各5l,分别点于同一硅胶G薄层板上,以醋酸乙酯:
甲醇:
9%
醋酸溶液(15∶3∶2)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%三氯化铁乙醇溶液。
供
试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
阴性对照无干扰。
结果见图1。
2.2枸杞子的薄层色谱鉴别
取本品颗粒15g,研细,加甲醇30ml,加热回流30min,放冷,滤过,滤液蒸干,
残渣加水10ml使溶解,用醋酸乙酯振摇提取2次,20ml/次,合并醋酸乙酯液,蒸
干,残渣加醋酸乙酯1ml使溶解,作为供试品溶液。
取枸杞子对照药材1g,加水30
ml,加热回流30min,放冷,过滤,滤液自上述用醋酸乙酯振摇提取2次起,同法
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制成对照药材溶液。
另取缺枸杞子药材的阴性样品15g,同供试品溶液制备方法,制
备成缺枸杞子的阴性对照溶液。
照薄层色谱法[6]实验,吸取供试品溶液、对照药材溶
液及缺枸杞子药材的阴性对照溶液各10l,分别点于同一硅胶G薄层板上,以醋酸乙
酯:
氯仿:
甲酸(3∶2∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365nm)下检
视。
供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
阴性
对照无干扰。
结果见图2。
2.3灵芝的薄层色谱鉴别
tips:
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运动配合中药及艾灸对慢性疲劳综合症大鼠行为
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自从1988年由Holmes等[1]将慢性或反复发作的极度疲劳为特征的症候群命名为慢
性疲劳综合症(ChronicFatigueSyndrome,CFS)以来,世界很多国家的学者对此进行研
究,拟定了相应的诊断标准。
该病的发生与长期精神紧张,脑力、体力长期过度劳累,并与神经、体液调节和免
疫功能失调有关。
特别是脑力劳动者尤为突出,对社会影响大,还没有安全、有效的
药物和方法治疗,护理调养费用较高,给社会卫生福利部门造成较大的压力[2],因此引起
了世界各国的广泛重视,开展了有针对性的研究。
近年来,我国也开展有关CFS的基
础与临床方面的研究工作,在发病机理,影响因素,症状表现等多有涉及。
有关中医
药治疗CFS的疗效与机理报道较多,但将运动配合中医药防治CFS的研究较少。
研究有关CFS模型的建立,不同学者方法不尽相同,我们采用慢性束缚、电击、冰
水游泳无规律进行刺激的复合方法建立了包含体力和精神的慢性疲劳动物模型[3]。
动
物身体和精神的疲劳一定程度反映在动物行为和免疫状态上,根据慢性疲劳综合症和
祖国医学对疲劳的治疗原则,本文拟通过观察动物行为和外周血淋巴细胞凋亡的改变,
从动物行为学和免疫学角度来探讨慢性疲劳综合症发生机制,并观察运动配合疏肝健
脾中药和艾灸足三里对其调理作用。
1材料与仪器
1.1实验对象由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供SPF级健康雄性Sprague-
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Dawley大鼠48只,2月龄,体质量196~247g,在中国人民解放军第二军医大学基础
部神经生物试验室动物房饲养,温度20~22℃,光/暗周期为自然光暗周期,实验前适
应饲养1周,自由获得饮水和饲料。
1.2仪器见表1。
表1实验仪器(略)
1.3试剂用品药艾条:
苏州市东方艾绒厂,批准文号:
国药准字Z32020881;中药片
剂(由柴胡、白芍、佛手、茯苓、黄芩、川芎、小麦、大枣、甘草等组成,广州中医药
大学提供,批号20060915),每片0.5g,含10.15g生药)。
淋巴细胞分离液、Binding
Buffer试剂、PI碘化丙啶(BEEKMANCOULTER公司)。
RPMI1640w/oL-Glutamine
w/25mMHEPES;0.3%戊巴比妥250ml;生理盐水。
无钙镁离子磷酸缓冲盐水(PBS)(0.15
mol/LpH7.2;NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO41.15gKH2PO40.2g;将上述试剂依次溶于1
000ml去离子水中,完全溶解后,115℃高压灭菌10~15min,存在4℃冰箱中备用。
2方法
2.1动物分组称体质量后,将大鼠随机分为对照组(CG)、CFS模型组(CFSG)、运动
加中药组(ETCMG)和艾灸组(MG)(组间无差异)。
每组12只,标记后分笼饲养,每笼6
只。
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2.2CFS造模方法对CFSG、ETCMG、MG三组实施造模。
每天电击,用波宽2ms
的电脉冲,1mA电流强度,时间隔20s,每天15次电击,共5min。
束缚和冷水游泳
隔日交替进行:
将大鼠放进自制的行为束缚筒内,束缚2h/次;冷水游泳,水温12℃,
时间5min,游泳后用电吹风机将大鼠吹干。
2.3CFS干预方法
2.3.1ETCMG组干预方法
中药干预:
给予疏肝健脾的中药片剂,用温开水溶解,每天灌胃1ml中药,剂量为
按成人每公斤体质量计算剂量的20倍。
为排除灌胃对试验的影响,其他各组均灌胃1
ml生理盐水。
运动干预:
采用自制跑笼进行,跑笼安装计数器,运动组大鼠在直径40cm的自制
圆形跑笼中进行自主运动,每日跑200圈,总长度约251.2m,每周7d。
跑动时间约
20~90min不等。
试验第1周适应期内,通过训练大鼠,让其能自主跑动。
训练的方
式为将ETCMG大鼠放进转笼,让其主动跑笼,第1天跑10min,以后每天增加10
min,直到递增至1h/d,自动记录跑笼圈数。
2.3.2MG组的艾灸方法MG组的艾灸方法:
与造模束缚同时进行。
把艾条分卷成直
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径6~8mm的灸条,先将大鼠后肢腿部两侧穴位的毛剃净后放进行为束缚筒,用封箱
胶带从大鼠尾部粘贴固定,露出两后肢,持艾条于足三里[4]穴上2~3cm处悬灸,采
用温和灸补法,1次/d,两穴15~20min/次,直至皮肤发红发热为止。
2.4旷场实验(open-fieldtest)各组大鼠进行3次旷场实验,均采用DigBehv动物行为
视频跟踪分析系统(上海吉量软件科技有限公司提供),测试在隔音、避光的开放场箱
(60cm60cm65cm)中进行。
箱左侧面中心装有摄像头。
在场箱底面长宽60cm方形旷
场内,中央有16个直径为2cm的圆形小洞,深1cm,小洞底为球形凹,安装有红外
线计数装置,记录大鼠探洞行为次数。
以距离旷场四边15cm画四条线,即为井
字,把旷场分为四边、四角,一中央,9个区。
视频合成器将大鼠看成一个质点,记录
大鼠运动轨迹,记录总路程(cm)、活动时间(s)、中央区路程(cm)、探洞次数。
检测固
定在19:
00~22:
00进行。
记录时间为3min,在放入大鼠后1min开始计时。
tips:
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取本品颗粒15g,研细,加
甲醇30ml,加热回流30min,放冷,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作
为供试品溶液。
取灵芝对照药材1g,同法制成对照药材溶液。
另取缺灵芝药材的阴性
样品15g,同供试品溶液制备方法,制备成缺灵芝的阴性对照溶液。
照薄层色谱法[6]
实验,吸取供试品溶液、对照药材溶液及缺灵芝药材的阴性对照溶液各5l,分别点于
同一硅胶G薄层板上,以石油醚(60~90℃)∶甲酸乙酯∶甲酸(15∶5∶1)的上层溶液
为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365nm)下检视。
供试品色谱中,在与对照
药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
阴性对照无干扰。
结果见图3。
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2.4当归、川芎的薄层色谱鉴别
取本品颗粒15g,研细,加乙醚30ml,加热回流1h,放冷,滤过,挥干,残渣加
醋酸乙酯0.5ml使溶解,作为供试品溶液。
分别取当归和川芎的对照药材各0.5g,加
乙醚30ml,同法制成对照药材溶液。
另取同时缺当归和川芎药材的阴性样品15g,同
供试品溶液制备方法,制备成缺当归和川芎的阴性对照溶液。
照薄层色谱法[6]实验,
吸取供试品溶液、对照药材溶液及缺当归和川芎药材的阴性对照溶液各5l,分别点于
同一硅胶G薄层板上,以正己烷:
醋酸乙酯(4∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,置
紫外光灯(365nm)下检视。
供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜
色的荧光斑点。
阴性对照无干扰。
结果见图4。
2.5丹参的薄层色谱鉴别
取本品颗粒15g,研细,加水50ml使溶解,离心,上清液用乙醚振摇提取2次,
30ml/次,合并乙醚液,蒸干,残渣加甲醇0.5ml使溶解,作为供试品溶液。
取原儿茶
醛对照品,加甲醇制成每1毫升含0.5mg的溶液,作为对照品溶液。
另取缺丹参药材
的阴性样品15g,同供试品溶液制备方法,制备成缺丹参的阴性对照溶液。
照薄层色
谱法[5]实验,吸取供试品溶液和缺丹参药材的阴性对照溶液各10l,对照品溶液5l,
分别点于同一硅胶G薄层板上,以氯仿:
丙酮:
甲酸(8∶1∶1)为展开剂,展开,取
出,晾干,喷以1%三氯化铁乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰。
供试品色谱
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中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
阴性对照无干扰。
结果见图
5。
3讨论
灵杞黄斑颗粒为中药复方制剂,成分复杂,笔者通过多次试验,筛选出合理的提取
方法和层析系统,对方中主要药物进行质量控制,经样品实验证明,该方法简便易
行,斑点分离清晰,重复性好,阴性对照无干扰,可作为该制剂的定性质量控制方
法。
在丹参的薄层鉴别过程中曾考察以丹参酮ⅡA为对照品,结果发现样品中出现的
暗红色斑点不清晰,故而采用原儿茶醛作为对照品,斑点清晰,且分离效果较好,阴
性对照无干扰。
【参考文献】
[1]卜文娟,徐国兴.年龄相关性黄斑变性的发病机制研究进展[J].眼科学,2007,
12(12):
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[2]木合布力阿布力孜,毛新民,热娜卡斯木,等.肉苁蓉总苷在HL-60细胞中的抗
氧化活性研究[J].中国药理学通报,2008,24(3):
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11
[键入文字]
[3]聂新华.高效液相色谱法测定菟丝子中金丝桃苷的含量[J].中国实验方剂学杂志,
2006,12(9):
13.
[4]黄琳娟,田庚元,王仲孚,等.枸杞子糖缀合物及其糖链对LDL氧化修饰的抑制
作用[J].药学学报,2001,36
(2):
108.
[5]国家药典委员会.中国药典,I部[S].北京:
化学工业出版社,2000:
附录ⅥB.
[6]国家药典委员会.中国药典,I部[S].北京:
化学工业出版社,2005:
附录ⅥB.
医药卫生栏目
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