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突变型与野生型TNF
突变型与野生型TNF
【关键词】,肿瘤
ApoptosisoftumorcellsinducedbymutantandwildtypeTNFα
【Abstract】AIM:
Tocomparetheapoptosisinducedabilityofrecombinanthumanmutanttype471rhTNFα(mt471rhTNFα)withthatofwildtyperhTNFα(wtrhTNFα)andtostudytheapoptoticmechanisminducedbymt471rhTNFα.METHODS:
TheapoptosisofZR751cells,abreastcancercellline,inducedbymt471rhTNFαorwtrhTNFαwasanalyzedandcomparedby20g/Lagarosegelelectrophoresisandflowcytometrytechniques.TheactivationprofilesofnuclearfactorNFκBinZR751cellsuntreatedandtreatedbymt471rhTNFαorwtrhTNFαweredetectedusingTransAMTMNFκBp65kitbasedonELISAforfurtherstudyoftheapoptoticmechanisminducedbymt471rhTNFα.RESULTS:
Theresultsfrom20g/LagarosegelelectrophoresisofgenomicDNAindicatedthatZR751cellstreatedbymt471rhTNFαprovidedatypicalapoptoticladderpatternofDNAfragmentation,whereasweakenedladderswereobservedinZR751cellstreatedbywtrhTNFα.Flowcytometryshowedthatthecellapoptoticrateinmt471rhTNFαtreatedgroupwas43%,but25%inwtrhTNFαtreatedgroup.Themt471rhTNFαheldastrongapoptosisinducibleability.TheresultsofDNAbindingactivityofNFκBshowedthatNFκBactivationinducedbywtrhTNFαwassignificantlyhigherthanthatofmt471rhTNFαwhentheproteinconcentrationofmt471rhTNFαorwtrhTNFαreached50μg/L(P=.CONCLUSION:
Theapoptosisinducedabilityofmt471rhTNFαissuperiortothatofwtrhTNFα.OneofthepossiblereasonsfortheenhancedapoptosisinducedabilitymaybethatNFκBactivationisinhibitedintumorcellstreatedwithmt471rhTNFα.
【Keywords】neoplasms;mutanttype471rhTNFα;wildtyperhTNFα;NFkappaB;apoptosis
【摘要】目的:
比较重组人突变型471rhTNFα(mt471rhTNFα)与野生型rhTNFα(wtrhTNFα)诱导肿瘤细胞发生凋亡的能力,并对mt471rhTNFα诱导肿瘤细胞发生凋亡的作用机制进行初步研究.方式:
以乳腺癌细胞系ZR751细胞为靶细胞,应用基因组DNA琼脂糖凝胶电泳及流式细胞技术分析mt471rhTNFα与wtrhTNFα诱导肿瘤细胞凋亡的情形;利用以ELISA为基础的TransAMTMNFκBp65试剂盒检测经mt471rhTNFα或wtrhTNFα处置的ZR751细胞核因子NFκB的活化情形,以便对其诱导凋亡的机制进行初步的研究.结果:
20g/L琼脂糖凝胶电泳显示,mt471rhTNFα处置组的ZR751细胞基因组DNA呈现明显的ladder状散布,wtrhTNFα处置组的“ladder”条带明显减弱;流式细胞仪分析显示,mt471rhTNFα诱导的细胞凋亡峰面积高于wtrhTNFα处置组.NFκB活化检测结果显示,当两型rhTNFα浓度增高到50μg/L时,wtrhTNFα处置组的NFκB的活化量明显高于同浓度的mt471rhTNFα处置组(P=).结论:
mt471rhTNFα诱导肿瘤细胞凋亡的能力明显优于wtrhTNFα;肿瘤细胞内NFκB活化明显受抑是mt471rhTNFα诱导凋亡能力增强的要紧缘故之一.
【关键词】肿瘤;突变型471rhTNFα;野生型rhTNFα;NFκB;细胞凋亡
0引言
人肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactoralpha,TNFα),要紧由巨噬细胞产生,是具有多种生物学活性的细胞因子.mt471rhTNFα是删除wtTNFαN端的7个氨基酸,并将Pro8Ser9Asp10置换为Arg8Lys9Arg10[1]的突变体.这种突变并非改变TNFα分子的高级结构,仍然形成具有生物活性状态的三聚体,抗肿瘤作用增强且毒副作用降低,极具开发价值.咱们在取得mt471rhTNFα重组蛋白的基础上[2-4],进行新的研究,为mt471rhTNFα的临床前研究提供实验依据.
1材料和方式
材料
两种基因工程蛋白在大肠杆菌DH5α中进行表达,初步检测具有良好的生物学活性.乳腺癌细胞系(ZR751)为本室保留.细胞培育基RPMI1640系GIBCOBRL产品,FCS购自杭州四季青生物技术公司.TransAMTMNFκBp65Kit由晶美生物工程提供.胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒由碧云天生物技术研究所提供.
方式
确信mt471rhTNFα与wtrhTNFα浓度蛋白溶解液溶解冷冻干燥蛋白,按1∶100稀释,测定280nm和260nm下的A值,确信蛋白的浓度;另取10μL加等体积2×蛋白电泳载样液,行150g/LSDSPAGE凝胶电泳,BackMan光密度扫描仪进行薄层扫描,以确信目的蛋白的含量.
两型rhTNFα诱导细胞凋亡苏醒ZR751细胞,传代培育至对数生长期,胰蛋白酶消化,Hank's液终止消化,搜集细胞,并调整细胞数至2×108/L.将细胞分为3组,即ZR751对照组、wtrhTNFα和mt471rhTNFα处置组.培育基中放线菌素D的终浓度为μg/L,样品终浓度为mg/L,于加药后12h搜集细胞.将细胞分为两部份,一部份用于20g/L琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA,另一部份用于流式细胞分析,以PBS洗涤细胞,RNase降解RNA,700mL/L乙醇固定,待用.检测时,PBS洗涤以弃除700mL/L乙醇,空干,碘化丙啶(PI)避光染色15min以上.PBS洗涤后,将细胞从头悬于1mLPBS中,用EPICSELITE,COULTER,USA型流式细胞仪分析比较两型TNFα诱导细胞凋亡的情形.
核蛋白的提取并定量按的处置方式苏醒并传代ZR751细胞,但样品终浓度别离为10μg/L和50μg/L,作用4h后搜集细胞,别离提取各实验组的细胞核蛋白质,操作按试剂盒说明书进行,即:
用PBS洗涤细胞,20μL细胞沉淀加入200μL细胞浆蛋白抽提试剂,振荡5s将细胞沉淀充分悬浮,加细胞浆蛋白抽提试剂B10μL.高速振荡5s,冰浴1min.4℃,12~16kg,离心5min,吸取上清至预冷的塑料管中,即为细胞浆蛋白.在沉淀中加入50μL细胞核蛋白抽提试剂,猛烈振荡15~30s,把沉淀完全悬浮.冰浴,每隔1~2min再高速猛烈振荡15~30s,共30min.4℃,12~16kg,离心10min,吸取上清至预冷的塑料管中,即为细胞核蛋白,紫外分光光度计下进行蛋白定量,-70℃冻存.
基于ELISA法的NFκB活性检测操作依照TransAMTMNFκBp65试剂盒说明书进行,简介如下:
加入3μg的细胞核蛋白抽提物,室温孵育1h,期间温和摇动96孔板,使之均匀地结合;用200μL的洗涤buffer洗涤3次,加入100μL以1∶1000稀释的NFκB抗体,勿摇动,室温下孵育1h;用200μL的洗涤buffer洗涤3次,加入100μL以1∶1000稀释的辣根过氧化物酶聚合的二抗,室温下孵育1h;用200μL的洗涤buffer洗涤4次,室温下每孔中加入100μL的展呈液,及时观看颜色的转变,直到培育基的颜色变成深蓝色时加入100μL的终止液,遇酸时,蓝色变成黄色,测定450nm下的A值.利用试剂盒中提供的突变寡核苷酸进行NFκB特异性结合为对照.
统计学处置:
以SPSS软件进行统计学分析,两实验组NFκB的活性检测分析采纳t查验,P<以为有统计学不同.
2结果
471rhTNFα与野生型rhTNFα的浓度由两样品的SDSPAGE结果及BackMan光密度扫描仪薄层扫描结果可知,目的蛋白的纯度为%和%;紫外分光光度法测定A280nm和A260nm吸光度值,可知wtrhTNFα蛋白的产量为g/L,mt471rhTNFα蛋白的产量为g/L.
诱导ZR751细胞凋亡的检测ZR751细胞在含有放线菌素D的培育液中,在mt471rhTNFα与wtrhTNFα处置组中,别离加入10μg/L的mt471rhTNFα与wtrhTNFα,别离经两样本作用12h后,进行细胞基因组DNA20g/L琼脂糖凝胶电泳.mt471rhTNFα组的细胞基因组DNA降解成不同倍数的180~200bp大小的片段,呈现明显的ladder状散布(Fig1).
流式细胞仪检测ZR751细胞凋亡与对照组相较,尽管两实验组均有凋亡峰显现,但mt471rhTNFα诱导的凋亡峰面积占43%,wtrhTNFα诱导凋亡峰面积占25%,mt471rhTNFα诱导的凋亡峰面积高于同浓度wtrhTNFα诱导组,对照组未见凋亡峰.
不同实验组ZR751中的NFκB活性实验中,咱们选择了不同的TNFα浓度处置ZR751细胞,实验结果可知(n=3)当两型rhTNFα以浓度为10μg/L作用于ZR751细胞4h后,与对照组A均值±相较,wtrhTNFα和mt471rhTNFα处置组的NFκB活化均有增加,其A均值别离为±和±,wtrhTNFα处置组的NFκB活化增加量高于mt471rhTNFα处置组(t=,P=);当两型TNFα浓度增高到50μg/L时,wtrhTNFα处置组的增加量明显增多其A均值为±,而mt471rhTNFα处置组仅有轻度升高,A均值为±,两实验组间有显著不同(t=,P=);当样品的浓度为100μg/L时,专门是mt471rhTNFα处置组的细胞有明显的死亡,未见到明显的NFκB活性改变;另外,两个实验组均未见到NFκB活化量随TNFα作历时刻的延长而增加,在必然浓度范围的TNFα作用下,细胞NFκB的活化有剂量依托性. 3讨论
咱们在取得高纯度和高活性mt471rhTNFα的基础上,对两型TNFα诱导肿瘤细胞凋亡的能力及相关机制进行了初步比较研究.研究发觉,mt471rhTNFα杀伤肿瘤细胞的作用是通过诱导肿瘤细胞发生凋亡实现的,与wtrhTNFα相较,mt471rhTNFα诱导ZR751细胞发生凋亡的作用明显增强.分析mt471rhTNFα诱导凋亡能力增强的要紧因素可能与以下因素有关:
第一,TNFα作用于不同亚型的受体(TNFR1和TNFR2)能够激活不同的信号传导途径.已有的研究报导mt471rhTNFα由于在N端进行了缺失突变和氨基酸置换,与TNFR1的亲和力显著提高,对TNFR2的亲和力降低[1].存在于大部份细胞表面的TNFR1是一个含有死亡域(deathdomain)的受体,接头蛋白TNFRⅠ相关死亡域蛋白(TRADD)与TNFR1分子的胞内死亡域部份相结合,而TRADD随后又引发的另一个接头蛋白Fas相关死亡域蛋白(FADD)的招募,因此形成了诱导凋亡的信号传导复合物,此复合物通过caspase8的活化启动了凋亡.第二,要紧表达在髓性细胞和受刺激的T或B淋巴细胞表面的TNFR2,能够激活NFκB,具有抗凋亡的作用并引发全身毒副作用[5,6].为了进一步分析本实验中肿瘤细胞的凋亡是不是与NFκB的活化有关,咱们采纳TRANSAMNFκB转录因子测定试剂盒,此法较凝胶分析更为灵敏,它是以ELISA为基础,将NFκB的p65亚单位结合位点的共有序列,即5′GGGACTTTCC3′包被于96孔板上,细胞核蛋白中转录因子NFκB的活化形式能够与此寡核苷酸特异性结合,而识别转录因子的一抗那么与转录因子结合,再用抗IgG偶联物和显色反映,容易患到定量的结果.实验中,wtrhTNFα处置组的NFκB的活化量显著高于mt471rhTNFα处置组,此结果证明了mt471rhTNFα与TNFR2的结合力降低,使NFkB的活化受到抑制这一假想.wtrhTNFα在与TNFR1或TNFR2结合时并无明显的选择性,它与受体结合后不仅介导凋亡信号的发生,同时也具有部份活化NFkB的作用,因此,wtrhTNFα只能够引发轻微的凋亡;而mt471rhTNFα与TNFR2的亲和力降低,造成NFκB的活化量明显减少,引发大量的靶细胞发生凋亡,因此mt471rhTNFα可能具有更强的抗肿瘤作用.研究以为,NFκB是一种普遍散布的多效性的核因子[7,8],它能够调剂一些编码细胞因子、细胞黏附分子和生长因子的基因表达[9],为大部份肿瘤细胞提供有重要意义的生存蛋白,如IAP家族、survivin蛋白等;激活凋亡抑制基因的转录,如cmyc,CD40L等,抑制了肿瘤细胞的凋亡而增进其生存.目前,NFκB已经成为人们紧密关注的抗癌药物医治的靶点.咱们推测mt471rhTNFα是通过下调NFκB的抑凋亡能力,而拥有了相对较强的抑制细胞生长、诱导肿瘤细胞发生凋亡的能力.值得注意的是细胞凋亡并非只是线性通路,而更可能存在凋亡信号分子彼此阻碍的环性通路.尤其是半胱天冬氨酸酶、线粒体膜Bcl2家族和细胞色素C间存在的彼此作用,使得上游分子和下游分子的凋亡信号能够呈环形级联放大,也能够由一些抑制凋亡的分子如Bcl2等阻断这种环形放大的级联效应,从而有效地抑制凋亡[10].因此,究竟mt471rhTNFα是不是存在其它诱导肿瘤凋亡的机制,有待于咱们进一步的研究.
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