基因工程高阶段复习题与解答doc.docx

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基因工程高阶段复习题与解答doc

第一章绪论

1.基因工程基本定义

狭义：

将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组后转入另一（受体）生物体内，使之按人的意愿遗传并表达出新形状。

广义：

基因工程DNA重组技术的产业化设计应用包括上游技术、卜游技术上游技术：

外源DNA重组、克隆和表达的设计与构建。

以简化下游操作工艺装备为指导思想。

下游技术：

含有重组外源基因的生物细胞（工程菌或细胞）的大规模培养及外源基因表达产物的分离、纯化过程。

是上游基因重组蓝图的体现与保证。

2基因工程的诞生

1972年，美国斯坦福大学的P.Berg傅士领导的研究小组，率先完成了世界上第一次成功的DNA体外重组实验，并因此与W.Gilbert、F.Sanger分享了1980年度的诺贝尔化学奖。

Berg等人使用核酸内切限制酶EcoRI，在体外对猿猴病毒SV40的DNA和X噬菌体的DNA分别进行酶切消化，然后再用T4DNA连接酶将两种消化片段连接起来，结果获得了包括SV40和XDNA的重组的杂交DNA分子。

1973年，斯坦福大学的S.Cohen等人也成功地进行了另外一个体外DNA重组实验。

他们将编码有卡那霉素（kanamycin）抗性藻因的大肠杆菌R6-5质粒，和编码有四环素（tetracycline）抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSClOlDNA混合后，加入核酸内切限制酶EcoRh对DNA进行切割，而后再用T4DNA连接酶将它们连接成重组的DNA分子。

用这种连接后的DNA混合物转化大肠杆菌，结果发现，某些转化子菌落的确表现出既抗卡那霉素又抗四环素的双重抗性特征。

S.Cohen的工作，是第一次成功的基因克隆实验，其重要意义在于：

它说明了像pSClOl这样的质粒分子是可以作为基因克隆的载体，能够将外源的DNA导入寄主细胞。

3基因工程成熟标志：

1977年，1977年美国首次用基因工程菌生产出有活性的人脑激素——生长

激素释放抑制素（14个氨基酸），启开了生物工程医药宝库的大门。

1978年，人胰岛素基因在大肠杆菌中成功表达，先进的生产工艺出现。

4基因工程腾飞标志（20世纪80年代）

1.1982年，美国palmiter将大鼠生长激素基因转入小鼠体内，使小鼠生长成巨鼠（转基因动物）

2.1983年，带细菌新霉素抗性的基因重组Ti质粒转化植物细胞获得成功（转某因植物）

3.1990年，美国人体基因治疗对一重度联合免疫缺陷患儿基因治疗成功。

4.1990年，人类基因组计划。

5.1997年，英国体细胞克隆出多利羊。

意义：

1.按人们意愿改造生物遗传特性，大规模生产生物分子。

2.超越生物种属界限，设计构建新物种，加快进化效率。

3.搜寻、分离、鉴定生物体尤其人体内的遗传信息资源。

4.本质上阐明真核基因表达调控分子机理，基因表达的时空特异性，核质基因的协同表达，信号传递途径。

5.从整体水平研究高等生物的发育分化

6.可以对多种生物基因组进行序列分析，如《人类基因组计划》《水稻基因组计划》的实施与完成。

7.“反向遗传学”：

体外对基因进行突变，在体内表达。

5.现代生物技术的研究内容？

答：

五大技术：

基因工程技术、蛋白质工程技术、细胞（组织）工程技术、酶工程技术、发酵工程技术

（此外还有基因诊断与基因治疗技术、克隆动物技术、生物芯片技术、生物材料技术、生物能源技术、利用生物降解环境中有毒有害化合物的技术

直接相关联的学科：

分子生物学、微生物学、生物化学、遗传学、细胞生物学、化学工程学、医药学等。

对人类和社会生活各方面影响最大的生物技术领域：

农业生物技术、医药生物技术、环境生物技术、海洋生物技术）

Pi括号内的内容老师没有讲,可以不用写，只是觉得答案太少而加的：

）

6.试述基因工程的基本形式？

答：

第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表达经典基因工程第二代基因工程蛋白编码基因的定向诱变蛋白质工程第三代基因工程代谢信息途径的修饰重构途径工程第四代基因工程基因组或染色体的转移基因组工程

7.试述基因工程的主要操作内容？

答：

1）B的基因的获取：

从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。

2）重组载体的构建制备：

将H的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。

3）重组体的转化：

将重组体（载体）转入适当的受体细胞屮。

4）克隆鉴定：

挑选转化成功的细胞克隆（含有S的基因）。

5）目的基因的分析：

提取出己经扩增的目的基因供进一步分析（如测序、酶切等）。

6）目的基因表达：

将目的基因转接到表达载体上，导入寄主细胞，使之表达出我们所需要的基因产物。

7）表达产物的分离纯化

第二章DNA研宄技术

1.试述电泳的基本原理？

用途？

影响染色体DNA电泳的主要因素？

答：

电泳的基本原理

1）带电荷的分子布电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为电泳迁移率。

2）电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的浄电荷数目成正比。

3）电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。

4）摩擦系数主要与分子的大小、形状以及介质的粘度有关。

5）如果电场强度一定（电压和电极距离）、电泳介质相同（电泳液和凝胶）:

分子在电场中迁移的速度主耍取决于分子本身的大小和形状。

形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关：

分子量越大，移动越慢。

电泳的用途

分析，制备，定量，免疫

影响染色体DNA电泳的主要因素

1）分子量的大小：

迁移距离与分子量的常用对数成反比

2）凝胶浓度：

浓度越高，移动距离越短，适合分离低分子量DNA浓度越低，移动距离越长，适合分离高分子量DNA

3）电压：

低电压时，迁移率与电压成正比；电压增高时，不同大小DNA片段迁移率增大是不同的。

4）碱基组成与温度：

不受影响，温度高可导致DNA带变形或解链。

2、核酸分子杂交原理？

核酸分子杂交的技术要素？

核酸分子杂交的类型？

原理：

带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起时，其

相应的同源区段将会退火形成双链结构

双链D\A

变性

放射

自显影

洗去綠

~探针杂交的瓦补DNA单链

技术耍素：

1.核酸探针的制备

2.核酸探针的标记

3.核酸探针的检测

4.核酸分子杂交技术

核酸分子杂交的类型：

1.Southernblot

2.Northernblot

3.斑点印迹杂交（dotblotting）

4.菌落杂交

5.Westernblotting

3、什么是随机引物？

其延伸原理？

随机引物：

可与任何DNA或RNA模板随机结合的引物。

4、PCR技术的原理？

特点？

PCR技术的基木原理：

类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延仲三个基本反应步骤构成：

1变性：

模板DNA经加热至94°C左右一定时间后，使模板DNA双链或经

PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为K轮反应作准备；

2复性：

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55°C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

3延伸：

DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用卜\以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的

“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2〜4分钟，2〜3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

PCR技术的特点：

特异性高；灵敏度高；快速；简便

5、影响PCR的因素？

影响PCR的因素：

（1）TaqDNA聚合酶：

从嗜热水生菌分离，最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。

具有5’^3’聚合酶活性和5’^3’外切酶活性没有3‘^5’外切酶活性因此不能修复错误的碱基配对！

（2）其它耐热的DNA聚合酶：

1TthDNA聚合酶：

高温下既能逆转录cDNA,乂能扩增DNA，具有5’43’聚合酶活性，无3’^5’DNA外切酶活性。

2VENTDNA聚合酶：

能耐受10CTC高温，具有5’^3’聚合酶活性和3‘^5’外切酶活性，能够校正碱基的错配。

3PfuDNAPolymerase:

奋3’-5’的外切酶活性，5’-3’外切酶活性，己发现的所有耐高温DNA聚合酶中岀错率最低的。

（3）引物（primer）:

PCR引物是人工合成的，与待扩增的DNA区段两3’端互补的短DNA，一般引物设计为长15—30bp,过长、过短都降低特异性。

3’端必须与模板正确配对，且最好选C、G、T,不选A,5’端可以不配对，避免连续相同碱基排列或内部冋文序列，尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力。

（4）模板（template）:

PCR对模板DNA的纯度要求不高，不能太多，过量的模板会降低特异性，产生非特异性扩增条带，甚至不产生PCR扩增产物，100）11反应体系屮100ng足够。

（5）dNTPs：

dATP、dTTP、dCTP和dGTP，一般反应体系中dNTPs混合液终浓度用0.2mmol/L,dNTPs能结合Mg2+,浓度过高会抑制TaqDNA聚合酶的活性，并增加错配率。

（6）Mg2+的浓度：

TaqDNA聚合酶要求有游离的Mg2+,所以Mg2+浓度不能太低，但太高会增加非特异产物（杂带），一般用1.5-4.5mmd/L的MgC12终浓度。

6、分子杂交有哪些方法？

试述southernblotting杂交的原理与方法？

分子杂交方法：

随着基因工程技术的发展，新的核酸分子杂交技术不断出现和完善，核酸分子杂交可按作用环境人致分为固相杂交和液相杂交两种类型。

固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸链游离在溶液中，固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。

液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。

在M相杂交中，未杂交的游离片段可容易地漂洗除去，膜上留下的杂交物容易检测和能防止靶DNA自我复性等优点，所以比较常用。

常用的固相杂交类型有：

菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern印迹杂交、组织原位杂交和夹心杂交等。

液相杂交是一种研究最早且操作简便的杂交类型，由于液相杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较为困难和误差较高，所以不如闹相杂交那样普遍。

southernblotting楽交的原理与方法：

将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段，然后经碱变性，Tris缓冲液屮和和高盐K通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素膜上、烘干固定后即可用于杂交。

凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着，附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确立探针互补的每一条DNA带的位置，从而可以确定在众多消化产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。

7、试述DNA序列分析中双脱氧法的原理与方法？

原理：

DNA聚合酶催化的DNA链延伸是在3’-0H末端上进行的。

由于2’，3’-双脱氧三磷酸核苷酸（ddNTP）的3’-位脱氧而失去游离-0H，当它参入到DNA链后，3’-OH末端消失，使DNA链的延伸终止。

方法：

将待测DNA片段与合成的寡聚核苷酸引物退火，随后在T7DNA聚合酶催化下进行延伸反应。

实际操作中同吋进行，分别终止于A、G、C和T的4个反应体系。

每个反应体系均含4种脱氧三磷酸核苷酸（dNTP）底物，其中一种dATP为32P标记物，以便能用放射自显影法读序。

但在这4个反应体系中，分别加一种低浓度的ddNTP（ddATP、ddGTP、ddCTP或ddTTP），这样ddNTP可随机参入正在延伸的DNA链上，使链延伸终止。

例如在“A”管中加ddATP，反应结束时，管内所有新合成的DNA链都是以A结尾的不同长度的片段，而且这些片段都带放射性。

将反应物加在高分辨凝胶上电泳，DNA片段则因其长度不同（分子量大小不同）被分离，短的走在前端，长的泳动在后而。

其他3管则分别为以G，C或T结尾的不同长度DNA片段。

由于：

①即使是长短相差一个核苷酸的DNA片段，亦可根据艽电泳距离的差异而加以区分；②A、G、C和T4种反应体系的产物在电泳凝胶中相邻排列。

故而在阅读凝胶电泳的放射自显影图像时，由下至上按前后顺序即可将DNA的核苷酸顺序读出。

第三章工具酶

1.工具酶的定义

能够用于DNA和RNA分子的切割，连接，聚合，反转录，修饰等有关的各种酶。

2.什么是细菌的限制一一修饰系统？

细菌的限制和修饰系统（R/M体系），自我保护作用。

限制（Restriction）:

限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断，目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶，分别是限制性内切酶I、II、III。

修饰（Modification）：

细菌自身的DNA碱猜被甲藻化酶甲藻化修饰所保护，不能被自身的限制性A切酶识别切割。

Dam甲基化酶——GATC腺嘌呤N6位置引入甲基

Dcm甲基化酶——CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基

3.举例说明限制性内切酶的命名原则？

1973年H.0Smith和D.Nathans提议的命名系统,命名原则如下:

1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名，大肠杆菌｛Escherichiaco]i、用Eco表示；

流感嗜血菌、Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。

2.用一个右下标的大写字母表示菌株或型。

如Ecok，EcoR（现在都写成平行，如EcoRDo

3.如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。

如EcoRT,EcoRV。

4.限制酶前面要带上R（Restriction）,

修饰酶前面要带上M（Modification）。

（现已省略）。

以EcoRl为例，E代表属名，大写；Co代表种名，小写；R代表株名；1代表序数。

4.什么是粘性末端？

有何意义？

限制性内切酶II产生哪3种不同末端？

粘性末端：

当一种限制性内切酶在一个特异性的碱基序列处切断DNA时，就可在切口处留下儿个未配对的核苷酸，叫做粘性末端。

意义••一条DNA双链粘性末端的凸出部分的几个单链核苷酸可以与另一条DNA

双链的粘性末端以碱基互补配对的方式复性连接起来，比平末端耍容易得多。

三种不同末端：

5’粘性末端（可以用DNA激酶进行32P标记）;

3’粘性末端（可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（AAAA或TTTT）造成人工粘末端）

平末端

5.同裂酶（Isoschizomers）

识别位点的序列相同的限制性内切酶

完全同裂：

识别位点，切点完全相同；

不完全同裂：

识别位点相同但是切点不同。

6.同尾酶（Isocaudamers）

识别序列不同，但能切出相同的粘性末端，同尾酶的粘末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原來同尾酶识别。

7.反转录酶具有哪几种活性？

反转录酶的作用是以dNTP为底物，以RXA为模板，按5’-3’方向，合成一条与RNA模板互补的DXA单•链，这条DNA单•链叫做互补DNA（complementaryDNA,cDNA）,随后又在反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。

至此，完成由RNA指导的DNA合成过程。

大多数反转录酶都兵有多种酶活性，主要包括以下几种活性。

①DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。

此酶需要RNA为引物，多为色氨酸的tRXA，在引物tRNA3'—末端以5'-37方向合成DNA。

反转录酶中不具有3'—5'外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。

②RNaseH活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNaseH从R\A5'端水解掉RXA分子。

③DNA指导的DXA聚合酶活性；以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。

除此之外，有些反转录酶还有DNA内切酶活性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA屮有关。

反转录酶的发现对于遗传工程技术起了很人的推动作用，S前它己成为一种重要的工具酶。

用组织细胞提取mRNA并以它为模板，在反转录酶的作用下，合成出互补的DNA（cDNA），由此可构建出cDNA文

库（cDNalibrary）,从巾筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术中最常用的获得FI的基因的方法。

8.现有一研宄者打算将一EcoRIDNA片段克隆到另一个DNA分子的

BadAI位点以便DNA扩增，但扩增后的DNA分子又可用BaniiI限制

酶将插入的片段回收，如何设计次实验?

设计方案：

1EcoRTDNA片段的粘性末端补平

2.连接I的衔接物（adaptor）

3.与Bani\1DNA片段连接

4扩增后再用BanHI酶切便可将插入的DNA片段回收。

9.某研究者计划将具有限制酶fezdlI粘性末端结构的一段低聚核苷酸分子插入到一载体的克隆位点区。

现假设他己获得具奋低聚核苷酸插入的重组质粒，他应做什么实验来检查插入片段的方向？

答：

不知道

10.试述影响限制性内切酶的活性因素？

限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pll等条件卜才表现最佳切割能力和位点的专一性。

1.DNA的纯度：

DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影

2DNA的分子结构：

超螺旋DNA比己经酶切成线形DNA完全酶解所需要的酶量多，有的酶切割同一DNA的不同位点时，其切割效率也有差别。

3.DNA的甲基化程度：

大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰，dam甲基化酶（修饰GATC中的A）;dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。

4.反应温度与保温时间：

不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。

大多数是37°C,例外：

Sam25°C,Taq65°C等；酶反应的终止一般是65'C保温lOmin.

5.缓冲液（Buffer）是影响限制酶活性的重要因素，商品化的限制酶一般都带有专用的Buffer。

1纯化DNA②加大酶的用量③延长保温时间④扩大反应体积020（11）

11.试述不匹配的粘端的连接方法？

1.修平：

用S1酶切掉双连DNA分子突出的核苷酸，用连接酶连接；

2.补平：

用Klenow将末端补平，产生平末端或匹配粘性末端，在用连接酶连接。

3.同聚物加尾法：

末端脱氧核苷酸转移酶将脱氧核苷酸分子一个一个地加到DNA3’端上，底物可以是双链也可以是单链DNA,可以使平末端也可以是粘性末端，每一种dNTP都可以作为反应的前体，给DNA3’端加上同聚物poly（dC）或poly（dG）或poly（dT）或poly（dA）,如此加尾的DNA片段可以按互补粘性末端连接的方法连接。

4人工接头法：

将具有平头末端的DNA片段与人工接头分子在T4DNA连接酶的作用下连接起来，再用限制酶切割产生具有粘性末端的DNA片段，然后与具有同样粘性末端的DXA分子在T4DXA连接酶作用卜连接。

5.DNA接头：

人工合成一头具某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段，它的平末端与DNA片段平末端连接之后，便会使后者成为具粘性末端的新的DNA分子，而易于连接。

实际使用时对DNA接头末端的化学结构进行必要的修饰与改造，可避免处在同一反应体系中的各个DNA接头分子的粘性末端之间发生彼此间的配对连接。

第四章目的基因的获得

1.化学合成目的基因目前常用的方法？

磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、亚磷酸酰胺法及闷相亚磷酸酰胺法。

磷酸二酯法是最初发明的化学合成某因的方法，而固相亚磷酸酰胺法是FI前绝大部分DNA自动合成仪所使用的方法。

由于现代科学技术的发展，DNA的化学合成己经广泛采用DNA自动合成仪进行，因此现在仅在少数特殊情况下，采用人工合成。

2.寡聚核苷酸化学合成的优点？

1）、有组织特异性Mrna的含量很低，很难用Cdna法克隆

2）、可作为PCR的引物

3）、合成探针，筛选特定的基因

4）、定点突变的合成

5）、合成含有各种酶切位点的人工接头或衔接物

3.基因文库（genelibraryorgenebank）:

从将定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）。

根据构建方法的不同，基因文库分为：

基因组文库（含奋全部基因），cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）

4.基因文库的质量标准？

除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：

重组克隆的总数不宜过人以减轻筛选工作的压力

载体的装载量最好大于基因的长度避免基因被分隔克隆

克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠IX域以利克隆排序

克隆片段易于从载体分子上完整卸下

重组克隆能稳定保存、扩增、筛选

5.DNA文库和cDNA文库有什么区别？

基因组DNA文库

从生物组织细胞提取出全部DNA,用物理方法（超声波、搅拌剪力等）或酶法（限制性核酸内切酶的不完全酶解）将DNA降解成预期大小的片段，然后将这些片段与适当的载体（常用噬菌体、粘粒或YAC载体）连接，转入受体细菌或细胞，这样每•-个细胞接受了含有一个基因组DNA片段与载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体，就称为基因组DNA文库（genomicDNAlibrary）o如果这个文库足够大，能包含该生物基因组DNA全部的序列，就是该生物完整的基因组文库，能从这文库屮钓取该生物的全部基因或DNA序列。

从基因组含有生物生存、活动和繁殖的全部遗传信息的概念出发，基因组文库是具有生物种属特异性的。

cDNA文库以mRNA为模板，经反转录酶催化合成DNA，则此DNA序列与mRNA互补，称为互补DNA或cDNA。

提取出组织细胞的全部mRNA，在体外反转泶成cDNA,与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA,并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库，基因组含奋的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基

因表达的种类和强度也不尽相同，所以cDNA文库具有组织细胞特异性。

cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得细胞特异表达的基因。

但对真核细胞來说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。

第五章工程载体

1、什么是载体Vectors?

载体（Vector）是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩埔、表达的工具。

载体有质粒（plasmid）、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒（粘粒）、病毒等。

载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的遗