生物等效性实验生物样品处理注意事项严知识讲解.docx

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生物等效性实验生物样品处理注意事项严知识讲解

生物等效性实验生物样品处理注意事项（严）

生物等效性实验生物样品处理注意事项

一、样品采集后的的处理和贮存

鉴于生物样本的特点，为了避免样品中被测药物发生分解或产生其他化学变化，取样后最好立即进行分析测定，但实际工作中几乎无法做到，常需将收集到的样品冷藏、冰冻，临用前再融化并放至室温后使用。

在样本冷冻贮藏前，需及时进行处理。

1.1血液样本处理注意事项

1.1.1.在肌肉注射或静脉输含有葡萄糖或电解质（含钾、钠、氯离子）的液体时，建议3小时以后采集静脉血样本进行这些项目的检验，以防止上述检验项目因输液引起的假性升高。

1.1.2保定非麻醉状态的动物时应尽量避免用力挤压动物头颈和胸腹，以免引起血液淤滞，局部组织缺氧，造成血液某些成分的改变，特别是测定乳酸，血液含氧量等指标时。

1.1.3血液中红细胞内外成分有很大差异，溶血可造成红细胞内的物质向细胞外转移，如K+、Mg2＋和某些酶类（LD、AST、ALT、ACP）；另外，溶血还可干扰某些化学项目（TBil、DBil、TC等）的测定，严重影响结果的准确性，血样本应防止溶血。

引起溶血的原因有：

注射器采血时抽吸力太大；血液与抗凝剂比例失调；混匀样本时过度振荡；注射器或采血容器带水或容器污染；全血放置时间长或突然受冷或受热；注射器中的血沫注入采血容器；真空采血时如未采满至相应刻度，残存负压造成红细胞破裂；不拔针头直接注入采血容器；样本离心时离心力过大等。

为避免溶血，取血时应注意：

①、抽拉注射器时应尽量避免注射器内产生大量真空；

②、添加抗凝剂后的容器在除必要干燥流程后应及时密封；

③、混匀样本时避免用力过度，切勿产生泡沫；

④、避免重复使用注射器、针头、采血管、毛细玻璃管等一次性用品，手术刀片和剪刀等器材取材时尽量洗去残留血液；

⑤、采血时的室温应控制在22℃至25℃，采取的血液容器在需要放入冰盒时，切勿紧贴冰袋，冰水；

⑥、当注射器内因吸入空气产生血沫时，注意弃掉血沫，在将血液注入采血容器时勿将血沫一并注入；

⑦、使用真空采血管需抽取负压时切勿过量；

⑧、将血液注入采血容器时要除去针头，轻柔推入；

⑨、离心带有血细胞的血样时，按照规格设定离心参数；

1.1.4.正确选择采集管。

通常情况下多采用血清为样本（不抗凝），部分检测项目需注意样本属性为血清或血浆，两者不可替代。

一些特殊检验项目需要使用抗凝剂时，应注意选择合适的抗凝剂并注意抗凝剂与血液的比例，以防止样本凝血或红细胞形态的改变；抗凝血样本采集后立即轻轻摇匀至少上下颠倒8次，以防凝血发生。

1.1.5.多项化验采血顺序：

血培养瓶（厌氧瓶优先）→蓝帽管→黑帽管→红/黄帽管→绿帽管→紫帽管→灰帽管→其他。

1.1.6需要冻存的全血按要求分装到统一规格的无菌冻存管中，加入DMSO混合均匀后将冻存管放入4℃冰箱中半小时，再放入-20℃冷冻冰箱中，至少4小时候后，才能转移到-80℃或更低温条件下储存。

1.1.7抗凝收集的血浆冷冻保存后，解冻时可能会出现絮状浑浊，如有则需要离心去除杂质再进行检测。

1.2尿液、粪便样本处理注意事项

1.2.1尿液主要是水、尿素、盐类及少量小分子蛋白，是理想的细菌生长液，因此应在取样后立即测定。

不能立即测定时，应于4℃冷藏，如在室温保存，则应在采样后的尿液中加入少量防腐剂甲苯（1%）或氯仿（饱和）。

样本留取过程中应避免混有血、脓或阴道分泌物、粪便等可引起“假性蛋白尿”的成分。

检测非蛋白类待测物时，可根据试剂盒需求进行蛋白沉降操作（离心/化学沉淀）。

用于一些血液病的样本应注意在留尿前勿对动物进行酒精涂抹、吸入，注射巴比妥类、磺胺类、利眠宁、眠尔通、苯妥英钠等药物，样本应避光保存。

1.2.2粪便样本应尽量使用新鲜样本，采集后立即送检。

若样本久置，则会因pH及消化酶等因素而使粪便中生物成分分解破坏。

样本中不可混有尿液，更不可采取浸泡于尿液中的粪便样本。

样本中不可混入垫料、污水等，减少微生物和颗粒造成的影响。

粪便样本不应用卫生纸包裹、手指抓取，应使用棉签，干净的镊子等夹取，直接装入蜡纸盒或EP管并密封，以防水分丢失。

1.3骨髓样本处理及注意事项

骨髓样本一般通过脊柱穿刺、股骨采取。

采集的骨髓液收集于无菌肝素抗凝管内，取材环境应保持洁净（至少为SPF环境）。

若骨髓标本含有红细胞，在冷冻前应先将其离心去除。

骨髓标本采集后应尽快根据冻存程序并储存在-80℃环境下。

1.4胃肠液样本处理及注意事项

取材前应禁食12小时，在空腹状态下取材。

取出胃肠组织时，应夹闭贲门和幽门，及肠道切口两端，避免肠液胃液流失/混入血液。

需要灌洗肠胃时应注意灌洗液体积、回收率。

肺泡灌洗液样本同上处理。

1.5脏器样本处理及注意事项

取材后应迅速将脏器称重，以免水分蒸发造成差异，特别是肾上腺等小器官的称重。

脏器称重前应尽量将周围脂肪组织和结缔组织剔除，并用滤纸吸去脏器表面血液及体液，特别是肾上腺、甲状腺、前列腺等较小的器官，更要新鲜称重，防止器官干燥失水而重量减轻。

空腔器官称重前，应清除其腔内液体，如心脏应除去血块。

1.6组织匀浆样本处理及注意事项

匀浆介质的制备一般采用pH7.4,0.01mol/LTris-HCl,1mmol/LEDTA-2Na,0.01mol/L蔗糖,0.8%氯化钠溶液或直接用0.86%的生理盐水作为匀浆介质。

ELISA检测的匀浆介质可使用PH=7.2-7.4，浓度为0.01mol的PBS。

酶活性类检测则必须使用生理盐水。

剪取组织块后应在4℃的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，准确称重，放入适合的匀浆管中。

按重量（g）:

体积（ml）比例（1g/ml=100%）加入匀浆介质（pH7.4，0.01mol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA-2Na,0.01mol/L蔗糖,0.8%的氯化钠溶液）或者0.86%的生理盐水于匀浆管中，冰水浴条件下，用眼科小剪尽快剪碎组织块后匀浆：

包括手工匀浆，机器匀浆，超声粉碎。

手工匀浆：

左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，制成10%的匀浆液；机器匀浆：

用组织捣碎机10000～15000转/分上下研磨制成10%组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间；超声粉碎：

用超声粉碎机进行粉碎处理。

根据各型号仪器操作规程操作。

匀浆制作完成后可使用镜检观察：

取少量组织匀浆作涂片（直接涂片、染色均可以），显微镜下观察细胞是否破碎，根据结果可延长匀浆时间。

匀浆液测定前用普通离心机或低温低速离心机2500转/分左右,离心10～15分钟，取上清液进行测定。

匀浆的保存：

动物组织样本暂时不测定，可立即低温冻存，温度越低越好，中间如不反复冻融，-20℃以下可保存三个月,-70℃以下可保存六个月。

非必须冻存的样本应于制作当天进行测定，如放置时间过长相关酶活会有所下降，部分指标4℃可存放3～5天（如SOD要存放2～3天，MDA可存放3～5，总蛋白测定可存5～7天等）。

1.7用于基因扩增检测的样本

包括NG-DNA、CT-DNA、UU-DNA、HSV-Ⅱ-DNA、tRNA、mRNA等项目。

1.7.1血液

一般采用红色非抗凝血清管。

如需要抗凝处理，首选的抗凝剂为EDTA和枸橼酸钠，不能使用肝素抗凝，肝素是Taq酶的强抑制剂。

RNA检测的样本应在4小时内开始扩增程序处理；DNA检测的样本应在12小时内处理。

如不能及时送检，可将样本放在-20℃冷冻保存。

1.7.2尿液

用无菌生理盐水清洗尿口，并用高压蒸汽灭菌处理过的无菌器皿收集，不做防腐处理。

RNA检测的样本应在4小时内开始扩增程序处理；DNA检测的样本应在12小时内处理。

如不能及时送检，可将样本放在-20℃冷冻保存。

1.7.3脑脊液、胸腹水、穿刺液、肺泡灌洗液

严格遵照无菌操作规范取材，收集至经高压蒸汽灭菌处理的无菌容器。

RNA检测的样本应在4小时内开始扩增程序处理；DNA检测的样本应在12小时内处理。

如不能及时送检，可将样本放在-20℃冷冻保存。

2、生物样本贮存期间的稳定性考察

   由于生物等效性试验样本从采样到检测的周期通常需要几周至几个月，在其贮存期间目标药物的稳定性需经考察验证。

含药样本稳定性是指样品中的药物从采样至测定时性质和含量的稳定程度，它是贮存条件、药物的化学性质、空白生物样品和容器系统的函数，在特定的容器和生物样品中待测物的稳定性不能外推至其他系统。

生物样本稳定性的评价应考察：

   1、短期室温稳定性：

要求高、低浓度样本在4~24h内稳定。

考察温度、光照、空气、酶解等因素。

   2、长期低温条件下的稳定性：

从第一个样本采集至最后一个样本的分析为一个考察时间周期，贮存温度一般为-20℃，如果需要也可在-70℃贮存。

要求高、低浓度至少分别测定3次，测得结果与第一天测得的相应浓度比较应保持稳定。

   3、冻融试验：

取高、低浓度各3份于-20℃贮存24小时，取出后在室温自然解冻，取样测定，然后再将样品放回冷冻12~24小时，如此重复循环二次以上，分别比较各次测定结果。

   4、对照液和内标液的稳定性：

室温考察6小时稳定性，然后冷藏7~14天或恰当的周期后进行测定，与新配溶液的测定结果进行比较。

三、各类检测项目注意事项

激素类：

包括类固醇（肾上腺皮质素、性激素）、蛋白质和多肽类（垂体、下丘脑、胰腺）、脂肪酸衍生物（白细胞三烯、前列腺素）、氨基酸衍生物（肾上腺素、甲状腺素）。

在室温条件下大致稳定性从高到低为：

固醇类（数周至数天）→蛋白质和多肽（数周至数分钟）→氨基酸衍生物（数天至数分钟）→脂肪酸衍生物（数天至数秒）。

检验按照检验项目的特性取材即刻检测，或是选择-70℃冻存，避免反复冻融，且避免水浴时间过长，建议冻融即开始检测（注意吹打混匀）。

蛋白类：

包括酶、抗体、表面标示蛋白、总蛋白组织液、泛素、部分激素类等。

在-70℃中相对保存时间较长，但反复冻融极易破坏稳定性，水浴更容易被细菌或样本内自身的酶降解。

其中抗体类蛋白最为稳定，IgG甚至能在血清中4℃稳定保存23天。

而酶类在血清中4℃放置8小时即会造成活性下降。

血清蛋白则能在24小时内保持稳定。

多肽类：

根据分子量大小，较长的肽链稳定性能与蛋白相当，分子量越小则稳定性越差，血清样本建议24小时内检测处理，-70℃冻存时应避免反复冻融。

氨基酸：

在中性条件下可在-70℃至-20℃冻存数月，但4℃以上开始，血清样本中氨基酸会缓慢被酶代谢，在酶类丰富的组织液和细胞裂解液中更容易代谢。

建议加快冻融复温后的检验进程。

生化类检测项目：

这些检验项目较为复杂，除了部分有机盐类之外，大部分易受氧化、光照分解、生物降解。

考虑到实验室方法学允许误差，参考检验科对具体项目的测定要求：

GLU应在4 h内测定，BUN（尿素氮）、TBIL（总胆红素）应在8 h内完成，TP（总蛋白）、ALB（白蛋白）、ALT（丙谷氨酸转移酶）、AST（天门冬氨酸转移酶）、ALP（碱性磷酸酶）、GGT（GGT谷氨酰基转移酶）、Ca2+、PT应在24 h内测定完。

血液标本长时间放置后，其结果偏高的是：

TP、ALB、ALT、AST、ALP、GGT、Ca2+；其结果偏低的是：

BUN、TBIL；对结果影响差异无显著性的是：

TG（甘油三酯）、DBIL（直接胆红素）。

这提示，要得到血脂等指标的可靠准确的检测结果，标本也不适宜在低温下长时间保存。

正是由于血液放置时间对有些生化检验项目的影响，对于工作量大的生化室应先测定不宜长时间放置的标本，而不能及时测定的项目应把血清分离出来后放置2-8℃冰箱保存并在当天检测。

因此，生化检测人员不仅要知道对标本放置时间的要求，还要知道其结果的变化趋势，以便了解长时间放置后其结果是偏高还是偏低，在实际检测中要合理安排检测项的顺序，对GLU和CO2等不稳定的项目要及时测定，减少冻融和放置的时间。

必要时采取分批处理的方法，并严格参照仪器、试剂盒说明书、操作规程操作，力争把对实验结果的影响降到最低。