南中医生物制药工艺学复习资料.docx

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南中医生物制药工艺学复习资料

第一章

药物：

用于预防、治疗或诊断疾病或调节机体生理功能、促进机体康复保健的物质。

4大类：

预防药、治疗药、诊断药和康复保健药。

药品:

直接用于临床的药物产品，是特殊商品。

药品应规定有适应症、用法语用量和疗程，说明毒副反应。

还要有使用有效期，过期商品不准使用。

生物药物：

是指生物体、生物组织或其成分为原料（包括组织、细胞、细胞器、细胞成分、代谢、排泄物，综合应用生物学、物理化学与现代药学的原理与方法加工制成的药物。

4大类：

重组DNA药物（基因工程药物）、基因药物、天然生物药物、合成与部分合成的生物药物。

生物制品：

用微生物、微生物代谢产物、动物毒素、人或动物的血液或组织等加工制成的预防、治疗和诊断特定传染病或其他有关疾病的免疫制剂，主要指菌苗、疫苗、毒素、应变原与血液制品。

生物技术药物（基因工程药物）:

采用DNA重组技术或单克隆抗体技术或其他生物技术制造的蛋白质抗体或核酸类药物。

生物药物的特性：

1.药理学特性：

（1）药理活性高、

（2）治疗正对性强，治疗的生理、生化机制合理，疗效可靠、（3）毒副作用较少，营养价值高。

（4）生理副作用常有发生（免疫原性反应和过敏反应。

2.理化特性：

（1）生物材料中的有效物质含量低，杂质种类多且含量相对较高。

（2）生物活性物质组成结构复杂，稳定性差。

（3）生物材料易染菌、腐败（4）生物药物制剂的特殊要求。

P8生物药物分类

一．基因工程药物：

1.细胞因子干扰素2.细胞因子白介素和肿瘤坏死因子3.造血系统生长因子类4.生长因子类5重组多肽与蛋白质类激素6心血管病治疗剂与酶制剂7重组疫苗与单抗制品

二．基因药物：

以基因物质作为治疗的物质基础，包括基因治疗用的重组目的DNA片段

重组疫苗、反义药物、干扰核酸RNAi和核酶等。

三．天然生物药物：

1.微生物药物

（1）抗生素类药物

（2）维生素类药物（3）氨基酸类药物（4）核苷酸类药物（5）酶与辅酶类药物（6）酶抑制剂（7）免疫调节剂（8）受体拮抗剂

2．天然生物药物

（1）氨基酸类药物

（2）多肽和蛋白质类药物（3）酶类药物（4）核酸及其降解物和衍生物类药物（5）多糖类药物（6）酯类药物

3.海洋生物药物

四．医学生物制品

第二章

一.生化制药的生物材料的来源：

1.动物脏器2.血液、分泌物和其他代谢物3.海洋生物4植物5.微生物

二．生物材料的准备

1.生物材料的选择

（1）有效成分的含量（选择富含有效成分的生物制品）

（2）合适的组织器官（注意生物的生长期）

（3）杂质情况（避免与目的物相似的杂志对纯化过程的干扰）

（4）来源丰富

2.生物材料的采集、预处理与保存

采摘迅速，及时冻存、低温保存。

保存方法：

1冷冻法2有机溶剂脱水法（丙酮）适用于原料稀少而价值高的材料,并且有机溶剂对活性物质不起破坏作用的原料,如脑垂体.3防腐剂保鲜法,常用乙醇、苯酚等。

适用于液体原料。

三．生化活性物质的提取。

1．酸、碱、盐水溶液提取法（水溶性、盐溶性的生化物质）如胰蛋白酶用稀硫酸提取，肝素用pH9的3%氯化钠提取，某些与细胞结构结合牢固的生物高分子，采用高浓度盐溶液提取，这种方法称“盐解”

2．表面活性剂（去垢剂）提取法（SDS）

3.有机溶剂提取：

有毒，但去除容易，脂溶性物质的提取。

影响提取效率的因素

（1）.温度耐热50-90度，不耐热0-10度，在活力允许的条件下，温度尽量高。

（2）酸碱度pH4-9

（3）盐浓度稀盐：

助溶NACLPBSAC-

提取方法的选择,目的：

尽量增加目的物的溶出，减少杂质的溶出。

对于一些生物大分子采用下列保护措施

（1）采用缓冲系统PBS、TRIS-HCL等

（2）添加保护剂B-巯基乙醇、DTT（3）抑制水解酶的作用，加酶抑制剂（4）尽量采用温和条件（避免紫外线、强烈搅拌、过酸、过碱或高温、高频振荡等）

四生物活性物质的浓缩与干燥

1.生活活性物质的浓缩（浓度增加，体积减小）：

液体变固体

（1）盐析

（2）有机溶剂沉淀法（乙醇、丙酮）

还是液体（3）葡聚糖凝胶浓缩（4）用聚乙二醇浓缩（5）超滤浓缩（6）真空减压浓缩与薄膜浓缩

2.干燥：

缩小体积，增加稳定性

（1）减压干燥

（2）喷雾干燥（3）冷冻干燥

五．生化活性物质的分离与纯化（液相中进行）

生物制药工艺中分离制备方法的特点

（1）生物材料组成非常复杂，杂质多，数量大

（2）有些化合物在生物材料中的含量极低（3）生物活性成分分离后，易变性破坏（4）分离在溶液中进行，各种参数对溶液中各种组分的综合影响常常无法固定（5）多采用温和的”多阶式”方法进行，“逐级分离”（6）生物产品最后均一性的证明与化学上纯度的概念不完全相同。

根据分子形状和大小不同进行分离：

差速离心与超离心、膜分离（透析、电渗析）、凝胶过滤法

根据分子电离性质的差异进行分离：

离子交换法、电泳法、等电聚焦发

根据分子极性大小及溶解度不同进行分离：

溶剂提取法、盐析法、等电点沉淀法及有机溶剂沉淀法。

根据物质吸附性质不同：

选择性吸附和吸附层析法。

根据配体特异性进行分离：

亲和层析法。

分离纯化的基本程序和实验设计

（1）建立分析鉴定方法（分析目的物是否还在）

（2）理化性质和稳定性的预备实验

（3）材料处理与抽提方法的选择

（4）分离纯化方法的摸索

（5）产物的均一性测定

分离纯化早期选择原则：

从低分辨率到高分辨率且负荷量较大地方法。

不宜选择分辨能力较高的纯化方法。

特点：

缓和、步骤多、层层剥皮。

常用手段：

提取、沉淀、吸附、离子交换

（1）交叉使用原则

（2）先后顺序合理安排

生物分子纯度的鉴定方法：

溶解度法、化学组成分析法、电泳法、免疫学法、离心沉淀分析法、各种色谱法、生物功能测定法、质谱法。

第三章生物材料的预处理和液固分离

一

（一）．选择预处理方式的依据。

生物活性物质：

存在部位：

胞内或胞外

生物分子间的作用力：

基本骨架：

共价结合，比较稳定

分子间连接（空间高级结构）：

非共价键，键的功能较弱且性质差别大。

特点：

含量低，且生理活性愈高的物质，含量愈低。

目的物与杂质的理化性质十分接近。

目前采用的方式有两种

（1）提前先通过预处理加入活化剂和保护剂，在一定温度下放置一段时间使其激活成有活性的酶，然后再分离纯化。

（2）先以酶原的形式初步提纯，然后加入激活剂等活化，再通过精制纯化得到有活性的酶类产品

（二）．后续操作的要求：

得到的滤液澄清、pH适中、有一定的浓度。

（三）、目的物的稳定性：

在整个制造过程中要把防止目的物的失活放在首位。

二．动物材料的预处理：

1绞肉机：

成糜后可提取Pr和酶2匀浆器和捣碎器：

细胞破碎3.反复冻融或加入丙酮粉。

三．细胞培养液的预处理

去除两大类杂质：

1.可溶性黏胶杂质，包括核酸、咋蛋白质、不溶性多糖等2.无机盐

（一）细胞及蛋白质的处理1.加入凝聚剂2加入絮凝剂3变性沉淀4吸附5等电点沉淀6.加各种沉淀剂沉淀

（二）多糖的去除：

酶：

将多糖转化为单糖，降低黏度（TAB、CPC：

常用的多糖沉淀剂）

（三）高价金属离子的去除1离子交换法2沉淀法

第五章固相析出分离法

固相析出分离法:

目的物经常作为溶质而存在于溶液中，改变溶液条件，使它以固体形式从溶液中分出的操作技术称为固相析出分离法。

（一）盐析法

特点：

优点简便、安全、经济、应用广，较少引起变性。

缺点分辨率不高、带入大量盐

盐析法：

利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，是目的物或杂蛋白易沉淀析出。

盐溶现象：

低盐情况下，随着中性盐离子强度的提高，蛋白质溶解度增大。

盐析现象：

在高盐浓度下，蛋白质溶解度随之减小。

盐析法的原理：

产生盐析作用的一个原因是由于盐离子与蛋白质表面具相反电性的离子基团结合，形成离子对，因此盐离子部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间电排斥作用减弱而能相互靠拢，聚集起来。

盐析作用的另一个原因是由于中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去了水化膜，暴露出疏水区域，由于疏水区域的相互作用，使其沉淀。

盐离子强度与蛋白质溶解度之间的关系

LgS=β-Ksμ

蛋白质溶解度的对数值，与蛋白质的种类、温度和溶液pH有关，与无机盐种类无关。

Ks是盐析常数，与蛋白质和盐的种类有关，但与温度和pH无关

Ks盐析法：

在一定的pH和温度下改变离子强度（盐浓度）进行盐析

β盐析法：

在一定离子强度强度下仅改变pH和温度进行盐析，称作β盐析法。

影响盐析的因素：

无机盐种类、溶质、蛋白质浓度、温度、pH

二．盐析方法：

分步盐析法：

先低盐除杂，在高浓度沉淀目的物。

重复盐析法：

用与蛋白质浓度较高时

反抽提法:

先高浓共沉，再低浓除杂。

三．盐析注意事项：

首先要防止局部过浓，加固体盐时，须将盐粒磨细，在不断搅拌下分批缓缓加入到溶液中。

其次，盐析时的温度控制。

（二） 有机溶剂沉淀法

特点：

分辨率高，易除去，但易变性

有机溶剂沉淀法：

向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。

有机溶剂沉淀法原理答：

亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀；水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。

有机溶剂沉淀影响沉淀效果的因素有那些？

答：

（1）有机溶剂种类及用量 

（2）pH的影响 （3）温度无机盐的含量 （4）某些金属离子的助沉淀作用 （5）样品浓度 

等电点沉淀法，亲和沉淀法，成盐沉淀法。

。

。

。

。

。

。

第六章吸附分离法

特点：

设备简单、操作简便、价廉、安全，能分离性质相近的化学物质、但选择性不高、收率低（天然吸附剂）。

吸附作用：

物质从流体相浓缩到固体表面从而达到分离的过程称为吸附作用，在表面上能发生吸附作用的固体颗粒称为吸附剂，而被吸附的物质成为吸附物。

正吸附：

吸附有效成分负吸附：

吸附杂质。

11 

1、 吸附法（adsorption method）：

指利用吸附作用，将样品中的生物活性物质或杂质吸附于适当的吸附剂上，利用吸附剂对活性物质和杂质间吸附能力的差异，使目的物和其它物质分离，达到浓缩和提纯目的的方法。

2、 大网格高聚物吸附剂（macroreticular adsorbent）：

在合成树脂时，加入一种惰性组分，它不参与聚合反应，但能和单体互溶，称为致孔剂。

待网络骨架固化和链结构单元形成后，用溶剂萃取或水洗蒸馏的方法将致孔剂去掉，就留下了不受外界条件影响的永久孔隙，其孔径远大于2~4nm，可达到100nm甚至1000nm以上，故称“大孔”。

与大孔网状离子交换树脂相比，它不含离子交换树脂的功能团，仅保留了多孔的骨架，其性质与活性炭、硅胶等吸附剂相似，称为大孔网状聚合物吸附剂。

四、问答题 

2、影响吸附的因素有哪些？

1 吸附剂的特性：

吸附现象在界面发生，因此吸附剂比表面积愈大，吸附量愈多。

通过活化的方法也可增加吸附剂的吸附容量。

另外还要求吸附剂的机械强度好，吸附速度快

② 吸附物的性质：

能使表面张力降低的物质，易为表面所吸附；一般极性吸附剂易吸附极性物质，非极性吸附剂易吸附非极性物质；溶质从较易溶解的溶剂中被吸附时，吸附量较少；对于同系列物质，吸附量的变化是有规则的；吸附物若能与溶剂形成氢键，则吸附物极易溶于溶剂

③ 吸附条件：

温度：

吸附热越大，温度对吸附的影响越大。

PH值：

溶液的pH值溶液pH值可控制吸附剂或吸附物解离情况，进而影响吸附量，对蛋白质或酶类等两性物质，一般在等电点附近吸附量最大。

盐浓度：

溶剂的影响：

单溶剂与混合溶剂对吸附作用有不同的影响。

④ 吸附物浓度与吸附剂用量

一般情况下吸附物浓度大时，吸附量也大。

第七章凝胶层析

1、全排阻：

当具有一定分子量分布的高聚物溶液从柱中通过时，较大的分子完全不能进入颗粒内部，只能从颗粒间隙流过，称“全排阻”。

其流经体积最小，等于外水体积V0。

 2、2。

类分离：

 将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离或组分离.选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限，而小分子组的分子量小于渗入限。

大分子的分配系数Kd=0，小分子的Kd=1。

3、分级分离：

将分子量相差不大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，分级分离应尽量使待分离各物质的Kd值相差大些，并使分子量分布不在凝胶分离范围的一侧。

4、柱比：

层析柱的长度与直径的比值一般称作“柱比”。

5、操作压：

凝胶层析柱由于进出口之间液位压力差形成的对凝胶颗粒的压力称作“操作压”。

6、全渗入：

被分离组分的分子量小于该种凝胶的渗入限，其分子可以自由进出凝胶颗粒，这叫做“全渗入”。

 其流经体积最大，等于外水体积与内水体积之和，V0 ＋ Vi。

7、分离度Rs：

式中 Ve1、Ve2——对应于两个峰的淋出体积；W1、W2和σ1、σ2——两个峰宽度和标准偏差。

葡聚糖凝胶的性能与交联度的关系

编号

交联度

吸液量

膨胀速度

凝胶网孔

分离限

凝胶强度

大

小

大

慢

大

大

小

小

大

小

快

小

小

大

编号为其吸液量（每克干胶溶胀时吸水体积（ml）的十倍）sephadex-G-25每克干胶吸水量为2.5ml

类分离：

柱床体积与样品体积比5：

1-10:

1  流速快，节省时间，样品稀释程度小

分级分离         25：

1-100:

1 分辨率高流速慢，费时长，样品稀释严重

凝胶层析的应用1。

脱盐和浓缩，2分子量的测定3去热原4分离纯化

第八章 离子交换法

离子交换法：

利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作方法。

他们的结合是可逆的。

离子交换速度的影响因素：

树脂粒度：

颗粒大交换速度慢。

搅拌速度：

成正比

树脂交联度:

交联度大，交换速度慢

离子半径和离子价：

成反比

温度：

成正比

离子浓度：

成正比。

离子交换树脂的性能p229

第九章亲和纯化技术

亲和层析:

利用生物体中大分子物质具有与某些相应的分子专一性可逆结合的特性而建立的分离纯化技术。

2、亲和力大小除由亲和对本身的 解离常数 决定外，还受许多因素的影响，其中包括亲和吸附剂    微环境   、    载体空间位阻  、    载体孔径  、    配基和配体的浓度 、    配基结构   等。

亲和吸附流程：

（1）固定相制作（载体选择，配基偶联）

（2）配体吸附条件确定及制备。

（3）洗脱

影响吸附的条件：

离子效应、疏水基团、复合亲和力。

亲和层析的洗脱：

改变层析条件，使亲和复合物解离，从目的物吸附剂上脱离。

1．非专一性洗脱2特殊洗脱（不推荐使用）3专一性洗脱（竞争效应、非竞争效应、反竞争效应）

第十章 离心技术

离心分离的模式：

差分离心法、速度区带离心法、等密度区带离心法、密度梯度离心法

第十一章膜分离技术

透析法，超滤法，微孔膜过滤法的操作方法，用的膜的区别。

第十二章制备型高效液相色谱

分离度R=2（tr2-tr1）/W1+W2

制备型高效液相色谱仪的特点1大直径柱或大的进样量2溶质保留时间随负载增大而降低3峰形不对称或倾斜4生物大分子过载时柱效下降，分离度影响减小。

分离方案设计原则：

（1）一般样品经粗提后再用色谱方法

（2）负载量从大到小，分辨率由低到高（3）前面的方法尽量不妨碍后面的方法

第十四章微生物药物制造工艺

微生物药物有哪些种类：

抗生素、维生素类药物、氨基酸类药物、核酸类药物、酶与辅酶类药物、酶抑制剂、免疫调节剂、甾体类激素。

抗生素：

β-内酰胺类抗生素；青霉素类、头孢霉素类、硫霉素和橄榄酸霉素类、克拉维酸、诺卡菌素类。

氨基酸苷类抗生素：

新霉素、卡那霉素、庆大霉素、托普霉素。

大环内酯类抗生素：

红霉素

四环类抗生素:

四环素，金霉素，土霉素。

第十五章生物制品与生物技术药物制造工艺

生物制品：

以微生物、细胞、动物或人员组织和体液等为原料，应用传统技术活现代生物技术制成，用于人类疾病的预防、治疗和诊断。

思考题

含有乳清蛋白（pI=4.6）,B-乳球蛋白（pI=5.2）以及胰凝乳蛋白酶原（pI=9.5）的溶液用二乙酸乙基纤维素（DEAE-纤维素）pH为5.4的层析柱分离。

然后用pH为5.4的缓冲液洗脱，缓冲液中盐浓度逐步增加，请预测三种待分离蛋白组分的洗脱顺序并说明原因。

DEAE-纤维素是阴离子交换树脂

pH=5.4>pI=4.6所以溶液带负电可以吸附

pH=5.4>pI=5.2所以溶液带负电可以吸附

pH=5.4

pI=4.6离5.4更远所以带的电荷更多，与交换剂结合更紧密。

盐浓度逐步增加，洗脱能力逐步增强。