小鼠Mcm6基因电子克隆的验证.docx
- 文档编号:28096290
- 上传时间:2023-07-08
- 格式:DOCX
- 页数:17
- 大小:72.47KB
小鼠Mcm6基因电子克隆的验证.docx
《小鼠Mcm6基因电子克隆的验证.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《小鼠Mcm6基因电子克隆的验证.docx(17页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
小鼠Mcm6基因电子克隆的验证
小鼠Mcm6基因电子克隆的验证
摘要
小鼠Mcm6(Musmusculusminichromosomemaintenancedeficient6)基因是通过电子克隆获得的基因。
以liver,Mus.musculus为关键词检索得到UniGene数据库,选择其中一个EST序列D86726.1(种子序列)作为电子探针,获得该序列的电子延伸产物EST重叠群。
再与基因组草图进行序列校正,获得了全长为3191bp的cDNA序列。
该基因定位于小鼠1号染色体和8号染色体上,将该基因命名为Mcm6。
但这种根据“基因组草图搜索法”获得的全长cDNA序列,最后尚需要通过实验来验证。
本研究的目的就是通过实验来验证电子克隆基因Mcm6是否为真正具有生物学功能的基因。
本实验从新鲜的小鼠肝脏组织中提取总RNA,经逆转录合成cDNA。
根据Mcm6的电子克隆全长cDNA序列,在同一阅读框架终止密码子附近及其上游设计1条引物,在阅读框架起始密码子附近及其下游设计1条引物。
再以cDNA为模板,利用上述引物扩增目的基因片段,琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,扩增产物大小为379bp。
通过比较根据基因组草图搜索法预测的和实验扩增的目的片段大小,即可判断我们是否获得该基因的全长cDNA序列。
结果证实成功克隆该基因,因而验证了Mcm6基因电子克隆的正确性。
本实验为该基因功能的进一步研究奠定了基础。
关键词:
小鼠,Mcm6,电子克隆,逆转录,PCR扩增。
IdentificationofsillconcloninggeneMcm6
Abstract
Mcm6(Musmusculusminichromosomemaintenancedeficient6)geneisobtainedbysillconcloning.Firstofall,theyobtainaUniGeneclusterwhichrootsinMouse’sbrainbyusethekeywordMusmusculus,braintosearchesUniGenedatabase,thenwithoneESTsequenceD86726.1(Seedsequence)asanelectronicprobe,accesstotheelectronicextensionoftheESTproductsequencecontig.Withthedraftgenomesequencecorrection,accesstothefull-lengthcDNAsequencesof3191bp.Thegenelocatedinmousechromosome1andchromosome8.TheynameditMcm6gene.However,thisfull-lengthcDNAsequencesunderthe"draftgenomesearch"alsoneedstoverifythroughexperiments.ThepurposeofthisstudyistoverifywhetherMcm6isaBiologicalfunctionofgenesthroughexperiments.
InthisexperimentweextracttotalRNAfromfreshMusmusculuslivertissue,andsynthesiscDNAbyReverseTranscription.Accordingtothesillconcloningsequenceoffull-lengthcDNAofMcm6,designaprimernearthestopcodonanditsupstreaminthesamereadingframe,designanotherprimerinthereadingframeneartheinitiationcodonanditsdownstream.WemadethecDNAofmouselivertissueoftheMusmusculusasthetemplatetoamplifytheaimfragment,anddetectitbyagarosegelelectrophoresis.Thelengthoftheproductis379bp.Bycomparingthesizeaccordingtothedraftgenomeandtheaimfragmentbyexperiments,wecanidentifywhetherweobtainthegenesequenceofthefull-lengthcDNA.
TheresultsconfirmedthesuccessfulcloningofMcm6gene.ThustoverifythecorrectnessofMcm6obtainedbythesillconcloning.ThisexperimentlaidthefoundationforthefutherstudyofMcm6.
Keywords:
Musmusculus,Mcm6,sillconcloning,RT,PCR.
符号说明
缩写
全称
中文名称
EST
ExpressedSequenceTag
表达序列标签
GenBank
核酸序列数据库
NCBI
NationalCenterBiotechnologyInformation
美国国家生物技术信息中心
BLAST
BasicalLocalAlignmentSearchTools
基本局域联配搜寻工具,一种常用的序列数据库搜索工具
Contig
片段重叠群
CDS
CodingSequence
编码区序列
Kozak
Kozak(A/GNNATGG)
Kozak提出的起始密码子前后的固定的碱基序列
Musmusculus
小鼠
RNA
Deoxyribonucleicacid
核糖核酸
dNTP
Deoxynudeasidetriphosphate
脱氧核糖三磷酸
ORF
OpenReadingFrame
开放性阅读框架
PCR
Polymerasechainreaction
多聚酶链式反应
RT-PCR
ReverseTranscription-PCR
逆转录PCR
UniGene
UniGene
专门收集非冗余性的基因来源的clusters数据
Nrdatabase
non-redundantdatabase
非冗余数据库
Mcm6
Minichromosomemaintenancedeficient6
DEPC
Diethylpyrocarbonate
焦碳酸二乙酯
Dnase
Deoxyribonuclease
DNA酶
EDTA
Ethylenediaminetetra-aceticacid
乙二胺四乙酸
bp
Basepair
碱基对
Rnasin
RNaseinhibitor
十二烷基磺酸钠
引言
1.生物信息学简介
生物信息学以计算机、网络为工具,采用数学和信息科学的理论、方法和技术重点研究落核酸和蛋白质的序列、结构和功能。
以基因组DNA序列信息分析作为出发点,找到基因组序列中代表蛋白质和RNA基因的编码区。
同时,阐明基因组中大量存在的非编码区的信息实质,破译隐藏在DNA序列中的遗传语言规律。
利用计算机来协助克隆基因,称为“电子”基因克隆(sillconcloning),即采用生物信息学的方法延伸EST序列,以获得基因部分乃至全长的cDNA序列。
EST(ExpressedSequenceTag)即表达序列标签,是从cDNA的5'或3'端获取的短的DNA片段。
表达序列标签(EST)已成为人类寻找未知功能的新基因,以及克隆不同时空差异表达基因和疾病相关基因的重要标志物。
获得感兴趣的EST最有途径是使用BLAST检索程序寻找同源序列,然后将检出序列组装为重叠群(contig),以此重叠群为被检序列,重复进行BLAST检索与序列组装,延伸重叠样系列,重复以上过程,直到没有更多的重叠EST检出或者说重叠群序列不能继续延伸,有时可获得全长的基因编码序列。
获得这些EST序列数据后,再与GeneBank核酸数据库进行相似性检测,,假如具有精确匹配基因,将EST序列数据据EST六种阅读框翻译成蛋白质,接着与蛋白质序列数据库进行比较分析。
基因分析的结果大致有三种:
第一是已知基因,是研究对象为人类已鉴定和了解的基因;第二是以前未经鉴定的新基因;第三是未知基因,这部分基因之间无同种或异种基因的匹配。
2.RT-PCR简介
RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。
首先经逆转录酶的作用从RNA合成cDNA,再以cDNA为模板,扩增目的片段。
RT-PCR技术灵敏用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平,细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
RT-PCR把低丰度的mRNA扩增放大,易于检测。
运用此方法可检测单个细胞中少于10个拷贝的特异RNA。
应用:
(1)分析基因的转录产物;
(2)克隆cDNA及合成cDNA探针、改造cDNA序列等。
3.PCR简介
中文译为聚合酶链式反应,是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法,其扩增效率之高就像核裂变的“链式反应”那样。
经过数小时后,就能将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万倍,乃至千万倍,而无需通过烦琐费时的基因克隆程序便可获得足够数量的精确的DNA拷贝,又称为无细胞分子克隆法。
这种技术操作简单,容易掌握,结果也较为可靠。
为基因的分析与研究提供了一种强有力的手段,是现代分子生物学研究中的一项富有革命性的创举,对整个生命科学的研究与发展,都有着深远的影响。
在基因分析方面,PCR技术能够快速、灵敏地放大被测试的目的基因,可用于鉴定由基因缺失、突变、转位及致病基因所引起的各种疾病。
PCR技术已广泛地用于遗传病的基因分析和产前诊断、传染病原体的检测、癌基因的临床分析等方面。
PCR结合的分子杂交技术等分析方法,可进一步的提高检测灵敏度和准确性。
4.本实验的研究意义
前研究以小鼠(mouse)的肝脏(liver)为检索词,通过电子克隆获得了一个新基因Mcm6。
但该基因是否为真正的具有生物学功能的基因,最后尚需通过实验的方法来证实。
通过比较根据人类基因组草图搜索法预测的和实际扩增的目的片段大小,即可判断我们是否获得该基因的全长cDNA序列。
本研究的任务就是通过实验来验证此电子克隆基因Mcm6是否为真正具有生物学功能的基因。
本实验运用RT-PCR技术克隆该基因,分析了PCR条件对实验的影响。
从新鲜的小鼠肝脏组织中提取总RNA,然后用Oligo(dT)为引物,经逆转录酶的作用合成cDNA。
根据此新基因的电子克隆全长cDNA序列,在该终止密码子附近及其上游设计了引物,在阅读框架起始密码子附近及其下游设计了引物,再以逆转录得到的cDNA为模板,扩增,得到大量目的基因片段,电泳检测扩增结果。
结果证实该基因被成功克隆,验证了此电子克隆基因Mcm6的正确性。
本研究为该基因功能的进一步研究奠定基础。
第一章材料及仪器
1.1组织标本
新鲜小白鼠肝脏组织,取出后立即液氮研磨或液氮灌中保存待用。
1.2所需试剂及配制
(1)RNA的提取:
氯仿,异丙醇,70%的乙醇,无RNase的水,
0.1%二乙基焦碳酸脂(DEPC),Trizol试剂,液氮。
(2)RNA的检测:
5×TBE缓冲溶液的配置:
54gTris碱,23.5g的硼酸,0.5mol/LEDTA(pH=8.0)20mL,补足水至1L。
1.0%的琼脂糖;
10mg/MEB溶液。
(3)逆转录试剂盒:
MgCl2(25mmol/L);
ReverseTranscription10×Buffer;
dNTPs(10mmol/L);
RNasin(40U/μL);
AMV逆转录酶(24U/μL);
Oliga(dT);
Nuclease-free-water;
(4)cDNA的PCR扩增试剂盒:
10×PCRBuffer;
TaqDNA聚合酶;
dNTPs(10mmol/L);
dH2O;
(5)电泳:
DNAmarker(100bp)
LoadingBuffer
1.3引物设计
前研究以小鼠(mouse)的小脑(liver)为检索词,从GenBank中筛选出的EST序列,通过电子延伸,对EST序列进行修正、聚类、拼接和组装,获得cDNA序列。
实验在终止密码子附近及其上游设计了引物,在阅读框架起始密码子附近及其下游设计了引物。
在计算机上利用PCRDESN引物设计软件,引物设计结果如下:
gggggtaaagggagagagggaggggttagctcctcaagccaaaacaaccagagggtggg
primer-f
tgcgactacattgcgcatgggcaaaagcttcatggcgtatgcttttggcgcgaaaagtgcgtgcggtgggcggggctctgtacggaaccgccattgattggacgggtttggcgcgaagtagctcagctcctaccctgttattggctgaggtgagagggcggggctagccggaggcgcgcgctacgcgtggaacctgcggccgggctatctgcagctgcggactctcctccgcggtggtcttccctcagcagcgcgtactctcggcgccgccatggacctcgcagcggccgcggagcccggcgccggaagccagcacccggaggtgcgcgacgaggtggccgagaaatgccagaa
Primer-R
gctgttcctagacttcctggaagagttccagggtagtgatggagaaattaaatacttgcagtttgca
PrimerMcm6-F:
5’-CaaaAcaaccagagggtggg-3’Tm:
59.85℃
PrimerMcm6-R:
5’-acagcttctggcatttctcgg-3’Tm:
59.95℃
扩增片段大小:
379bp
引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.4仪器与设备
高速冷冻离心机5417R;紫外凝胶成像分析系统;
低温高速台式离心机;PCR仪FTGENE2D(PCR管);
电泳仪(水平式电泳槽);制冰机AF100A;
电热鼓风干燥箱101型;高压灭菌锅YXQ-LS-30;
电子天平BS124S;陶瓷研钵;
试剂瓶;Eppendorf微量离心管;
移液枪(枪头);铝合金盒;
液氮罐;超净工作台;
电热恒温培养箱303型;量筒;
微波炉;玻璃棒;
烧杯;手套口罩;
镊子;剪刀;
第二章方法与步骤
2.1RNA的提取
(1)匀浆:
取50—100mg冻存的组织放在研钵中液氮冻结,碾碎完全,加入适量的Trizol试剂(100mg/1mL)裂解组织,冰上放置5min。
(2)RNA的分离:
将液体吸入1.5mL的离心管中,加入0.2mL氯仿/mLTrizol试剂,盖好离心管,摇动混匀,放置冰上5min,然后于2-8℃于10000×g离心10min。
离心后混合物分三相:
最下层是红色的酚-氯仿相,中间相以上层水相,RNA绝大多数留于此水相。
(3)RNA的沉淀:
取上清液移到一新的离心管(约600mm),在其中加入等体积的异丙醇,每1mLTrizol加入0.5mL的异丙淳;混合均匀,以沉淀RNA,在冰上放置10min;然后在2-8℃于10000×g离心15min。
(4)RNA的洗涤:
去掉上清,加70%的乙醇洗涤RNA沉淀,1mlTrizol试剂加1mL70%的乙醇,然后2-8℃7500×g离心5min,弃上清,RNA沉淀倒立在滤纸上空气干燥5-10min。
(5)RNA的溶解:
RNA沉淀空气干燥5-10min,加入不含RNase的水溶解(约16ul),-20℃保存。
2.2RNA的检测
(1)配制0.5×TBE电泳缓冲液:
5×TBE缓冲液的成分是:
54gTris碱、23.5g硼酸、0.5mmol/LEDTA(PH8.0)20ml,补足水1升。
(2)制胶:
胶的浓度为1.0%,即称取1.0g琼脂糖加100mL0.5×TBE,微波炉中微火溶解至透明。
(3)冷却至60℃加入溴化乙锭(EB)(10mg/mL的终浓度为0.5mg/mL)。
(4)洗净有机玻璃制胶槽,放入梳子,倒胶厚度一般为3-5mm,待凝固。
(5)取出梳子,将胶槽放入电泳槽中加0.5×TBE,倒入同浓度的缓冲液,使液面高于胶面约1mm。
(6)点样:
5ulRNA+1ulLoadingBuffer。
(7)电泳条件设定:
80V电压,20~30min。
(8)检测:
紫外灯下观察结果,照相。
2.3逆转录(RT)反应(20μL体系)
(1)打开制冰机备用;
(2)取9.8uL先前用无RNase的水溶解的RNA于0.5mLPCR管中,PCR仪设定70℃10min,预变性。
预变性之后,取出轻轻弹几下,放置冰上(防止复性);
(3)补足RT反应液20μL,反应所需要的试剂如下:
MgCl
(25mmol/L)4μL;
10×Buffer2μL;
dNTPs(10mmol/L)2μL;
RNasin(40U/μL)0.5μL;
AMV逆转录酶(24U/μL)0.6μL;
Oligo(dT)1μL;
(4)加完以上试剂后,轻轻的弹几下,混匀。
在PCR仪中设定42℃,1h;95℃,5min;完成后-20℃冰箱保存。
2.4聚合酶链式扩增(PCR)
(1)取PCR管,依次加入下列试剂(反应体系共20uL):
10×PCR缓冲液2μL;
TaqDNA聚合酶0.4μL;
dNTPs(10mmol/L)0.4μL;;
20μmol/L上下游混合引物0.5μL
组织cDNA1μL;
补足无菌双蒸水15.7μL至20μL。
PCR仪中设定,条件如下:
95℃,预变性3min;94℃,变性40s,58℃,退火40s,72℃,延伸50s,28个循环;72℃,10min最后延伸。
4℃保存。
(2)电泳鉴定:
PCR产物于1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测,EB染色,紫外灯下观察结果,照相。
第三章结果
3.1小鼠肝脏组织RNA提取检测结果
新鲜小鼠肝脏组织提取的总RNA,1%琼脂糖凝胶电泳电泳检测结果有三条清晰的rRNA带:
28S,18S和5S,表明RNA未降解(图1)。
图1.1.0%总RNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果
3.2目的片段cDNA扩增结果
以小鼠肝脏组织cDNA为模版,根据电子克隆的cDNA全长设计的特异引物扩增的目的基因片段,PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,检测结果如下(图2):
M:
DNAmaker1:
目的基因条带
图2.PCR产物的1.0%琼脂糖凝胶电泳检测结果
实验结果显示,DNAmarker、目的片段条带清晰,无其他杂带。
扩增片段大小约400bp,与理论大小相符。
第四章讨论
4.1RNA提取质量讨论
4.1.1RNA提取准备工作
(1)实验用的试剂瓶、枪头、离心管、镊子、剪刀、电泳槽,烧杯等用必须洗净后用RNA酶的抑制剂0.1%的DEPC(焦碳酸二乙酯)浸泡12以上,然后灭菌去除DEPC,或将玻璃器皿于200℃干烤5小时以上,以去除RNAase污染。
(2)实验用的试剂必须用0.1%的DEPC处理过的水配制,然后灭菌去除DEPC。
双蒸水(ddH2O)应该用DEPC)进行处理:
每100mL溶液或水中加入0.1mLDEPC原液,放在摇床上充分混匀并在37℃下作用数小时.然后将溶液高压灭菌15min使DEPC失活.
4.1.2RNA提取流程注意事项
(1)最好是新鲜组织,这样RNA提取的效果比较好,要放到液氮预冷过的陶瓷研钵中,再研磨。
(2)一定要注意冰上操作,低温离心,离心机要预冷。
(3)RNA提取过程中操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换手套,去任何东西都要带着手套去取,提取过程中要尽量少说话,减少人员走动。
设置RNA操作专用实验室,所有器械等应为专用。
(4)每次取器材的时候都要用镊子去夹,镊子要在酒精灯上烧一下。
(5)异丙醇等都保证没有被RNA酶污染,不能用没有泡过DEPC的枪头去提取液体,一定要用DEPC浸泡过的枪头去吸。
如果发现试剂有可能被污染了,要立即更换。
(6)最后用75%的酒精洗一次就可以,尽量减少RNA提取时间。
(7)最后一步,用DEPC水溶解RNA,不要用太多的体积,以保证RNA的浓度。
RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周,-20℃保存一年。
提取完后,电泳观察结果,如果上面的两条带都比较清楚的话,说明RNA提取的不错,可以一次多逆转录几管。
不要把RNA冻存,以后在逆转录的效果不好,尽量尽快地逆转录。
RNA在低量存在时非常容易降解,任何保存方法都比不上不保存。
对RNA的电泳图谱检测,目的在于检测其28S和18S条带的完整性。
一般如果28s和18S条带明亮、清晰,条带边缘清晰,并且28S的亮度在18S条带的两倍以上,则认为是好的(图3)。
RNA(18s和28s)条带模糊可能表明由RNA酶引起的RNA的降解。
图3.1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量
4.2PCR引物设计原则
PCR扩增引物,是指与待扩增的靶DNA区段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸短片段。
引物的设计在整个PCR扩增中占十分重要的地位,引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。
若引物设计不合理,PCR反应的特异性及扩增效率均会降低。
引物设计的基本原则是最大限度的提高扩增效率和特异性,同时尽可能的抑制非特异性的扩增。
好的引物所具有的特点是:
(1)典型的引物为18-24个核苷酸。
引物需要足够长,保证序列的独特性,并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。
但长度大于24核苷酸的引物并不意味着有更高的特异性,较长的序列可能会与错误的配对序列杂交,降低了特异性,而且比较短的序列杂交慢,从而降低了产量。
(2)引物要与靶cDNA的两侧序列互补,但不能自我互补相互结合形成二聚体。
(3)引物的碱基应尽可能的随机分布,避免出现数个嘌呤或嘧啶的连续排列,选择GC含量为40%--60%。
(4)设计5′端和中间区为G或者C的引物,这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 小鼠 Mcm6 基因 电子 克隆 验证
![提示](https://static.bdocx.com/images/bang_tan.gif)