DNA提取和PCR.docx

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DNA提取和PCR

DNA提取和PCR

课题1DNA的粗提取与鉴定

一、基础知识

（一）提取DNA的方法

提取生物大分子的基本思路是选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。

对于DNA的粗提取而言，就是要利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。

（1）DNA的溶解性：

●DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。

●此外，DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。

利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离。

（2）DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性：

蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。

大多数蛋白质不能忍受60—80oC的高温，而DNA在80℃以上才会变性。

洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。

（二）DNA的鉴定

在沸水裕条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。

二、实验设计

（一）实验材料的选取

凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。

（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液

动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。

如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜。

例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。

注意：

不能用哺乳动物的成熟红细胞提取DNA。

（三）去除滤液中的杂质

方案一利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度的不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质。

方案二直接在滤液中加入嫩肉粉，反应10～15min，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能够分解蛋白质。

方案三将滤液放在60～75℃的恒温水浴箱保温10～15min，注意严格控制温度范围。

（四）DNA的析出与鉴定

1、将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等的、冷却的酒精溶液（体积分数为95%），静置2～3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA。

用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。

2、取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。

然后，向两支试管中各加入4ml的二苯胺试剂。

混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变蓝。

实例：

用鸡血细胞液粗提取DNA并鉴定

步骤

操作

图示

1、提取鸡血细胞的细胞核物质

将制备好的鸡血细胞液（已在课前配好）5~10mL，注入到50ml烧杯中。

向烧杯中加入蒸馏水20mL，同时用玻璃棒沿一个方向快速搅拌5min，然后，用放有纱布的漏斗将血细胞过滤至1000mL的烧杯中，取其滤液，滤液中含有核DNA和其它杂质。

2、溶解细胞核内的DNA

将物质的量浓度为2mol／L的NaCl溶液40mL加入到滤液中，并作玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA在溶液中充分溶解，其它一些杂质析出，过滤取其滤液。

3、析出含DNA的粘稠物

沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒沿一个方向不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现。

继续加入蒸馏水，溶液中出现的黏稠物会越来越多。

当黏稠物不再增加时停止加入蒸馏水。

4、滤取含DNA的粘稠物

用放多层纱布的漏斗，过滤溶液至1000mL的烧杯中。

取纱布上的黏稠物。

5、将DNA的粘稠物再溶解

取一个50mL烧杯，向烧杯内注入物质的量浓度为2mol／L的NaCl溶液20mL。

用钝头镊子将纱布上的黏稠物夹至NaCl溶液中，用玻璃棒沿一个方向不停地搅拌3min，使黏稠物尽可能多地溶解于溶液中。

6、过滤含DNA的氯化钠溶液

取一个100mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤以上溶液。

取其滤液（DNA溶于滤液中）。

7、提取含杂质较少的DNA

在上述滤过的溶液中，加入冷却的、体积分数为95％的酒精溶液50mL（加入时动作要慢），并作用玻璃棒沿一个方向搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。

当玻璃棒上出现丝状物缠绕时，继续慢慢搅拌，至不再增加时，用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。

8、DNA的鉴定

取两支20mL的试管，各加入物质的量浓度为2mol／L的NaCl溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。

然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。

混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，等试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。

三、操作提示

1、以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。

2、加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤地操作。

加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。

3、二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。

四、课题成果评价

1、是否提取出了DNA

观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备。

2、分析DNA中的杂质

本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖、RNA等杂质。

3、不同实验方法的比较

对于不同的实验方法，本课题可以采用分组的方法进行研究。

首先选取不同的实验材料，其次同种材料还可以采用不同方法，从多方面比较实验结果，如DNA的多少、颜色，二苯胺显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。

五、课题延伸

本课题使用的洗涤剂是多组分的混合物，在严格的科学实验中很少使用。

实验室提取高纯度的DNA时，通常使用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十二烷基硫酸钠（SDS）或吐温等化学试剂。

【教材答案】

（一）旁栏思考题

1．为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？

答：

蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂（细胞膜和核膜的破裂），从而释放出DNA。

2．加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？

答：

洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。

3．如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？

答：

研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。

4．此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？

答：

可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。

5．为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？

答：

用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。

因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。

6．方案二与方案三的原理有什么不同？

答：

方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。

例题1．下列关于高中生物学实验的叙述，正确的是

A．在制备果酒和果醋的实验过程中都要持续通入氧气

B．分离土壤中不同种类的微生物需采用相同的稀释度

C．将DNA粗提取后用二苯胺进行鉴定时需要进行水浴加热

D．选择过氧化氢酶作为探究温度对酶活性影响实验的理想材科

答案C

例题2、下列实验材料、用具的改变，对实验结果影响最小的是

Ａ．用二苯胺试剂代替甲基绿染色观察ＤＮＡ的分布

Ｂ．大蒜根尖代替洋葱根尖观察植物细胞有丝分裂

Ｃ．0.14mol/LNaCL代替2mol/LNaCL溶解DNA

D．蒸馏水代替层析液进行叶绿体色素的分离

答案.B

DNA、RNA和蛋白质相关术语拓展

顺式作用元件（cis-actingelement）是指存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列。

顺式作用元件包括启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等，它们的作用是参与基因表达的调控。

顺式作用元件本身不编码任何蛋白质，仅仅提供一个作用位点，要与反式作用因子相互作用而起作用。

反式作用因子是指能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上参与调控靶基因转录效率的蛋白质，有时也称转录因子。

大多数真核转录调节因子由某一基因表达后，可通过另一基因的特异的顺式作用元件相互作用，从而激活另一基因的转录。

这种调节蛋白称为反式作用因子。

反义脱氧核苷酸就是和mRNA链互补的脱氧核苷酸链。

可以诱导mRNA的降解，导致基因的沉默。

反义RNA是指与靶RNA（多为mRNA）具有互补序列的RNA分子，通过与靶RNA进行碱基配对结合的方式，参与基因的表达调控。

反义核酸是指能与特定mRNA精确互补、特异阻断其翻译的RNA或DNA分子。

利用反义核酸特异地封闭某些基因表达，使之低表达或不表达，这种技术即为反义核酸技术。

例题1．基因转录出的初始RNA，经不同方式的剪切可被加工成翻译不同蛋白质的mRNA。

某些剪切过程不需要蛋白质性质的酶参与。

大多数真核细胞mRNA只在个体发育的某一阶段合成，不同的mRNA合成后以不同的速度被降解。

下列判断不正确的是

A．某些初始RNA的剪切加工可由RNA催化完成

B．一个基因可能参与控制生物体的多种性状

C．mRNA的产生与降解与个体发育阶段有关

D．初始RNA的剪切、加工在核糖体内完成

答案D

例题2．单细胞生物四膜虫转录形成的一种前体RNA，在仅含核苷酸和纯化的前体RNA的溶液中，发生了RNA内部部分序列的有序切除。

下列相关叙述不正确的是

A．该RNA的基本单位是核糖核苷酸

B．该RNA的剪切可能是由自身催化的

C．该RNA剪切所需的酶是由自身翻译形成

D．该RNA的剪切过程会受到温度、pH的影响

答案C

例题3.（18分）RNA具有多种功能，请回答下列与RNA有关的问题：

（1）在细胞生物中，DNA是遗传物质，RNA帮助其实现功能。

其中，RNA能够帮助_________酶合成子代DNA分子，实现DNA__________________的功能。

另外，在遗传信息表达过程中，mRNA的功能是__________________,在翻译过程中，_________________也发挥了关键作用。

（2）RNA一般是单链分子，但也可遵循_________原则形成部分双链,再折叠产生复杂的空间结构。

同时，与DNA相比，RNA中的五碳糖是_________，其分子含有游离的羟基，这两个特点使RNA具有催化潜能。

（3）四膜虫体内存在具有剪切底物分子能力的某种RNA分子（核酶）。

正常情况下，核酶需要Mg2+的辅助，在实验条件下让核酶处于Ca2+环境中，进行RNA分子群体的选择实验，实验结果如图21所示。

该结果表明四膜虫产生了在Ca2+环境中_________的核酶，其原因是某些碱基被替换，发生了_________,通过_________适应环境的个体逐渐增多。

答案．（18分）

（1）DNA聚合传递遗传信息（携带遗传信息）将遗传信息从DNA传递给蛋白质tRNA和rRNA（转运RNA和核糖体RNA；tRNA；转运RNA）

（2）碱基互补配对核糖（3）催化活性更高（剪切能力更强）基因突变选择作用（人工选择；自然选择）

例题4.（18分）凋亡抑制蛋白与肿瘤的发生、发展有关，科学家利用先天无胸腺的裸鼠，探究凋亡抑制蛋白基因的反义脱氧核苷酸链对肠癌肿瘤的抑制作用。

请分析回答下列问题：

（1）人工合成部分序列为5’GGCAAC…………ACCCAT3’反义脱氧核苷酸链，能够与凋亡抑制蛋白基因的__________配对结合，使其分子构象发生改变，不能与____________结合，抑制翻译。

请写出凋亡抑制蛋白基因的部分序列：

____________。

另外，人工合成的序列不应与人类其他基因的碱基序列相同，以避免该序列________。

（2）将肠癌细胞置于含5%__________的恒温培养箱中培养，对培养细胞用0.4%台盼蓝染料染色，拒染率＞95%，说明绝大部分培养细胞为活细胞，其细胞膜具有___________性。

将拒染的细胞制成单细胞悬液，每只实验裸鼠接种等量的单细胞悬液于背部皮下，2周左右成瘤，成瘤率为100%。

成瘤率为100%的原因是裸鼠________________________________。

（3）将若干只生长状况相同的裸鼠等分为两组，对皮下瘤体分别注射适量含_________________的生理盐水和等量的生理盐水，检测_______________，计算抑制率，抑制率=（1‒治疗组瘤重量/对照组瘤重量）×100%。

若抑制率_______________，则说明反义脱氧核苷酸链能够明显抑制裸鼠肠癌移植瘤的生长。

答案.（除注明外，每空2分，共18分）

（1）mRNA核糖体（见右图）

干扰人类其他基因的表达

（2）CO2（1分）选择透过（1分）无胸腺，失去特异性免疫，对接种的肠癌细胞没有排斥反应

（3）反义脱氧核苷酸链瘤体重量（更加）接近100%

例题5（18分）为确定遗传信息从DNA传递给蛋白质的中间载体，科学家们做了如下研究。

（1）依据真核细胞中____________位于细胞核内，而蛋白质合成在核糖体上这一事实，科学家推测存在某种“信使”分子，能将遗传信息从细胞核携带到细胞质中。

（2）对于“信使”有两种不同假说。

假说一：

核糖体RNA可能就是信息的载体；假说二：

另有一种RNA（称为mRNA）作为遗传信息传递的信使。

若假说一成立，则细胞内应该有许多________（填“相同”或“不同”）的核糖体。

若假说二成立，则mRNA应该与细胞内原有的__________结合，并指导蛋白质合成。

（3）研究发现噬菌体侵染细菌后，细菌的蛋白质合成立即停止，转而合成噬菌体的蛋白质，在此过程中，细菌细胞内合成了新的噬菌体RNA。

为确定新合成的噬菌体RNA是否为“信使”，科学家们进一步实验。

115NH4Cl和13C-葡萄糖作为培养基中的____________和碳源来培养细菌，细菌利用它们合成_______________等生物大分子。

经过若干代培养后，获得具有“重”核糖体的“重”细菌

2将这些“重”细菌转移到含14NH4Cl和12C-葡萄糖的培养基上培养，用噬菌体侵染这些细菌，该培养基中加入32P标记的__________核糖核苷酸为作为原料，以标记所有新合成的噬菌体RNA。

3将上述被侵染后裂解的细菌进行密度梯度离心，结果如下图所示。

由图可知，大肠杆菌被侵染后___________（填“合成了”或“没有合成”）新的核糖体，这一结果否定假说一。

32P标记仅出现在离心管的____________，说明__________________与“重”核糖体相结合，为假说二提供了证据。

（4）若要证明新合成的噬菌体RNA为“信使”，还需要进行两组实验，请选择下列序号填入表格。

1新合成的噬菌体RNA与细菌DNA混合

2将新合成的噬菌体RNA与噬菌体DNA混合③出现DNA-RNA杂交现象

3出现DNA-RNA杂交现象

4不出现DNA-RNA杂交现象

组别

实验处理

预期结果

1

2

答案.（18分）

（1）DNA（或“基因”）（1分）

（2）不同（2分）核糖体（2分）

（3）①氮源（1分）蛋白质和核酸（2分）

②尿嘧啶（2分）

③没有合成（2分）底部（1分）新合成的噬菌体RNA（2分）

组别

实验处理

预期结果

1

②

③

2

①

④

（4）如右表（3分）

注：

1组与2组可整组互换位置，但全部填写正确才可得分。

例题6．（18分）普通番茄细胞中含多聚半乳糖醛酸酶基因（用A表示），控制细胞产生多聚半乳糖醛酸酶，该酶能破坏细胞壁，使番茄易软化，不耐储藏。

抗多聚半乳糖醛酸酶基因可以使番茄不再产生多聚半乳糖醛酸酶，从而使番茄长时间抗软化，容易储存和运输。

下图是通过基因工程培育抗软化耐储藏番茄的过程及原理。

请分析回答下列问题：

（1）普通番茄（AA）也可以通过__________育种的方法，最终获得基因型为aa（不能合成多聚半乳糖醛酸酶）的抗软化、耐储存的番茄。

（2）利用基因工程将目的基因导入植物细胞，目前采用最多的方法是__________，该方法中用到的目的基因载体是__________，目的基因需插入到该基因载体的__________上。

（3）将抗多聚半乳糖醛酸酶基因导入番茄细胞所需要的工具酶有____________。

（4）图1中获得导入抗多聚半乳糖醛酸酶基因的番茄细胞，需要经过__________技术获得转基因番茄，这个过程需要在条件下进行，细胞先经脱分化形成__________，再形成丛芽和根。

（5）根据图2分析抗多聚半乳糖醛酸酶基因能使番茄抗软化的原理是两个基因分别转录出的mRNA__________，从而阻断了__________过程。

答案．（除注明外，其余每空2分）

（1）诱变

（2）农杆菌转化法Ti质粒T-DNA

（3）限制酶和DNA连接酶

（4）植物组织培养（1分）无菌愈伤组织（1分）

（5）结合形成双链RNA多聚半乳糖醛酸酶基因的表达

课题2PCR扩增反应的操作

第一节PCR扩增反应的基本原理

一、聚合酶链式反应（PCR）的基本构成

PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术。

PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。

在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热TaqDNA聚合酶、Mg2+等。

反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在TaqDNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。

因此PCR循环过程为三部分构成：

模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成（见图）。

1．模板DNA的变性

模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。

变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。

故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。

对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。

2．模板DNA与引物的退火

将反应混合物温度降低至37~65℃时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-引物复合物。

退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。

一般要求引物的浓度大大高于模板DNA的浓度，并由于引物的长度显著短于模板的长度，因此在退火时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多，退火时间一般为1～2min。

3．引物的延伸

DNA模板-引物复合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板DNA链互补的新链。

重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。

在72℃条件下，TaqDNA聚合酶催化的合成速度大约为40～60个碱基/秒。

经过一轮“变性-退火-延伸”循环，模板拷贝数增加了一倍。

在以后的循环中，新合成的DNA都可以起模板作用，因此每一轮循环以后，DNA拷贝数就增加一倍。

每完成一个循环需2～4min，一次PCR经过30～40次循环，约2～3h。

扩增初期，扩增的量呈直线上升，但是当引物、模板、聚合酶达到一定比值时，酶的催化反应趋于饱和，便出现所谓的“平台效应”，即靶DNA产物的浓度不再增加。

PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。

反应最终的DNA扩增量可用Y＝（1＋X）n计算。

Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示（Y）平均每次的扩增效率，n代表循环次数。

平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。

反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数。

PCR扩增效率、DNA聚合酶的种类和活性、非特异性产物的竟争等因素都会影响平台期数。

大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。

二、PCR反应的五个元素

参与PCR反应的物质主要为五种：

引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。

1．引物

引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。

理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

引物设计有3条基本原则：

首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。

引物的选择将决定PCR产物的大小、位置、以及扩增区域的Tm值。

好的引物设计可以避免背景和非特异产物的产生，甚至在RNA-PCR中也能识别cDNA或基因组模板。

引物设计也极大的影响扩增产量：

若使用设计粗糙的引物，产物将很少甚至没有；而使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反应指数期的产量理论值。

当然，即使有了好的引物，依然需要进行反应条件的优化，比如调整Mg2+浓度，使用特殊的共溶剂如二甲基亚砜、甲酰胺和甘油。

对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。

（1）引物长度

PCR特异性一般通过引物长度和退火温度来控制。

引物的长度一般为15-30bp，常用的是18～27bp，但不应大于38bp。

引物过短时会造成Tm值过低，在酶反应温度时不能与模板很好的配对；引物过长时又会造成Tm值过高，超过酶反应的最适温度，还会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应，而且合成长引物还会大大增加合成费用。

（2）引物碱基构成

引物的G+C含量以40～60%为宜，过高或过低都不利于引发反应，上下游引物的GC含量不能相差太大。

其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5～10℃。

若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计