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RTPCR实验步骤及注意事项
RT-PCR实验步骤及注意事项
RT-PCR实验步骤及注意事项
如果内参照有,目的没有,至少证明不是"美丽惹"的祸.原因书里应该都说了.
在所有RNA实验中,最关键的因素是分离得到全长的RNA。
而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。
由于RNA酶广泛存在而稳定,一般反应不需要辅助因子。
因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解,而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果,所以RNA的制备与分析操作难度极大。
在实验中,一方面要严格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。
RNA酶可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等。
外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等,也可存在于灰尘中。
在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。
这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。
而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。
一、防止RNA酶污染的措施
1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意:
有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用)。
3.有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在3%H2O2室温10min,然后用0.1%DEPC水冲洗,晾干。
4.配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC,在37℃处理12hr以上。
然后用高压灭菌除去残留的DEPC。
不能高压灭菌的试剂,应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制,然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换。
6.设置RNA操作专用实验室,所有器械等应为专用。
二、常用的RNA酶抑制剂
1.焦磷酸二乙酯(DEPC):
是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。
它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,从而抑制酶的活性。
2.异硫氰酸胍:
目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂,它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。
它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对RNA酶有强烈的变性作用。
3.氧钒核糖核苷复合物:
由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNA酶的活性。
4.RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin):
从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。
RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNA酶结合,使其失活。
5.其它:
SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。
mRNA的分离与纯化
真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5’端帽子结构(m7G)和3’端的Poly(A)尾巴。
绝大多数哺乳类动物细胞mRNA的3’端存在20-30个腺苷酸组成的Poly(A)尾,通常用Poly(A+)表示。
这种结构为真核mRNA的提取,提供了极为方便的选择性标志,寡聚(dT)纤维素或寡聚(U)琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。
mRNA的分离方法较多,其中以寡聚(dT)-纤维素柱层析法最为有效,已成为常规方法。
此法利用mRNA3’末端含有Poly(A+)的特点,在RNA流经寡聚(dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液的作用下,mRNA被特异地结合在柱上,当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下,mRNA被洗脱,经过两次寡聚(dT)纤维柱后,即可得到较高纯度的mRNA。
寡聚(dT)纤维素柱纯化mRNA
一、试剂准备
1.3M醋酸钠(pH5.2)
2.0.1MNaOH
3.1×上样缓冲液:
20mMTris-HCl(pH7.6);0.5MNaCl;1MEDTA(pH8.0);0.1%SLS(十二烷基氨酸钠。
配制时可先配制Tris-HCl(pH7.6)、NaCl、EDTA(pH8.0)的母液,经高压消毒后按各成分确切含量,经混合后再高压消毒,冷却至65℃时,加入经65℃温育(30min)的10%SLS至终浓度为0.1%。
4.洗脱缓冲液:
10mMTris-HCl(pH7.6);1mMEDTA(pH8.0);0.05%SDS
5.无水乙醇、70%乙醇
6.DEPC
二、操作步骤
1.将0.5-1.0g寡聚(dT)-纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。
2.用DEPC处理的1ml注射器或适当的吸管,将寡聚(dT)-纤维素装柱0.5-1ml,用3倍柱床体积的DEPCH2O洗柱。
3.使用1×上样缓冲液洗柱,直至洗出液pH值小于8.0。
4.将RNA溶解于DEPCH2O中,在65℃中温育10min左右,冷却至室温后加入等体2×上样缓冲液,混匀后上柱,立即收集流出液。
当RNA上样液全部进入柱床后,再用1×上样缓冲液洗柱,继续收集流出液。
5.将所有流出液于65℃加热5min,冷却至室温后再次上柱,收集流出液。
6.用5-10倍柱床体积的1×上样缓冲液洗柱,每管1ml分部收集,OD260测定RNA含量。
前部分收集管中流出液的OD260值很高,其内含物为无Poly(A)尾的RNA。
后部分收集管中流出液的OD260值很低或无吸收。
7.用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱Poly(A+)RNA,分部收集,每部分为1/3-1/2柱体积。
8.OD260测定Poly(A+)RNA分布,合并含Poly(A+)RNA的收集管,加入1/10体积3MNaAc(pH5.2)、2.5倍体积的预冷无水乙醇,混匀,-20℃放置30min。
9.4℃离心,10000g×15min,小心吸弃上清。
用70%乙醇洗涤沉淀。
[注意:
此时Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到]。
4℃离心,10000g×5min,弃上清,室温晾干。
10.用适量的DEPCH2O溶解RNA。
三、注意事项
1.整个实验过程必须防止Rnase的污染。
2.步骤(4)中将RNA溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个,一个是破坏RNA的二级结构,尤其是mRNAPoly(A+)尾处的二级结构,使Poly(A+)尾充分暴露,从而提高Poly(A+)RNA的回收率;另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合,否则会导致rRNA的污染。
所以此步骤不能省略。
3.十二烷基肌氨酸钠盐在18℃以下溶解度下降,会阻碍柱内液体流动,若室温低于18℃最好用LiCl替代NaCl。
4.寡聚(dT)-纤维素柱可在4℃贮存,反复使用。
每次使用前应该依次用NaOH、灭菌ddH2O、上样缓冲液洗柱。
5.一般而言,107哺乳动物培养细胞能提取1-5μgPoly(A+)RNA,约相当于上柱总RNA量的1%-2%。
RNA酶保护试验((RNaseProtectionAssay,RPA)是通过液相杂交的方式,用反义RNA探针与样品杂交,以检测RNA表达的技术。
与Northern杂交和RT-PCR比较,RPA有以下几个优点:
1.检测灵敏度比Northern杂交高。
由于Northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失,使灵敏度下降,而RPA将所有杂交体系进行电泳,故损失小,提高了灵敏度。
2.由于PCR扩增过程中效率不均一和反应“平台”问题,基于PCR产物量进行分析所得数据的可靠性将下降,而RPA没有扩增过程,因此,分析的数据真实性较高。
3.由于与反义RNA探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段,因此,部分降解的RNA样品仍可进行分析。
4.步骤较少,耗时短。
与Northern杂交相比,省去了转膜和洗膜的过程。
5.RNA-RNA杂交体稳定性高,无探针自身复性问题,无须封闭。
6.一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交,无竞争性问题。
7.检测分子长度可以任意设置,灵活性大。
RPA的缺点是需要同位素标记探针。
一、试剂准备
1.GACUPOOL:
取100mMATP、CTP、GTP各2.78μl、100mMUTP0.06μl,加DEPCH2O至100μl。
2.杂交缓冲液IPES0.134g、0.5MEDTA(pH8.0)20μl、5MNaCl0.8ml、甲酰胺8ml,加DEPCH2O至10ml。
3.RNase消化液:
5MNaCl120μl、1MTris-HCl(pH7.4)20μl、0.5MEDTA(pH8.0)20μl、RNaseA(10mg/ml)8μl、RNaseT1(250U/μl)1μl,加DEPCH2O至2ml
二、操作步骤
1.反义RNA可由含T7或SP6启动子的重组质粒为模板制备,也可以用含启动子的PCR产物为模板制备,本文介绍后者。
(1)设计含T7启动子的PCR引物
由于PCR产物将作为合成反义RNA的模板,所以一对引物中的下游引物5’-端要含T7启动子序列:
T7启动子序列为:
5’-TAATACGACTCACTATAGGG
引物设计的其他要求与一般PCR引物的设计相同。
PCR产物的长度决定了反义RNA探针的长度,具体设计时可考虑100-400bp长。
最好采用巢式PCR,即先扩增出一较长的片段,再以该片段为模板扩增出较短的片段,以保证探针的特异性,如下图所示:
上游引物
下游引物ⅡT7启动子序列
下游引物Ⅰ
(2)PCR
先用上游引物和下游引物Ⅰ进行PCR,再以PCR产物为模板,用上游引物和下游引物Ⅱ-T7进行二次PCR(具体操作参见PCR章节)。
(3)探针合成标记与纯化
在0.5ml离心管中加入下列试剂:
RNasin(40U/μl)0.5μl
GACUPOOLGAC
(含GTP、CTP、ATP各2.75mM,UTP61μM)2μl
[α-32P]UTP(10μCi/μl)2.5μl
DTT(二硫苏糖醇,0.1M)1μl
5×转录buffer2μl
模板(50ng/μl)1μl
T7RNA聚合酶(15U)1μl
混合后,短暂离心,37OC保温1hr。
加入DNaseⅠ(10U/μl)1μl,37OC15min,然后75OC10min以灭活DNAseⅠ和T7RNA聚合酶。
加入:
饱和酚50μl
氯仿50μl
酵母tRNA(2μg/μl)4μl
DEPCH2O100μl
室温下充分混匀,离心10000g×2min。
取上层液置另一0.5ml离心管中,加入100μl氯仿,混匀,离心10000g×2min。
将上层液转移至另一0.5ml离心管中,再加入3MNaAc10μl、预冷无水乙醇250μl,混匀后,-20OC静置30min。
4OC离心13500g×10min。
弃上清液,沉淀用75%乙醇100μl洗涤,4OC离心13500g×2min,弃上清液。
室温下挥发残留乙醇。
加入50μl杂交缓冲液溶解沉淀,4OC下保存待用。
可用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。
(参见本节电泳步骤)。
2.杂交
(1)RNA提取后溶解在杂交缓冲液中,浓度为1μg/μl。
(2)取8μlRNA加入1-3μl探针(根据探针检测结果调整)于0.5ml离心管中。
(2)80OC保温2min,然后40-45OC下杂交12-18hr。
3.消化
(1)杂交管于37OC保温15min,加入RNase消化液,37OC保温30min。
(2)加入10%SDS10μl、10μg/μl蛋白酶K20μl,混匀,37OC保温10min。
(3)加入65μl饱和酚和65μl氯仿,混匀,室温离心,10000g×2min。
(4)转移上层液到另一0.5离心管中,加入10μl酵母tRNA和3MNaAc15μl,再加入200μl异丙醇,混匀后,置-20OC30min,4OC离心,135000g×10min。
(5)弃上清液,室温下挥发乙醇,加入5-8μl上样缓冲液溶解沉淀。
4、电泳与放射自显影
(1)配制凝胶:
(50ml)
40%丙烯酰胺-亚甲双丙烯酰胺(19:
1)6.25ml
5×TBE10ml
尿素24g
加H2O至50ml
溶解后加入25%过硫酸胺50μl,TEMED50μl,混匀,注入电泳槽中,插入梳,待胶凝固。
(2)预电泳
以1×TBE为上下槽电泳缓冲液,加上电压后进行预电泳,如果用测序电泳装置,电压应达2000v以上,功率设定为100w,温度设为50OC。
待胶板温度达50OC时,暂停电泳,准备加样。
(3)加样
将已溶解在加样缓冲液中的样品80OC加热2min,立即加样到胶孔中,电泳1-2hr。
(电泳条件同预电泳)。
(3)电泳结束后,打开胶板,用滤纸取下胶,覆上一层保鲜膜,放置于暗盒中,暗室红光下,压上一张X片,盖上暗盒,-70OC曝光1-3天。
暴光结束后,将X光片显影、定影、水洗、晾干。
三、注意事项
1.本实验大部分为RNA操作,注意RNA酶的污染。
2.RNase消化液消化未杂交的单链RNA和探针RNA,当探针与样品之间有碱基错配时,错配位点也将被消化,因此会产生片段较小的杂交片段。
因此进行PCR时,采取尽量减少错配的措施。
3、同位素对RNA合成有一定影响,有时会产生非全长的探针。
因此,标记时间不宜过长。
4、RNase消化液有时会产生过度消化而无检测信号,可以将消化液稀释10-100倍后使用。
可能问题出在标本的保存:
一般四小时之内就应处理,分离出细胞
说的是套式PCR,可以在你的第一次PCR两个引物内,再设计一对引物进行第二次PCR就行了
如果你的第一次PCR刚好包括目的片段,那只好设计个更长的了
第二次的引物设计要求可以低一点
以50μl体系为例
引物各1μl
第一次PCR产物5μl
二次PCR和巢式PCR,即设计两对引物进行扩增,不是一个概念,它是拿第一次的PCR产物,稀释100-1000倍做模板,加入底物,从新进行扩增反应,以期增加产物的量
我做RT-PCR时,提总RNA时,都是用灭菌DEPC水,按1:
100稀释后测OD260和OD280,后根据公式:
RNA浓度=OD260*稀释度/25(ug/ul),后用1mgtotalRNA分离mRNA.做逆转录及PCR,效果很好.
luoyu10wrote:
各位大哥:
我有一个问题请教,RT-PCR要求模板RNA的260nm/280nm的比值最低为多少,如果太低是不是会影响结果?
最低到1.8,最好2.0,我感觉稍微低一点影响不算太大。
问:
我是RT-PCR的新手,想请教引物如何设计?
好的引物所具有的令人满意的特点:
* 典型的引物18到24个核苷长。
引物需要足够长,保证序列独特性,并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。
但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。
较长的序列可能会与错误配对序列杂交,降低了特异性,而且比短序列杂交慢,从而降低了产量。
* 选择GC含量为40%到60%或GC含量反映模板GC含量的引物。
* 设计5’端和中间区为G或C的引物。
这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。
* 避免引物对3’末端存在互补序列,这会形成引物二聚体,抑制扩增。
* 避免3’末端富含GC。
设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。
* 避免3’末端的错误配对。
3’端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。
* 避免存在可能会产生内部二级结构的序列,这会破坏引物退火稳定性。
目的序列上并不存在的附加序列,如限制位点和启动子序列,可以加入到引物5’端而不影响特异性。
当计算引物Tm值时并不包括这些序列,但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。
有时候,仅有有限的序列信箱可供用于引物设计。
比如,如果仅知道氨基酸序列,可以设计简并引物。
简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。
为了增加特异性,可以参考密码子使用表,根据不同生物的碱基使用偏好,减少简并性。
次黄嘌呤可以同所有的碱基配对,降低引物的退火温度。
不要在引物的3’端使用简并碱基,因为3’端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR。
使用较高的引物浓度(1μM到3μM),因为许多简并混合物中的引物不是特异性针对目的模板。
【经验】如何确认RNA的质量
各位都知道,提取到质量良好的RNA(包括总RNA和mRNA,以下同)是非常困难,关于RNA的提取技术,我就不说了,为什么呢?
或许各位非常关心呢,我是这样想的,我可以看到的资料或者是厂家的说明书,各位也同样可以看到的,内容当然都是一样的了,所以实验做的好不好,主要是心的投入多少的问题,所以希望大家自己多多思考啊!
以下两种方法,相信大家都知道的:
1)检测RNA溶液的吸光度
280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景(溶液浑浊度)、盐浓度和蛋白等有机物的值。
一般的,我们只看OD260/OD280(Ratio,R)。
1.82.0时,我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的,不过要注意,当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时,R值可能会大于2(一般应该是<2.2的)。
当R<1.8时,溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显,你可以根据自己的需要决定这份RNA的命运。
当R>2.2时,说明RNA已经水解成单核酸了。
如果RNA的量够,可在260nm(A260)用分光光度法测定RNA的得率,1个单位等于40ug/mlssRNA。
纯RNA的A260/A280的比值为2.0。
A260/A230的比值还表明RNA的纯度,其值小于2.0表明裂解液中有亚硫氰胍和belta-巰基乙醇残留,其值大于2.4,需用乙酸盐,乙醇沉淀RNA。
2)RNA的电泳图谱
一般的,RNA的电泳都是用变性胶进行的,但是根据我的经验,如果你仅仅是为了检测RNA的质量是没有必要进行如此麻烦的实验的,用普通的琼脂糖胶就可以了。
电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值,或者是mRNAsmear的完整性。
一般的,如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利(指条带的边缘清晰),并且28S的亮度在18S条带的两倍以上,我们认为RNA的质量是好的(见下图)。
以上是我们常用的两种方法,但是这两种方法都无法明确的告诉我们RNA溶液中有没有残留的RNA酶。
如果溶液中有非常微量的RNA酶,用以上方法我们很难察觉,但是大部分后续的酶学反应都是在37度以上并且是长时间进行的。
这样,如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶,那么在后续的实验中就会有非常适合的环境和时间发挥它们的作用了,当然这时你的实验也就完了。
下面,我们介绍一个可以确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法。
3)保温试验
方法很简单的,按照样品浓度,从RNA溶液中吸取两份1000ng的RNA加入至0.5ml的离心管中,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10ul的总体积,然后密闭管盖。
把其中一份放入70℃的恒温水浴中,保温1h。
另一份放置在-20℃冰箱中保存1h。
时间到了之后,取出两份样本进行电泳。
电泳完成后,比较两者的电泳条带。
如果两者的条带一致或者无明显差别(当然,它们的条带也要符合方法2中的条件),则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染,RNA的质量很好。
相反的,如果70℃保温的样本有明显的降解,则说明RNA溶液中有RNA酶污染。
如果你的RNA样本通过了保温实验的检测并且你在后续的实验中还是非常小心的防范RNA酶的骚扰,那么你的实验应该是很难失败了!
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