缓冲液的配制方法.docx
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缓冲液的配制方法
核酸电泳【2】相干试剂.缓冲液的配制办法
50×TAEBuffer(pH8.5)
组份浓度2MTris-醋酸,100mMEDTA
配制量1L
配制办法1.称量下列试剂,置于1L烧杯中.
Tris
242g
Na2EDTA·2H2O
37.2g
2.向烧杯中参加约800ml的去离子水,充分搅拌消融.
3.参加57.1ml的乙酸,充分搅拌.
4.加去离子水将溶液定容至lL后,室温保存.
10×TBEBuffer(pH8.3)
组份浓度890mMTris-硼酸,20mMEDTA
配制量1L
配制办法l.称量下列试剂,置于lL烧杯中.
Tris
108g
Na2EDTA·2H2O
7.44g
硼酸
55g
2.向烧杯中参加约800ml的去离子水,充分搅拌消融.
3.加去离子水将溶液定容至lL后,室温保存.
10×MOPS(3-吗啉基丙磺酸)Buffer
组份浓度200rnMMOPS,20mMNaOAc,10mMEDTA
配制量1L
配制办法1.称41.8gMOPS,置于1L烧杯中.
2.加约700mlDEPC处理水,搅拌消融.
3.应用2NNaOH调节pH值至7.0.
4.再向溶液中参加下列试剂.
1MNaOAc(DEPC处理)
20ml
0.5MEDTA(pH8.0)(DEPC处理)
20ml
5.用DEPC处理水将溶液定容至1L.
6.用0.45m滤膜过滤除去杂质.
7.室温避光保存.
注:
溶液见光或高温灭菌后会变黄.变黄时也可应用,但变黑时不要应用.
溴乙锭(10mg/ml)
组份浓度10mg/ml溴乙锭
配制量100ml
配制办法1.称量1g溴乙锭,参加到100ml容器中.
2.参加去离子水100ml,充分搅拌数h完整消融溴乙锭.
3.将溶液转移至棕色瓶中,室温避光保存.
4.溴乙锭的工作浓度为0.5g/ml.
留意:
溴乙锭是一种致癌物资,必须当心操作.
Agarose凝胶
配制办法1.配制适量的电泳及制胶用的缓冲液(平日是0.5×TBE或1×TAE).
2.根椐制胶量及凝胶浓度,精确称量琼脂糖粉,参加恰当的锥形瓶中.
3.参加必定量的电泳缓冲液(总液体量不宜超过锥形瓶的50%容量).
注:
用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须同一.
4.在锥形瓶的瓶封上保鲜膜,并在膜上扎些小孔,然后在微波炉中加热融化琼脂糖.加热进程中,当溶液沸腾后,请戴上防热手套.当心动摇锥形瓶.使琼脂糖充分平均融化.此操作反复数次,直至琼脂糖完整融化.必须留意,在微波炉中加热时光不宜过长,每次当溶液起泡沸腾时停滞加热,不然会引起溶液过热暴沸,造成琼脂糖凝胶浓度不准,也会破坏微波炉.融化琼脂糖时,必须保证琼脂糖充分完整融化,不然,会造成电泳图像隐约不清.
5.使溶液冷却至60℃阁下,如须要可在此时参加溴乙锭溶液(终浓度0.5µg/ml).并充分混匀.
注:
溴乙锭是一种致癌物资.应用含有溴乙锭的溶液时,请戴好手套.
6.将琼脂糖溶液倒入制胶模中,然后在恰当地位处插上梳子.凝胶厚度一般在3~5min之间.
7.在室温下使胶凝固(大约30min~1h),然后放置于电泳槽中进行电泳.
注:
凝胶不立刻应用时,请用保鲜膜将凝胶包好后在4℃下保存,一般可保存2~5天.
琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辩规模
琼脂糖浓度
最佳线形DNA分辩规模(bp)
0.5%
0.7%
1.0%
1.2%
1.5%
2.0%
1,000~30,000
800~12,000
500~10,000
400~7,000
200~3,000
50~2,000
6×LoadingBuffer(DNA电泳用)
组份浓度
30mM
EDTA
36%(V/V)
Glycerol
0.05%(W/V)
XyleneCyanolFF
0.05%(W/V)
BromophenolBlue
配制量500ml
配制办法1.称量下列试剂,置于500ml烧杯中.
EDTA
4.4g
BromophenolBlue
250mg
XyleneCyanolFF
250mg
2.向烧杯中参加约200ml的去离子水后,加热搅拌充分消融.
3.参加180ml的甘油(Glycerol)后,应用2NNaOH调节pH值至7.0.
4.用去离子水定容至500ml后,室温保存.
10×LoadlngBuffer(RNA电泳用)
组份浓度
10mM
EDTA
50%(V/V)
Glycerol
0.25%(W/V)
XyleneCyanolFF
0.25%(W/V)
BromophenolBlue
配制置10ml
配制办法1.称量下列试剂,置于10ml离心管中.
0.5MEDTA(pH8.0)
200µl
BromophenolBlue
25mg
XyleneCyanolFF
25mg
2.向离心管中参加约4ml的DEPC处理水后,充分搅拌消融.
3.参加5ml的甘油(Glycerol)后,充分混匀.
4.用DEPC处理水定容至10ml后,室温保存.
四.核酸.蛋白质杂交用相干试剂.缓冲液的配制办法
20×SSC
组份浓度3.0MNaCl,0.3MNa3citrate·2H2O(柠檬酸钠)
配制量1L
配制办法1.称量下列试剂,置于lL烧杯中.
NaCl
175.3g
Na3citrate·2H2O
88.2g
2.向烧杯中参加约800ml的去离子水,充分搅拌消融.
3滴加14NHCl,调节pH值至7.0后,加去离子水将溶液定容至1L.
4.高温高压灭菌后,室温保存.
20×SSPEBuffer
组份浓度3.0MNaCl,0.2MNaH2PO4,0.02MEDTA
配制量1.L
配制办法1.称量下列试剂,置于lL烧杯中.
NaCl
175.3g
NaH2PO4·H2O
27.6g
Na2EDTA·2H2O
7.4g
2.向烧杯中参加约800ml的去离子水,充分搅拌消融.
3.加NaOH调节pH值至7.4(约6.5ml的10NNaOH).
4.加去离子水将溶液定容至lL.
5.高温高压灭菌后,室温保存.
50XDenhardt’S溶液
1%(W/V)
Ficoll400(菲可400/水溶性聚蔗糖400)
1%(W/V)
Polyvinylpyrrolidone
(聚维酮/聚乙烯吡咯烷酮)
1%(W/V)
BSA
组份浓度
配制量500ml
配制办法1.称量下列试剂,置于500ml烧杯中.
Flcoll400
5g
PoLyvlnylpyrrolldone
5g
BSA
5g
2.加去离子水约400ml,充分搅拌消融
3.加去离子水将溶液定容至500ml.
4.用0.45µm滤膜过滤后,分装成每份25ml.
5.-20℃保存.
0.5M磷酸盐Buffer
组份浓度0.5MNa2HPO4.
配制量lL
配制办法1.称量134gNa2HPO4·7H2O置于lL烧杯中.
2.参加约800ml的去离子水充分搅拌消融.
3.参加85%的H3PO4(浓磷酸)调节溶液pH值至7.2.
4.加去离子水定容至1L.
5.高温高压灭菌后,室温保存.
SalmonDNA(鲑鱼精DNA)
组份浓度10mg/mlSalmonDNA
配制量约100ml
配制办法1.称取鲑鱼精DNA2g置于500ml烧杯中,参加约200ml的TEBuffer.
2用磁力搅拌器室温搅拌2~4h,消融后参加4ml的5MNaCl,使其终浓度为0.1M.
3.用苯酚和苯酚/氯仿各抽提1次.
4.收受接管水相溶液后,应用17号皮下打针针头快速吸打溶液约20次,以割断DNA.
5.参加2倍体积的预冷乙醇进行乙醇沉淀.
6.离心收受接管DNA后,消融于100ml的去离子水中.测定溶液的OD260值.
7.盘算溶液的DNA浓度后,稀释DNA溶液至10mg/ml.
8.煮沸10min后,分装成小份(1ml/份).-20℃保存.
9.应用前在滚水浴中加热5min后,敏捷冰浴冷却.
DNA变性缓冲液
组份浓度1.5MNaCl,0.5MNaOH
配制量1L
配制办法1.称量下列试剂,置于lL烧杯中.
NaCl
87.7g
NaOH
20g
2.向烧杯中参加约800ml的去离子水,充分搅拌消融.
3.加去离子水将溶液定容至lL后,室温保存.
预杂交液/杂交液(DNA杂交用)
6×
SSC(或SSPE)
5×
Denhardt’s
0.5%(W/V)
SDS
100µg/ml
SalmonDNA
组份浓度
配制置100ml
配制办法1.称量下列试剂,置于200ml烧杯中.
20×SSC(或SSPE)
30ml
50×Denhardt’s
10ml
10%SDS
5ml
10mg/mlSalmonDNA
1ml
dH2O
54ml
2.充分混匀后,应用0.45µm滤膜滤去杂质后应用.
预杂交液/杂交液(RNA杂交用)
6×
SSC(或SSPE)
5×
Denhardt‘s
0.5%(W/V)
SDS
100g/ml
SalmonDNA
50%(V/V)
Formamlde
组份浓度
配制量100mL
配制办法1.称量下列试剂,置于200ml烧杯中.
20×SSC(或SSPE)
30ml
50×Denhardt’s
10ml
10%SDS
5ml
10mg/mlSalmonDNA
1ml
Formamide(甲酰胺)
50ml
dH2O
4ml
2.充分混匀后,应用0.45µm滤膜滤去杂质后应用.
膜转移缓冲液(Western杂交用)
组份浓度39mMGlycine,48mMTris,0.037%(W/V)SDS,20%(V/V)甲醇
配制量1L
配制办法1.称量下列试剂,置于lL烧杯中.
Glycine
2.9g
Tris
5.8g
SDS
0.37g
2.向烧杯中参加约600ml的去离子水,充分搅拌消融.
3.加去离子水将溶液定溶至800ml后,参加200ml的甲醇.
4.室温保存.
TBSTBuffer(Western杂交膜清洗液)
组份浓度20mMTris-HCl,150mMNaCl,0.05%(V/V)Tween20
配制量1L
配制办法1.称量下列试剂,置于lL烧杯中.
NaCl
8.8g
1MTris-HCl(pH8.0)
20ml
2.向烧杯中参加约800ml的去离子水,充分搅拌消融.
3.参加0.5mlTween20后充分混匀.
4.加去离子水将溶液定容至lL后,4℃保存.
关闭缓冲液(Western杂交用)
组份浓度5%(W/V)脱脂奶粉/TBSTBuffer
配制量100ml
配制办法1.称5g脱脂奶粉参加到100mlTBSTBuffer中,充分搅拌消融.
2.4℃保存待用(本关闭液应当现配现用).
五.试验室常用造就基的配制办法
Ampicillin(氨卡青霉素)(100mg/ml)
组份浓度100mg/mlAmpicillin
配制量50ml
配制办法1.称量5gAmpicillin置于50ml离心管中.
2.参加40ml灭菌水,充分混杂消融后,定容至50ml.
3.用0.22µm过滤膜过滤除菌.
4.小份分装(1ml/份)后,-20℃保存.
IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)(24mg/ml)
组份浓度24mg/mLIPTG
配制量50mL
配制办法1.称1.2gIPTG置于50ml离心管中.
2.参加40ml灭菌水,充分混杂消融后,定容至50ml.
3.用022µm过滤膜过滤除菌.
4小份分装(1ml,份)后,-20℃保存.
X-Gal(20mg/ml)
组份浓度20mg/mlX-Gal
配制量50ml
配制办法1.称量lgX-Gal置于50ml离心管中.
2.参加40mlDMF(二甲基甲酰胺),充分混杂消融后,定容至50ml.
3.小份分装(1ml/份)后,-20℃避光保存.
LB造就基
组份浓度1%(W/V)Tryptone(胰蛋白胨),0.5%(W/V)YeastExtract(酵母提取物),1%(W/V)NaCl
配制量1L
配制办法1.称取下列试剂,置于lL烧杯中.
Tryptone
10g
YeastExtract
5g
NaCl
10g
2.参加约800ml的去离子水,充分搅拌消融.
3.滴加5NNaOH(约0.2m1),调节pH值至7.0.
4.加去离子水将造就基定容至1L.
5高温高压灭菌后,4.C保存.
LB/Amp造就基
组份浓度
1%(W/V)
Tryptone
0.5%(W/V)
YeastExtract
1%(W/V)
NaCl
0.1mg/ml
Ampicillin
配制量1L
配制办法1.称取下列试剂,置于lL烧杯中.
Tryptone
10g
YeastExtract
5g
NaCl
10g
2.参加约800ml的去离子水,充分搅拌消融.
3.滴加5NNaOH(约0.2mL).调节pH值至7.0.
4.加去离子水将造就基定容至1L.
5.高温高压灭菌后,冷却至室温.
6.参加1mlAmpicillin(100mg/ml)后平均混杂.
7.4℃保存.
1.2%(W/V)
Tryptone
2.4%(W/V)
YeastExtract
0.4%(V/V)
Glycerol
17mM
KH2PO4
72mM
K2HPOa
TB造就基
组份浓度
配制量1.L
配制办法1.配制磷酸盐缓;中液(0.17MKH2PO4,0.72MK2HPO4)100ml.
消融2.31gKH2PO4和l2.54gK2HPO4于90ml的去离子水中,搅拌消融后,加去离子水定容至100ml,高温高压灭菌.
2.称取下列试剂,置于lL烧杯中.
Tryptone
12g
YeastExtract
24g
Glycerol
4m
3.参加约800ml的去离子水,充分搅拌消融.
4.加去离子水将造就基定容至1L后,高温高压灭菌.
5.待溶液冷却至60℃以下时,;参加100ml的上述灭菌磷酸盐缓冲液.
6.4℃保存.
TB/Amp造就基
组份浓度
1.2%(W/V)
Tryptone
2.4%(W/V)
YeastExtract
0.4%(V/V)
Glycerol
17mM
KH2PO4
72mM
K2HPO4
0.1mg/ml
Ampicillin
配制量1L
配制办法1.配制磷酸盐缓冲液(0.17MKH2PO4,0.72MK2HPO4)100ml.
消融2.31gKH2PO4,和12.54gK2HPO4于90ml的去离子水中,搅拌消融后,加去离子水定容至100ml,高温高压灭菌.
2.称取下列试剂,置于lL烧杯中.
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