版抗中性粒细胞胞浆和显微镜下多血管炎中应用的专家共识全文.docx

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版抗中性粒细胞胞浆和显微镜下多血管炎中应用的专家共识全文

2020版：

抗中性粒细胞胞浆抗体检测方法在诊断肉芽肿性多血管炎

和显微镜下多血管炎中应用的专家共识（全文）

抗中性粒细胞胞浆抗体（antineutrophilcytoplasmicantibody,ANCA）相关性血管炎（ANCA-associatedvasculitiszAAV）是一组以血清中能够检测到ANCA为最突出特点的系统性小血管炎。

1982年Davies等［1］在硏究节段性坏死性肾小球肾炎患者血清中的自身抗体时意外地发现了该种新的IgG类抗体，其能与正常人中性粒细胞发生反应。

1985年VanderWonder等［2］在韦格纳肉芽肿（Wegener*sgranulomatosis,WG）患者血清中发现也存在这种相似的自身抗体，ANCA才逐渐被广泛认可。

1988年Falk等［3］发现ANCA阳性荧光染色模型分为两种，一种是围绕细胞核周围产生黄绿色荧光的核周型（perinuclearpattern,P-ANCA）,另一种是细胞浆产生散在的颗粒性荧光的胞浆型（cytoplasmicpattern,C-ANCA）,并发现髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）是P-ANCA的靶抗原#1990年丝氨酸蛋白酶3（proteinase3zPR3）被确认为C-ANCA的一种靶抗原⑷。

此后，更多的ANCA靶抗原被逐渐发现，ANCA也被发现与某些小血管炎的发病、临床表现、预后密切相关。

2012年ChapelHill共识会议（ChapelHillConsensusConferencezCHCC）提出新的血管炎分类［5］,将肉芽月中性多血管炎（encompasesgranulomatosiswithpolyangiitisfGPA;既往称为WG），显微镜下多血管炎（microscopicpolyangiitis,MPA）,嗜酸性肉芽肿性多血管炎（eosinophilicgranulomatosiswithpolyangiitis,EGPA;既往称为Churg-Strauss综合征）等这一类小血管炎均归属为AAV,进一步证明了ANCA在AAV发病机制以及诊治中的重要作用。

随着对AAV的硏究深入，按ANCA的靶抗原不同对AAV进行分类的呼声也越来越高。

因此，及时、准确地进行ANCA的检测更加重要。

ANCA检测方法随着免疫学技术的提高而不断的改进。

既往硏究证明［6］f采用间接免疫荧光法（indirectimmunofluorescence,IIF）进行ANCA检测的敏感度为67%〜78%,特异度为93%。

虽然IIF的特异度较高,但敏感度较低，不利于临床医生诊断，因此酶联免疫吸附测定法

（ELISA）则被选择作为一种较好的确认试验，因为它可以同时检测ANCA滴度以及特异的靶抗原。

1998年Hagen等［7］硏究发现采用IIF联合ELISA检测ANCA,可使其检测敏感度和特异度分别提高至67%~82%和98%。

1999年首个ANCA国际检测共识颁布［8］,建议采用IIF进行初筛，再以ELISA确认的方法对疑似小血管炎的患者进行诊断。

多年临床硏究发现，依据该检测方法，ANCA检测敏感度和特异度分别可达到92%和99%,至今该方法仍是众多实验室采用的ANCA检测方法［9,10］。

随着免疫学检测方法的进步，这一联合检测方法因步骤繁琐、耗时、费用较高，是否仍需要继续使用IIF方法作为初筛逐渐受到质疑。

近年，越来越多的小样本研究证实［11,12］，尤其是对诊断GPA和MPA,建议摒弃IIF的检测方法,仅采用确认试验来进行ANCA的检测。

在2016年欧洲一项大样本的多种方法检测ANCA准确性比较的硏究基础上［13］,2017年11月新修订版的ANCA检测方法共识正式颁布［14］,这是距离第一个ANCA检测国际共识颁布18年后又一个正式的国际共识。

该共识指出，对于疑似AAV患者（GPA或MPA），使用高质量的抗原特异性免疫学方法检测MPO-ANCA.PR3-ANCA可作为其筛查实验，在诊断性能上可代替甚至优于IIF。

这一共识提示,IIF方法不再适合作为初筛实验，并且当GPA或MPA诊断把握度高时，IIF联合抗原特异性检测方法，并不能提高单独采用抗原特异方法检测的诊断效能。

鉴于中国AAV在流行病学特点、遗传相关基因类型、临床表现和预后与国际情况不同，以及国内各医院ANCA检测方法和试剂种类多样的现状，至今缺乏适合我国国情的ANCA检测方法供临床和实验室遵循。

因此,中国免疫学会临床免疫学分会于2017年2月组织国内20个三级甲等医院进行了比较多种方法检测ANCA准确性的多中心硏究2018年6月收集、汇总研究结果，分析数据。

共识的拟定、评价、传播和执行的各个过程，均按照EULARSOPs标准来执行。

共识形成后根据牛津询证医学2011版证据等级评估办法,依据临床试验证据，对共识进行证据等级评估（levelofevidence,LOE）[15]。

并以问卷发放的形式,将共识初稿发放至工作组专家，每条建议按照：

0分（完全不同意）到10分（完全同意），请专家对其打分，并计算专家组评分（levelofagreement,LOA）。

共识最终版本于2019年7月13日在中国免疫学会临床免疫学分会第七届全体委员会上讨论通过。

本共识的制定，旨在提高我国实验室ANCA的检测水平，规范我国ANCA的检测方法，从而为临床提供准确的ANCA检测结果。

一、ANCA定义及分类

ANCA是一组以中性粒细胞和单核细胞胞浆成分为靶抗原的抗体的总称，该组抗体与临床多种小血管炎密切相关，其主要为IgG或IgA型。

这组抗体采用IIF染色后，可按照其在荧光显微镜下的形态特征分为P-ANCA、C-ANCA以及不典型ANCA（atypicalANCA,A-ANCA）。

目前发现的C-ANCA主要靶抗原为PR3,占C-ANCA靶抗原的80%〜90%,其余靶抗原还包括增加通透性杀菌蛋白（baxtericidal/permeability-increasingprotein,BPI）、弹性蛋白酶（elastase）、组织蛋白酶G（cathepsinG）、天青杀素（azurocidin）等。

P-ANCA的主要靶抗原是髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）,它是中性粒细胞嗜天青颗粒中的另一主要成分,其他靶抗原还包括溶酶体（lysozyme）、乳铁蛋白（lactoferria,LF）、天青杀素（azurocidin）、组织蛋白酶等。

狭义的P-ANCA特指靶抗原为MPO,荧光染色在乙醇固定的中性粒细胞上表现为核周染色,分叶核间浓染,在甲醛固定的中性粒细胞上表现为胞浆颗粒样染色具主要见于AAV患者，而广义的P-ANCA还包括了A-ANCA。

A-ANCA是一种特殊类型的P-ANCA,特指靶抗原为非MPO、非PR3的ANCAOA-ANCA荧光染色在乙醇固定的中性粒细胞上表现为核周线性，而在甲醛固定的中性粒细胞上染色为阴性，主要见于自身免疫性肝病、炎性肠病等非系统性血管炎疾病。

C-ANCA主要包括IgG和IgA型，P-ANCA主要为IgG型。

研究表明[16,17],PR3-ANCA和MPO-ANCA与AAV发病密切相关。

PR3-ANCA或MPO-ANCA与中性粒细胞中相对应的抗原结合，诱导中性粒细胞发生呼吸爆发和脱颗粒,释放活性氧自由基和各种蛋白酶等损伤血管内皮细胞。

此外，活化的中性粒细胞也产生中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophilextracellulartraps,NETs）,参与内皮细胞损伤，从而造成血管炎的发生。

因此，PR3-ANCA或MPO-ANCA也是目前临床ANCA检测的主要抗体［18］。

【建议11ANCA是一组以中性粒细胞和单核细胞胞浆成分为靶抗原的抗体的总称。

目前临床与血管炎相关的ANCA特异性靶抗原检测主要是PR3-ANCA和MPO-ANCA,非血管炎相关的ANCA靶抗原包括多种,以非PR3、非MPO为主。

LOE=4级,LOA=（9.38+0.94）分。

二、ANCA检测的临床应用范国和意义

AAV是一组多脏器损害的自身免疫性疾病，其基本病理改变为坏死性小血管炎，可表现为发热、关节痛、紫瘢、神经病变、耳鼻喉受累等；但部分患者也可隐匿起病，或表现为急性起病，短时间出现急进性肾小球肾炎和肺出血，导致肾衰竭和呼吸衰竭,以致死亡；尽管部分患者经积极治疗后进入缓解期z但仍有患者需要长期的透析治疗甚至进行肾移植,给家庭和社会带来巨大负担。

流行病学数据表明［19］,AAV患病率估计为46~184/100万。

其中欧洲GPA每年发病率为2.1-14.4/100万，MPA为2.4-10.1/100万;GPA的5年生存率为74%~91%,MPA仅为45%~76%。

我国目前尚缺乏AAV的大样本流行病学数据，小样本的临床硏究提示［16,20］,MPA约占AAV的80%,GPA约占AAV的20%，而EGPA相对少见。

既往硏究发现［21］,GPA患者人群中C-ANCA（靶抗原为PR3）约占75%〜80%,P-ANCA（靶抗原为MPO）占10%~15%;MPA患者人群中C-ANCA（靶抗原为PR3）约占25%~35%,P-ANCA（靶抗原为MPO）占50%〜60%;

EGPA人群中以P-ANCA（靶抗原为MPO）为主，占30%~40%。

因此,ANCA是目前对小血管炎，尤其是对GPA和MPA诊断具有重要意义的血清学标志物。

近年硏究认为以特异性的抗体PR3-ANCA和MPO-ANCA将AAV重新分类更有意义。

在流行病学、发病年龄、基因背景、累及器官及其病理改变、预后、治疗反应等方面可因ANCA特异性抗体的不同而不同，该分类能够提供给临床更及时有用的信息。

因此准确的ANCA检测对于诊断、治疗、预后判断非常重要[18]o尽管ANCA的类型和滴度与AAV疾病活动度的关系仍存在争议，也缺乏足够多的数据证明，但PR3-AAV的复发率要局于MPO-AAV,咼滴度的ANCA患者疾病复发率咼。

然而除AAV外，在一些感染性疾病（如感染性心内膜炎、HIV感染），肿瘤（如淋巴瘤、高球蛋白血症等），药物（如月井苯呢嗪、可卡因、米诺坏素、丙硫氧0密唳等）以及炎性肠病和其他自身免疫性疾病（类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征、硬皮病、自身免疫性肝病等），均可出现P-ANCA阳性或C-ANCA阳性，但其主要靶抗原并非MPO和PR3[22]。

【建议2】有以下临床表现的患者建议进行ANCA检查：

有系统特征的皮肤型血管炎；长期鼻窦炎或耳炎；声门下气管狭窄；眶后肿块；巩膜炎、视网膜血管炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、视神经炎等；上呼吸道慢性破坏性疾病；多个肺结节；肺出血，特别是肺-肾综合征；肾小球肾炎，特别是快速进展的肾小球肾炎；多发性单神经炎或其他周围神经病变；但检测ANCA的情况并不仅限于这些症状。

LOE二4级丄OA二（9.15±1.09）分。

【建议3】结合建议2,MPO-ANCA.PR3-ANCA检测结果阳性，有助于诊断AAV,但不能仅凭此结果进行确诊，需结合临床与相关实验室检查结果综合判断。

LOE二2级，LOA二（9.52±1.08）分。

【建议4】诊断时应详细询问患者的用药史（如阱苯哒嗪、可卡因、米诺环素、丙硫氧腳定等）和既往史（如感染、肿瘤、炎性肠病等）。

LOE=3级fLOA=（9.35±0.89）分。

【建议5］ANCA水平可能对临床判断病情有一定程度的帮助。

尽管有证据显示血清中ANCA滴度升高可提示病情活动度以及复发率高，但仍需寻找确切证据证明血清中ANCA的滴度是否可用于判断病情和预后；目前尚不能单单依据ANCA是否阳性及滴度作为治疗的依据。

LOE=2级,LOA二（8.90±0.93）分。

三、ANCA的检测方法

自ANCA被证实对于AAV的诊治至关重要以来,ANCA的检测方法也在不断的发展之中。

1999年国际第一部ANCA检测方法共识颁布，该共识建议对于疑似AAV患者血清，首先采用IIF方法筛查，再采用EUSA方法进行确认。

该共识的颁布，规范了ANCA检测方法，为提高AAV的诊断做出了重要贡献［8］。

近年，随着ANCA检测方法的进步,陆续出现第二代、第三代ELISA方法，化学发光免疫分析法（chemiluminescenceanalysis,CLIA），多通道流式免疫分析法，免疫印迹法等抗原特异性免疫学检测方法，摒弃IIF法而直接采用新的抗原特异性免疫学方法检测PR3-ANCA和MPO-ANCA的呼声越来趣高。

因此,2016年欧洲血管炎研究组（EuropeanVasculitisStudyGroup,EUVAS）开展了UF和抗原特异性免疫学方法检测ANCA的多中心硏究［13］。

该硏究结果提示，与IIF相比，直接采用抗原特异性的免疫学方法检测PR3-ANCA和MPO-ANCA对诊断AAV（主要为GPA和MPA）有着更高的诊断性能,单独进行特异性抗体检测方法不劣于HF联合EUSA方法。

2017年第二部国际ANCA检测共识在此基础上形成［14］。

该共识有着严格的前提条件,即针对特定人群GPA和MPA患者，不适用于炎症性肠病、自身免疫性肝病、药物引起的自身免疫性疾病及感染性疾病。

在2017国际共识中，高质量的抗原特异性免疫学方法主要包括第二、三代ELISA,CLIA,荧光酶免疫法（fluorometricenzymeimmunoassay,FEIA）及多通道流式免疫分析法等。

目前,有很多国内实验室仍然使用第一代ELISA检测MPO-ANCA.

PR3-ANCA，仍有较多实验室采用定性或半定量的免疫印迹法，所以不能简单照搬国外硏究结论。

为此，2017年2月我们在国内开展了多种方法检测ANCA的多中心研究［23］。

该硏究纳入全国20个中心诊断明确的452份血清样本，其中MPA患者血清样本153份，GPA患者血清样本56份,两者合称为AAV组；对照组血清样本243份，包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征、系统性硬化症等。

采用目前国内各医院常用的12种方法进行检测，其中包括8种定量抗原特异性免疫学方法（ELISA方法5种，CLIA方法2种,多重微珠流式免疫荧光发光法1种），2种免疫印迹法和2种IIF法。

硏究结果发现，所有方法的准确度波动于84.6%~96.7%,相同方法不同厂家之间结果差异不明显。

其中,8种定量抗原特异性免疫学检测方法对于GPA和MPA患者血清检测的敏感度明显优于IIF及免疫印迹法；免疫印迹法检测的特异度、阳性似然比均高于间接免疫荧光法。

免疫印迹法检测的阳性似然比最高，化学发光法阴性似然比最低。

进一步进行ROC曲线分析显示，8种定量抗原特异性免疫学方法的ROC曲线均接近，曲线下面积（AUC）均在0.95以上，有较高的准确性。

其中，化学发光法的AUC值最大，免疫印迹法和IIF法的AUC值也均在0.8以上。

这些结果提示，使用高质量的抗原特异性免疫学方法检测MPO-ANCA.PR3-ANCA可作为AAV（主要为GPA和MPA）的筛查实验。

如果检查结果为阴性，但临床仍高度怀疑GPA和MPA时,则可使用IIF或另一种抗原特异性免疫学方法做确认实验，或于高水平实验室进行复检，并积极进行组织活检，加强随访。

血清学反应阴性的ANCA相关血管炎不在共识讨论范围内。

考虑ANCA检测方法的敏感性、在疾病的不同病程中的检测、血浆铜蓝蛋白等可能因素的影响（铜蓝蛋白掩蔽抗原表位进而影响ELISA检测MPO-ANCA）,ANCA血清学检测为阴性时不能排除AAV,应以临床病理诊断为准。

【建议6】目前我国可采用的方法包括ELISA、CLIA和多重微珠流式免疫荧光发光法等抗原特异性免疫学方法，其定量检测MPO-ANCA.PR3-ANCA可作为针对高度怀疑GPA和MPA的ANCA筛查方法。

LOE=1级，LOA二（8.98±1.35）分。

【建议刀如MPO-ANCA.PR3-ANCA检测结果均为阴性或弱阳性,但临床仍高度怀疑小血管炎，应使用其他免疫学方法和（或）HF再次检测,或者推荐到水平更高的实验室进行检测，并积极进行病理诊断，加强随访。

LOE=1级,LOA=（9.00±1.15）分。

【建议8]MPO-ANCA和PR3-ANCA筛查检测结果阴性，如确实能除外其他因素（如铜蓝蛋白等）导致的检测结果假阴性,则诊断AAV的可能性较低，但不能完全排除AAV的诊断。

LOE二2级，LOA二（9.54±1.34）分。

近年免疫学技术的进步，为临床快速、有效、准确地检测ANCA提供了技术支持。

本共识简化了既往繁琐的检测过程,有助于提高诊断效率，节省患者费用，使患者得到早期治疗，从而改善预后。

然而，该共识对临床实际的指导作用，仍需在今后的临床工作中进一步评估验证。