封闭后可以用立春红染色吗.docx
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封闭后可以用立春红染色吗.docx
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封闭后可以用立春红染色吗
封闭后可以用立春红染色吗
【篇一:
westernblot实验步骤及注意事项】
westernblot实验步骤及注意事项
1.组织块称重
2.利用液氮、研钵粉碎组织块
5.移入离心管4℃约20,000g(约15,000转)15分钟
6.上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存
7.进行bradford比色法测定蛋白质浓度
9.沸水浴中3分钟
10.上样
11.电泳(浓缩胶20ma,分离胶35ma)
12.电转膜仪转膜(100ma40分钟)
13.膜用丽春红染色,胶用考马斯亮蓝染色
14.westernblot试剂盒显色
15.分析比较记录
westernblot的实验步骤及注意事项的资料
1.把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。
1)转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜,将硝酸纤维素膜铺在凝胶上,用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。
2)在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸(预先用转移缓冲液浸湿),将凝胶夹在中间,保持湿润和没有气泡。
3)将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中,凝胶面向阴极。
4)将上述装置放入缓冲液槽中,并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。
5)按照厂家所示接通电源开始电泳转移。
6)转移结束后,取出薄膜和凝胶,弃去凝胶。
2.将薄膜漂在氨基黑中快速染色,直至分子量标准显现时取出,记录下标准位置。
3.用100ml水洗涤纤维素膜,必要时可用脱色缓冲液。
4.膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。
5.室温下,用pbs-tween缓冲液洗涤薄膜。
6.用封口机将薄膜封入塑料袋中,尽可能不留空气。
7.袋的一角剪一缓冲液的小口,用透析袋夹紧。
8.混合:
ngs(100微升),印迹缓冲液中的抗体(10毫升),加在装薄膜的袋中,于室温下摇动2小时(或4℃过夜)
9.用总体积300mlpbs-tween缓冲液,分4次在一浅盘中洗涤薄膜,每次75ml。
10.将连接生物素的羊抗兔igg(40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升ngs)加在袋内,于室温下摇动1小时。
11.按步骤9洗涤。
12.加入抗生素蛋白-hrp(40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升ngs),于室温下摇动。
注意事项:
westernblot中转移在膜上的蛋白处于变性状态,空间结构改变,因此那些识别空间表位的抗体不能用于westernblot检测。
这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化,再用酶标记亲和素进行westernblot。
实验中取胶和膜需带手套。
western,也称westernblot、westernblotting、western印迹,是用抗体检测蛋白的重要方法之一。
1.收集蛋白样品(proteinsamplepreparation)
o可以使用适当的裂解液,例如碧云天生产的western及ip细胞裂解液,裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋白,例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等,可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白,也可以使用试剂盒进行抽提,例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。
o收集完蛋白样品后,为确保每个蛋白样品的上样量一致,需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同,需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
如果使用碧云天生产的western及ip细胞裂解液,可以使用bca蛋白浓度测定试剂盒。
2.电泳(electrophoresis)
(1)sds-page凝胶配制
osds-page凝胶可以参考一些文献资料进行配制,也可以使用碧云天生产的sds-page凝胶配制试剂盒。
该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度sds-page的配方。
(2)样品处理
o在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的sds-page蛋白上样缓冲液。
例如2x或5x的sds-page蛋白上样缓冲液。
使用5x的sds-page蛋白上样缓冲液可以减小上样体积,在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5x的sds-page蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制,也可以使用碧云天生产的sds-page蛋白上样缓冲液(5x)。
o100℃或沸水浴加热3-5分钟,以充分变性蛋白。
(3)上样与电泳
o冷却到室温后,把蛋白样品直接上样到sds-page胶加样孔内即可。
o为了便于观察电泳效果和转膜效果,以及判断蛋白分子量大小,最好使用预染蛋白质分子量标准。
o电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳,而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。
对于bio-rad的标准电泳装置或类似电泳装置,低电压可以设置在80-100v,高电压可以设置在120v左右。
sds-page可以采用普通的电泳仪就可以满足要求,也可以采用碧云天的多功能电泳仪(带定时)。
为了电泳方便起见,也可以采用整个sds-page过程恒压的方式,通常把电压设置在100v,然后设定定时时间为90-120分钟。
设置定时可以避免经常发生的电泳过头。
o通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳,或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况,预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
3.转膜(transfer)
o我们推荐在western实验中选用pvdf膜。
硝酸纤维素膜(nc膜)也可以使用,但硝酸纤维素膜比较脆,在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。
膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。
o通常如果使用bio-rad的标准湿式转膜装置,可以设定转膜电流为300-400ma,转膜时间为30-60分钟。
也可以在15-20ma转膜过夜。
转膜时也可以使用碧云天的多功能电泳仪(带定时)。
具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定,目的蛋白的分子量越大,需要的转膜时间越长,目的蛋白的分子量越小,需要的转膜时间越短。
o在转膜过程中,特别是高电流快速转膜时,通常会有非常严重的发热现象,最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。
o转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准,通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。
转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色,以观察实际的转膜效果。
也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的sds-page胶进行染色,以观察蛋白的残留情况。
4.封闭(blocking)
o转膜完毕后,立即把蛋白膜放置到预先准备好的western洗涤液中,漂洗1-2分钟,以洗去膜上的转膜液。
从转膜完毕后所有的步骤,一定要注意膜的保湿,避免膜的干燥,否则极易产生较高的背景。
o用微型台式真空泵吸尽洗涤液,加入western封闭液,在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。
对于一些背景较高的抗体,可以在4℃封闭过夜。
在整个western过程中我们推荐使用碧云天生产的侧摆摇床,侧向摆动速度比较缓慢,而且也容易让溶液覆盖蛋白膜。
5.一抗孵育(primaryantibodyincubation)
o参考一抗的说明书,按照适当比例用western一抗稀释液稀释一抗。
用微型台式真空泵吸尽封闭液,立即加入稀释好的一抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
如果一抗孵育一小时效果不佳,可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。
回收一抗。
加入western洗涤液,在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。
吸尽洗涤液后,再加入洗涤液,洗涤5-10分钟。
共洗涤3次。
如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
6.二抗孵育(secondaryantibodyinucubation)
o参考二抗的说明书,按照适当比例用western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(hrp)标记的二抗。
用微型台式真空泵吸尽洗涤液,立即加入稀释好的二抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
回收二抗。
加入western洗涤液,在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。
吸尽洗涤液后,再加入洗涤液,洗涤5-10分钟。
共洗涤3次。
如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
7.蛋白检测(detectionofproteins)
o参考相关说明书,使用beyoecl,western荧光检测试剂等ecl类试剂来检测蛋白。
洗片时可以使用x光片自动洗片机。
如果没有自动洗片机,可以用显影定影试剂盒自行配制显影液和定影液进行手工洗片。
8.膜的重复利用(membranerecovery)
o如果蛋白样品非常宝贵,可以使用western一抗二抗去除液处理蛋白膜,以重复利用蛋白膜
【篇二:
western转膜条件】
western转膜条件
蛋白名称(可保密):
一些转录因子
蛋白分子量:
40~70kd
wb用膜类型、孔径:
0.45nc
转膜方式(恒压、恒流):
湿转恒流400ma
转膜时间:
60~90min
ps.其实吧,以我的经验来看,除非目的蛋白特别小,或者特别大,不然转膜时间真的不是那么重要,曾经因为失误,转了15min就拆下来了,但从丽春红染色来看,跟平常实验也没有太大的区别。
蛋白名称(可保密):
occludinakt
蛋白分子量:
65kd56kd
wb用膜类型、孔径:
0.45pvdf
转膜方式(恒压、恒流):
湿转恒压100v
转膜时间:
60~70min
设备名字是“bio-radmini”。
蛋白名称(可保密):
保密
蛋白分子量:
65kd55kd
wb用膜类型、孔径:
pvdf(预先用甲醇处理)
转膜方式(恒压、恒流):
半干转恒压12v
转膜时间:
30-40min
设备:
“bio-radmini”
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:
95kd35kd
wb用膜类型、孔径:
pvdf
转膜方式(恒压、恒流):
湿转恒压90v-110v,控制电流不要超过300ma。
转膜时间:
70min
蛋白名称(可保密):
转录因子
蛋白分子量:
33kda
wb用膜类型、孔径:
pvdf膜
转膜方式(恒压、恒流):
350ma恒流
转膜时间:
150min
转膜设备:
湿转bio-rad
说明:
相同条件曾用于数个30-70kda的蛋白,都能成功转上,不过没有试缩短时间效果如何;实验时没为转膜条件苦恼,倒是电泳时胶的浓度及时间根据不同分子量而有区别。
蛋白名称(可保密):
smad3
蛋白分子量:
54kda
wb用膜类型、孔径:
pvdf膜
转膜时间:
150min
转膜设备:
湿转bio-rad
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:
16kdaand42kda
wb用膜类型、孔径:
pvdf膜
转膜方式(恒压、恒流):
120v恒压
转膜时间:
90min
转膜设备:
湿转bio-rad
蛋白名称(可保密):
保密
蛋白分子量:
72kd,42kd和22kd
wb用膜类型、孔径:
一般的pvdf膜
转膜方式(恒压、恒流):
湿转,恒流一张膜0.26a,两张膜0.3a。
转膜时间:
90min
设备:
“bio-radmini”
建议:
转膜缓冲液最多用3次,最好现用现配,我们用的没有加sds,转的时候最好能用冰块一类的东西降一下温,这样转的效果要好一些,转的时候一定要把三明治每层之间的气泡除去,同时使滤纸大于膜,膜大于胶,以免烧坏电极。
蛋白名称(可保密):
保密
蛋白分子量:
55kd
wb用膜类型、孔径:
0.22的pvdf膜
转膜方式(恒流):
湿转
转膜时间:
60-90min
设备:
“bio-radmini”
建议:
转膜液用过两三次之后转膜效果就很差了其它按照常规就好了其实0.22的膜一般不怕转过头以我们的经验,转膜时间、电压其实也有很大范围的调整,并不是非要固定于哪一个最合适,曾经做过一张膜转,17kd的和170kd的,按照170kd的条件,17kd的转膜也很好的。
蛋白名称(可保密):
保密
蛋白分子量:
大于250kd
wb用膜类型、孔径:
milliporepvdf膜0.45um
转膜方式(恒压、恒流):
湿转,恒流0.3a。
转膜时间:
180min
设备:
“bio-rad”
建议:
电转保持电压在70v以上,保持低温,如果电压低过70就需要换缓冲液了。
蛋白名称(可保密):
保密
蛋白分子量:
28kd
wb用膜类型、孔径:
0.45的nc膜
转膜方式(恒流):
湿转,90min,0.25a
设备:
“bio-rad”
建议:
海绵厚度要合适,一次转磨用的海绵太薄,导致三明治没夹紧,转膜后拿出来一看,marker都变得七扭八歪。
但是有前辈说垫的海绵太厚可能将胶压断,没经历过,不知道是不是会有这种情况。
蛋白名称(可保密):
磷酸化蛋白
蛋白分子量:
10-200kda
wb用膜类型、孔径:
milliporepvdf膜0.45um
转膜方式(恒压、恒流):
120v恒压
转膜时间:
120min
转膜设备:
湿转bio-rad
建议:
转膜缓冲液只用2次,基本都转上,5%bsa封闭,减少背景。
蛋白名称(可保密):
******
蛋白分子量:
90-130kda
wb用膜类型、孔径:
pvdf膜
转膜方式(恒压、恒流):
250ma恒流
转膜时间:
150min
转膜设备:
湿转
蛋白名称(可保密):
保密
蛋白分子量:
38kd
wb用膜类型、孔径:
0.45nc
转膜方式(恒压、恒流):
湿转恒压:
100v
转膜时间:
120min
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:
220kda,130kda,70kda,41kda
wb用膜类型、孔径:
pvdf
转膜方式(恒压、恒流):
恒压
转膜时间:
70v120min,180min,5-6h
转膜设备:
伯乐湿转
建议改进方向(可选):
40kda一下,70v,60-90min足够,40-70kda90-120min即可。
70-120kda,70v,120-180min足够,120-180kda,180-240min,180kda以上建议6h。
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:
53kd
wb用膜类型、孔径:
pvdf膜0.45um
转膜方式(恒压、恒流):
恒压
转膜时间:
80v100min
转膜设备:
湿转bio-rad
蛋白分子量:
42
wb用膜类型、孔径:
pvdf膜0.45um
转膜方式(恒压、恒流):
恒压
转膜时间:
504h
转膜设备:
湿转bio-rad
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:
16kd、27kd、32kd、42kd
wb用膜类型、孔径:
pvdf0.22um
转膜方式(恒压、恒流):
半干转恒流1ma/cm2或2ma/cm2
转膜时间:
不定
转膜设备:
北京六一仪器
建议:
我共做了六个蛋白,所以总在想节约时间的方式。
在预试时我会观察电压数与转膜效率的关系,所以我不会按时间来定何时转完,而是按电压来定。
通过染胶来确定电压数与转移蛋白分子量上限的关系。
这样有的5分钟就转完了,不用多浪费时间。
并且六一的半干转膜仪随着使用次数的增多,效率也会下降,所以时间和转膜效率(尤其是使用后期)的关系并不稳定,单纯依靠时间有时会有问题。
蛋白名称(可保密):
酶原
蛋白分子量:
40kd
wb用膜类型、孔径:
0.22的pvdf膜(biorad)
转膜方式(恒压):
100v,湿转,转膜时间:
60min。
设备:
tanon(上海天能)
建议:
1.转膜液现用现配,用完倒掉。
2.转膜时间,电压可以适当调整。
分子量大或者小一些的蛋白,采用此条件一样转膜效率很高。
蛋白名称(可保密):
egfr
蛋白分子量:
170kd
wb用膜类型、孔径:
pvdf0.45
转膜方式(恒压、恒流):
24v
转膜时间:
2个半小时
转膜设备:
伯乐半干转
蛋白分子量:
120kd
wb用膜类型、孔径:
nc膜
转膜方式(恒压):
80伏,湿转
转膜时间:
150分钟
设备:
“bio-radmini”
建议:
湿转,转膜液特别重要,否则会导致电压或者电流不稳影响转膜条带。
转膜均现配先用,不重复利用。
转膜时间一般是150分钟,80伏恒压。
经李春红染色,靠近蛋白胶的一侧膜上蛋白染色深,膜另外一面染色浅,说明蛋白未转过。
该湿转条件自己做过的蛋白分子量范围:
170-36kd。
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:
128kd,100,60,55,43kd
【篇三:
蛋白印迹操作流程】
蛋白印迹操作流程
蛋白印迹,也称western,westernblot、westernblotting、western印迹,简称wb,是用免疫学方法检测蛋白,研究蛋白质的表达调控的重要方法之一。
蛋白印迹可以参考如下步骤进行操作。
1.蛋白样品的制备(proteinsamplepreparation)
可以选用适当的裂解液,如赛驰生产的wip细胞裂解液,裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋白,例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等,可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白,也可以使用试剂盒进行抽提,如赛驰生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。
为确保每个蛋白样品的上样量一致,收集的蛋白样品均应测定其蛋白浓度。
蛋白浓度的测定方法,应根据组织细胞裂解或匀浆所使用的方法及裂解液的不同选用,因为去垢剂和还原剂等对不同蛋白浓度测定方法的影响差别很大。
如使用我公司生产的wip细胞裂解液,可以使用bca蛋白浓度测定试剂盒。
2.电泳(electrophoresis)
(1)sds-page凝胶配制
sds-page凝胶可以参考文献资料进行配制,也可以使用赛驰生产的sds-page凝胶配制试剂盒。
该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度sds-page的配方。
(2)样品处理
在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的sds-page蛋白上样缓冲
液,放置于水漂上于100℃或沸水浴中加热3-5分钟,以充分变性蛋白。
使用浓缩的蛋白上样缓冲液可以减小上样体积,在相同体积的上样孔内可以加入更多的蛋白样品。
蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料自行配制,也可以使用赛驰生产的sds-page蛋白上样缓冲液(5x)。
(3)上样与电泳
冷却到室温后,把蛋白样品直接上样到sds-page胶加样孔内即可电泳,电泳缓冲液可以参考相关文献资料自行配制,也可以使用赛驰生产的sds-page蛋白电泳缓冲液(10x)。
为了便于观察电泳效果和转膜效果,以及判断蛋白分子量大小,最好使用预染蛋白质分子量标准。
电泳时通常在上层胶时使用低电压恒压电泳,而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。
对于标准电泳装置或类似电泳装置,低电压可以设置在80-100v,高电压可设置在120v左右。
采用普通的电泳仪就可以满足sds-page电泳的要求,也可以采用赛驰提供的多功能电泳仪。
为方便起见,也可整个sds-page电泳过程均采用恒压的方式,通常把电压设置在100v,然后设定时间为90-120分钟。
设置定时可以避免经常发生的电泳过冲。
通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳,或根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况,预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
3.转膜(transfer)
在western实验中,我们推荐选用pvdf膜,也可以使用硝酸纤
维素膜(nc膜),但硝酸纤维素膜比较脆,在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。
膜的使用请参考生产商推荐的使用步骤。
转膜时,通常可使用赛驰提供的多功能电泳仪。
转膜电泳缓冲液可以参考相关文献资料自行配制,也可以使用赛驰生产的蛋白印迹转膜电泳缓冲液(10x)。
具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定,目的蛋白的分子量越大,需要的转膜时间越长,目的蛋白的分子量越小,需要的转膜时间越短。
如使用bio-rad的标准湿式转膜装置,转膜电流可设定为300-400ma,转膜时间为30-60分钟或15-20ma于4℃转膜过夜。
在转膜过程中,特别是高电流快速转膜时,通常会有非常严重的发热现象,最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。
转膜效果可以通过预染蛋白质分子量标准观察转膜效果,通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。
转膜效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色,以观察实际的转膜效果。
也可以用考马斯亮蓝染色液对转膜后的page胶进行染色,以观察蛋白的残留情况。
4.封闭(blocking)
转膜完毕后,立即把蛋白膜放置到预先准备好的wb洗涤液中,漂洗1-2分钟,以洗去膜上的转膜液。
从转膜完毕起,以后所有的步骤均要注意膜的保湿,避免膜的干燥,否则极易产生较高的背景。
为减少液体使用量,避免干膜,您可以选用赛驰生物提供的杂交袋进行后续操作,可用巴斯特吸管吸尽洗涤液,加入wb封闭液,在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。
如背景较高,可以在4℃封闭过夜。
在
整个western过程中可使用侧摆摇床,侧向摆动速度比较缓慢,而且也容易让溶液覆盖蛋白膜。
5.一抗孵育(primaryantibodyincubation)
参考一抗的说明书,按比例用wb一抗稀释液适当稀释一抗。
用巴斯特吸管吸尽封闭液,不要漂洗,直接加入稀释好的一抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
如果效果不佳,可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。
回收一抗,加入wb洗涤液,在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。
吸尽洗涤液后,再加入洗涤液,漂洗3-5次,每次5-10分钟。
如果结果背景较高可以适当延长漂洗时间并增加漂洗次数。
6.二抗孵育(secondaryantibodyinucubation)
参考二抗的说明书,按照适当比例用wb二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(hrp)标记的二抗。
用巴斯特吸管吸尽洗涤液,立即加入稀释好的二抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
回收二抗,加入wb洗涤液,在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。
吸尽洗涤液后,再加入洗涤液,漂洗3-5次,每次5-10分钟。
如果显色结果背景较高,可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
7.蛋白检测(detectionofproteins)
检测结果可使用dab染色试剂或氯萘酚染色试剂来检测蛋白,具体使用细节请参考赛驰生物相关产品说明书.
8.膜的重复利用(membranerecovery)
如果蛋白样品非常宝贵,可以使用wb抗体去除液处理蛋白膜,
以重复利用蛋白膜
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- 封闭 可以 立春 染色