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细胞生物学全套资料第七章线粒体与叶绿体
第七章线粒体与叶绿体
第一节线粒体
1890年:
R.Altaman首次发现线粒体,命名为bioblast,以为它可能是共生于细胞内独立生活的细菌。
1898年:
Benda首次将这种颗命名为mitochondrion。
1900年:
L.Michaelis,用JanusGreenB对线粒体进行染色,发现线粒体具有氧化作用。
1948年:
Green证实线粒体,含所有三羧酸循环的酶
1949年:
Kennedy和Lehninger,发现脂肪酸氧化为CO2的过程是在线粒体内完成的
1976年:
Hatefi等,纯化了呼吸链4个独立的复合体。
1961-1980年:
Mitchell提出了氧化磷酸化的化学偶联学说。
一、结构
(一)形态与分布
线粒体形态:
*一般呈粒状or杆状
*因生物种类or生理状态而异
可呈环形、哑铃形、线状、分杈状或其它形状
主要化学成分:
*蛋白质、脂类
*其中蛋白质占线粒体干重的65-70%
脂类占25-30%
大小与数量:
*一般直径0.5~1μm,长1.5~3.0μm
在胰脏外分泌细胞中,可长达10~20μm,称巨线粒体。
*一般,数百~数千个
植物因有叶绿体的缘故,线粒体数目相对较少
肝细胞约1300个线粒体,占细胞体积的20%
单细胞鞭毛藻,仅1个
酵母细胞,具有一个大型分支的线粒体
巨大变形虫,达50万个
许多哺乳动物成熟的红细胞中,无线粒体
存在部位:
*通常结合在微管上,分布在细胞功能旺盛的区域
如,在肝细胞中,呈均匀分布
在肾细胞中,靠近微血管,呈平行or栅状排列
肠表皮细胞中,呈两极性分布,集中在顶端和基部
在精子中,分布在鞭毛中区
*线粒体在细胞质中,可以向功能旺盛的区域迁移
微管是其导轨,由马达蛋白提供动力
(二)超微结构
线粒体:
*由内外2层膜封闭
包括4个功能区隔
外膜、内膜、膜间隙&基质,(图7-1、7-2)。
*在肝细胞线粒体中
各功能区隔的蛋白质含量,依次为
基质67%,内膜21%,外8%膜,膜间隙4%
图7-1线粒体的TEM照片
图7-2线粒体结构模型
1、外膜
*含40%的脂类、60%的蛋白质
*具有孔蛋白,构成的亲水通道
允许分子量<5KD的分子,通过外膜
<1KD的分子,可自由通过
*标志酶为单胺氧化酶
2、内膜
*含100种以上的多肽
蛋白质:
脂类>3:
1
心磷脂含量高(达20%)
缺乏胆固醇,类似于细菌
*通透性很低,仅允许不带电荷的小分子物质通过
大分子&离子通过内膜时,需要特殊的转运系统
如:
丙酮酸、焦磷酸,是利用H+梯度协同运输
*线粒体氧化磷酸化的电子传递链,位于内膜
因此从能量转换角度来说,内膜起主要的作用
*内膜的标志酶,是细胞色素C氧化酶
嵴:
*内膜向线粒体基质褶入,形成嵴
嵴能显著扩大内膜表面积(达5~10倍)
*嵴,有两种类型
板层状(图7-1)、管状(图7-3))
多呈板层状
*嵴上覆有基粒
基粒由:
头部(F1偶联因子)
基部(F0偶联因子)构成
F0嵌入线粒体内膜
图7-3管状嵴线粒体
3、膜间隙
*内、外膜之间的腔隙
腔隙,宽约6-8nm
*外膜具有大量亲水孔道,与细胞质相通
因此,膜间隙的pH值与细胞质的相似
*标志酶为腺苷酸激酶。
4、基质(matrix)
*由内膜&嵴,包围的空间
*除糖酵解在细胞质中进行外
其他的生物氧化过程,都在线粒体中进行
*催化三羧酸循环,脂肪酸&丙酮酸氧化的酶类
均位于基质中
*其标志酶为苹果酸脱氢酶
*基质具有一套完整的转录、翻译体系
包括,线粒体DNA(mtDNA)
70S型核糖体
tRNAs、rRNA、DNA聚合酶
氨基酸活化酶等
*基质中还有
纤维丝&电子密度很大的致密颗粒状物质
内含Ca2+、Mg2+、Zn2+等离子。
二、氧化磷酸化的分子基础
(一)电子载体
呼吸链电子载体主要有:
烟酰胺脱氢酶类、黄素蛋白脱氢酶类、细胞色素类、铜原子、铁硫蛋白类、辅酶Q类等
1、NAD
即,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(图7-4)
是生物体内很多脱氢酶的辅酶
连接,三羧酸循环&呼吸链
将脱下来的氢,交给黄素蛋白
图7-4NAD的结构和功能
(NAD+:
R=H,NADP+:
R=-PO3H2)
2、黄素蛋白:
含FMN(图7-5)或FAD(图7-6)的蛋白质
每个FMN或FAD可接受2个电子、2个质子
呼吸链上具有:
以FMN为辅基的,NADH脱氢酶
以FAD为辅基的,琥珀酸脱氢酶
图7-5FMN(flavinmononucleotide)的分子结构
图7-6FAD(flavinadeninedinucleotide)的分子结构
3、细胞色素:
分子中含有血红素铁(图7-7)
以共价键的形式与蛋白结合
通Fe3+、Fe2+形式变化传递电子
呼吸链中有5类
即:
细胞色素a、a3、b、c、c1,
其中a、a3含有铜原子。
图7-7血红素c的结构
4、3个铜原子:
位于线粒体内膜的一个蛋白质上
形成类似于铁硫蛋白的结构
通过Cu2+、Cu1+的变化传递电子
5、铁硫蛋白:
在其分子结构中
每个铁原子&4个硫原子结合
通过Fe2+、Fe3+互变,进行电子传递
有2Fe-2S、4Fe-4S两种类型(图7-8)
图7-8铁硫蛋白的结构
(引自Lodish等1999))
6、辅酶Q:
是脂溶性小分子量的,醌类化合物
通过氧化、还原,传递电子(图7-9)
有3种氧化还原形式
即,氧化型醌Q
还原型氢醌(QH2)
介于两者之者的,自由基半醌(QH)
图7-9辅酶Q
(二)呼吸链的复合物
利用脱氧胆酸(一种离子型去污剂)
处理线粒体内膜、分离出呼吸链的4种复合物:
即,复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ
辅酶Q、细胞色素C,不属于任何一种复合物
辅酶Q溶于内膜
细胞色素C,位于线粒体内膜的C侧
属于膜的外周蛋白
1、复合物Ⅰ
即,NADH脱氢酶Ⅰ
又称NADH-CoQ还原酶
*由42条肽链组成,呈L型,
含有一个FMN&至少6个铁硫蛋白
*分子量接近1MD
以二聚体形式存在
*其作用是,催化NADH的2个电子→辅酶Q
(2个质子)
同时将4个质子
由线粒体基质(M侧)→膜间隙(C侧)
*电子传递的方向为:
NADH→FMN→Fe-S→辅酶Q
*总的反应结果为:
NADH+5H+M+Q→NAD++QH2+4H+C
2、复合物Ⅱ
即琥珀酸脱氢酶
*至少由4条肽链组成
*含有一个FAD
2个铁硫蛋白
*其作用是催化电子,从琥珀酸→辅酶Q
但不转移质子
*电子传递的方向为:
琥珀酸→FAD→Fe-S→Q
*反应结果为:
琥珀酸+Q→延胡索酸+QH2(脱2H,形成双键)
3、复合物Ⅲ
即,细胞色素c氧化酶
*由至少11条不同肽链组成
以二聚体形式存在
*每个单体包含有
2个细胞色素b(b562、b566)
1个细胞色素c
1个铁硫蛋白
*其作用是催化,电子从辅酶Q→细胞色素c
*每转移1对电子
同时,将4个质子,由线粒体基质→膜间隙
*总的反应结果为:
2还原态cytc1+QH2+2H+M
→2氧化态cytc1+Q+4H+C
复合物Ⅲ的电子传递比较复杂,和“Q循环”有关(图7-10)
辅酶Q,能在膜中自由扩散
*在内膜C侧
还原型辅酶Q(氢醌)将1个电子交给→Fe-S→细胞色素c1→细胞色素c
*氢醌被氧化为半醌
并将1个质子释放到膜间隙→半醌,将电子→细胞色素b566→细胞色素b562,释放另外1个质子到膜间隙
细胞色素b566得到的电子为循环电子
传递路线为:
半醌→b566→b562→辅酶Q
*在内膜M侧
辅酶Q,可被复合体Ⅰ(复合体Ⅱ)or细胞色素b562还原为氢醌
1对电子由辅酶Q→复合物Ⅲ的电子传递过程中
共有4个质子,被转移到膜间隙
图7-10Q循环示意图
引自Lodish等1999
4、复合物Ⅳ
即,细胞色素c氧化酶
*以二聚体形式存在
*其作用是,将从细胞色素c接受的电子→传给氧
*每转移1对电子
在基质侧,消耗2个质子(交给氧)
同时转移2个质子→膜间隙
每个单体,由至少13条不同的肽链组成
分为三个亚单位
*亚单位I(subunitI)
2个血红素(a1、a3)、1个铜离子(CuB)
血红素a3和CuB,形成双核的Fe-Cu中心
*亚单位Ⅱ(subunitⅡ)
2个铜离子(CuA)构成的双核中心
*亚单位Ⅲ的功能尚不了解
电子传递的路线为:
cytc→CuA→亚铁血红素a→a3-CuB→O2
总的反应结果为:
4还原态cytc+8H+M+O2
→4氧化态cytc+4H+C+2H2O
每转移1对电子
在基质侧,消耗2个质子(交给氧)
同时转移2个质子→膜间隙
(三)两条主要的呼吸链
*复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ组成,主要的呼吸链
催化NADH的脱氢氧化,
*复合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组成,另一条呼吸链
催化琥珀酸的脱氢氧化(图7-11)
*对应于1个复合物Ⅰ
大约需要3个复合物Ⅲ
7个复合物Ⅳ
任何两个复合物之间,没有稳定的连接结构
而是由辅酶Q和细胞色素c
这样的可扩散性分子连接
*呼吸链各组分有序
电子,按氧化还原电位→从低向高传递
能量逐级释放
呼吸链中的复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ都是质子泵
可将,质子转移到膜间隙
形成质子动力势(proton-motiveforce)
驱动ATP的合成
实验证明,人为提高线粒体膜间隙的质子浓度
能使线粒体合成ATP
图7-11两条主要的呼吸链(引自Lodish等1999)
呼吸链组分和ATP酶,在线粒体内膜上
呈不对称分布:
如,
*细胞色素C位于线粒体内膜的C侧
*而ATP酶位于,内膜的M侧
*对于呼吸链组分在内膜上的分布
主要依靠
用亚线粒体颗粒&冰冻能刻电镜技术来研究
三、氧化磷酸化的作用机理
(一)质子动力势
1961年
MitchellP提出“化学渗透假说
19世纪70年代
关于化学渗透假说取得大量实验结果的支持
成为一种较为流行的假说
Mitchell本人也因此获得1978年诺贝尔化学奖
图7-12化学渗透学说
根据“化学渗透假说”
*当电子沿呼吸链传递时,所释放的能量
将质子
从内膜基质侧(M侧)→膜间隙(胞质侧或C侧)
*线粒体内膜,对离子是高度不通透的
膜间隙的质子浓度>基质
*质子沿电化学梯度,穿过内膜上的ATP酶复合物
流回基质
使ATP酶的构象发生改变,将ADP、Pi合成ATP
(二)ATP合酶的结构和作用机理
ATP合酶(图7-13)
*分子量500KD,状如蘑菇
球形的F1(头部)
嵌入膜中的F0(基部)
*可以利用质子动力势,合成ATP
也可以水解ATP
转运质子,属于F型质子泵
*每个肝细胞线粒体,通常含15000个ATP合酶
100个ATP酶/秒钟
F1:
*由5种多肽组成α3β3γδε复合体
具有3个ATP合成的催化位点
每个β亚基各有1个
*α和β单位交替排列,状如桔瓣
*γ贯穿αβ复合体(相当于发电机的转子)
并与F0接触
*ε帮助γ与F0结合
*δ与F0的2个b亚基形成,固定αβ复合体的结构
(相当于发电机的定子)。
图7-13 ATP合酶的结构
(引自Lodish等1999)
F0:
*由3种多肽组成ab2c12复合体,嵌入内膜
*12个c亚基组成一个环形结构,具有质子通道
可使质子由膜间隙→流回基质
1979年代BoyerP提出构象耦联假说,一些有力的实验证据使这一学说得到广泛的认可。
其要点如下:
1、ATP酶利用质子动力势
产生构象的改变
改变与底物的亲和力
催化ADP与Pi,形成ATP(图7-14)。
2、F1具有三个催化位点
但在特定的时间,3个催化位点的构象不同
因而与核苷酸的亲和力不同
在L构象(loose),ADP、Pi与酶疏松结合在一起;
在T构象(tight)底物(ADP、Pi)与酶紧密结合在一起,在这种情况下可将两者加合在一起;
在O构象(open)ATP与酶的亲和力很低,被释放出去。
3.质子通过F0时
引起c亚基构成的环旋转,从而带动γ亚基旋转
由于γ亚基的端部是高度不对称的
旋转引起β亚基
3个催化位点构象的周期性变化(L、T、O)
不断将ADP和Pi加合在一起,形成ATP
图7-14ATP合酶三种构象的交替改变
(引自Lodish等1999)
支持构象耦联假说的实验有:
1、日本的吉田等人
将α3β3γ固定在玻片上
在γ亚基的顶端,连接荧光标记的肌动蛋白纤维
在含有ATP的溶液中温育时
在显微镜下可观察到,γ亚基带动肌动蛋白纤维旋转(图7-15)。
图7-15γ亚基旋转的观察
(引自Lodish等1999)
2、在另外一个实验中
将荧光标记的肌动蛋白
连接到ATP合酶的F0亚基上
在ATP存在时,同样可以观察到肌动蛋白的旋转。
(三)氧化磷酸化抑制剂
1.电子传递抑制剂
抑制呼吸链的电子传递,包括以下类型:
①抑制NADH→CoQ的电子传递。
如:
阿米妥(amytal)、鱼藤酮(rotenone)
杀粉蝶素A(piericidin)。
②抑制Cytb→Cytc1的电子传递。
如:
抗霉素A(antinomycinA)。
③ 抑制细胞色素氧化酶→O2。
如:
CO、CN、NaN3、H2S。
电子传递抑制剂,可用来研究呼吸链各组分的排列顺序→当呼吸链某一特定部位被抑制后→底物一侧均为还原状态,氧一侧均为氧化态→可用分光光度计检测→因为电子传递链组分氧化态和还原态,具有不同的吸收峰。
2.磷酸化抑制剂
与F0结合,阻断H+通道,从而抑制ATP合成
如:
寡霉素(oligomycin)
二环己基碳化二亚胺
(dicyclohexylcarbodiimide,DCC):
3.解偶联剂(uncoupler)
*使氧化与磷酸化脱偶联
氧化仍可以进行,而磷酸化不能进行
*解偶联剂为,离子载体or通道
能增大线粒体内膜对H+的通透性
消除H+梯度,因而无ATP生成
使氧化释放出来的能量全部以热的形式散发
*动物棕色脂肪组织、肌肉线粒体中
有独特的解偶联蛋白(uncouplingproteins,UCPs)
与维持体温有关
*常用解偶联剂主要有
质子载体:
2,4-二硝基酚(DNP,图7-16)
羰基-氰-对-三氟甲氧基苯肼(FCCP)。
质子通道:
增温素(thermogenin)
其它离子载体:
如缬氨霉素。
某些药物:
如过量的阿斯匹林,也使氧化磷酸化部分解偶联
从而使体温升高。
图7-16DNP分子结构
四、线粒体的半自主性
*1963年M.&S.Nass发现线粒体DNA(mtDNA)
在线粒体中又发现了
RNA、DNA聚合酶、RNA聚合酶
tRNA、核糖体、氨基酸活化酶等
进行DNA复制、转录和蛋白质翻译的全套装备
说明线粒体具有独立的遗传体系
*虽然线粒体也能合成蛋白质,但是合成能力有限
线粒体1000多种蛋白质中,自身合成的仅十余种
线粒体的核糖体蛋白、氨酰tRNA合成酶
许多结构蛋白,都是核基因编码
在细胞质中合成后,定向转运到线粒体的
因此称线粒体为半自主细胞器
*利用标记氨基酸培养细胞
用氯霉素&放线菌酮
分别抑制线粒体&细胞质蛋白质合成的方法
发现人的线粒体DNA编码的多肽
为细胞色素c氧化酶的,3个亚基
F0的2个亚基
NADH脱氢酶的7个亚基
细胞色素b等13条多肽
此外,线粒体DNA还能合成
12S和16SrRNA&22种tRNA
mtDNA分子
*为环状双链DNA分子
外环为重链(H),内环为轻链(L)
*基因排列非常紧凑
除与mtDNA复制、转录有关的一小段区域外
无内含子序列
*每个线粒体,含数个mtDNA
动物mtDNA约16-20kb
*大多数基因
由H链转录
包括,2个rRNA,14个tRNA
12个编码多肽的mRNA
L链,编码另外8个tRNA&一条多肽链
*mtDNA上的基因
相互连接or仅间隔几个核苷酸序列
一些多肽基因相互重叠
几乎所有阅读框,都缺少非翻译区域
很多基因没有完整的终止密码
而仅以T或TA结尾
mRNA的终止信号是在转录后加工时,加上去的
线粒体的起源:
*线粒体在形态
染色反应、化学组成、物理性质、活动状态、遗传体系等方面,都很像细菌
所以人们推测线粒体起源于内共生。
*按照这种观点
需氧细菌,被原始真核细胞吞噬以后
有可能在长期互利共生中,演化形成了现在的线粒体
*在进化过程中,好氧细菌逐步丧失了独立性
并将大量遗传信息转移到了宿主细胞中
形成了线粒体的半自主性
线粒体遗传体系,具有许多和细菌相似的特征,如:
①DNA为环形分子,无内含子;
②核糖体为70S型;
③RNA聚合酶,
被溴化乙锭抑制
不被放线菌素D所抑制;
④tRNA、氨酰基-tRNA合成酶,不同于细胞质中的;
⑤蛋白质合成的,起始氨酰基tRNA
是N-甲酰甲硫氨酰tRNA
对细菌蛋白质合成抑制剂氯霉素敏感
对细胞质蛋白合成抑制剂放线菌酮不敏感。
此外哺乳动物mtDNA的遗传密码与通用遗传密码有以下区别:
①UGA不是终止信号,而是色氨酸的密码;
②多肽内部的甲硫氨酸
由AUG和AUA,2个密码子编码
起始甲硫氨酸
由AUG,AUA,AUU,AUC四个密码子编码
③AGA,AGG不是精氨酸的密码子
而是终止密码子
线粒体密码系统中,有4个终止密码子
(UAA,UAG,AGA,AGG)。
mtDNA表现为母系遗传
*其突变率高于核DNA,并且缺乏修复能力
*有些遗传病
如,Leber遗传性视神经病,肌阵挛性癫痫等
均与线粒体基因突变有关
五、线粒体的增殖
线粒体的增殖,是通过已有的线粒体的分裂
有以下几种形式:
1、间壁分离(图7-17)
分裂时,先由内膜向中心皱褶,将线粒体分类两个
常见于鼠肝和植物产生组织中。
图7-17线粒体的间壁分裂
2、收缩后分离(图7-18)
分裂时,通过线粒体中部缢缩,并向两端不断拉长
然后分裂为两个
见于蕨类、酵母线粒体中
图7-18线粒体的收缩分裂
3、出芽
见于酵母、藓类植物
线粒体出现小芽,脱落后长大,发育为线粒体
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