基因工程考试要点.docx
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基因工程考试要点.docx
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基因工程考试要点
第一章
【基因工程理论基础(一般性了解)】
1.不同的基因具有相同的物质基础。
2.
地球上一切生物,它们的基因具有遗传功能的特定核苷酸序列的DNA片段;
3.
所有生物的DNA基本结构一样)
4.基因是可切割的。
5.基因是可以转移的。
6.多肽与基因之间存在对应关系。
7.遗传密码是通用的。
8.基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。
【基因工程研究的基本路线】:
1.目的基因的获取(DNA提取)
2.重组体的制备
3.转化(导入受体细胞)
4.克隆鉴定(鉴定基因存在与否)
5.目的基因扩增
6.目的基因表达
第二章
【核酸的分离纯化】:
最常用的是碱抽提法。
分离纯化步骤如下:
一、准备生物材料
【选材原则】:
1.处于提取DNA得率最高的生长期,或者是DNA容易提取和含量高的组织
2.(提取大肠杆菌源质粒DNA)应把菌液培养至对数生长期后期。
3.植物DNA,选用幼嫩的植株
4.动物组织,除净高活性的酶。
二、裂解细胞(因生物种类不同而不同,裂解细胞,使细胞破碎。
)
1.原核生物可用溶菌酶,可用NaOH和SDS、可用煮沸、冰冻、超声波等处理。
2.动植物材料:
粉碎、液氮冻结后研磨、捣碎机粉碎等。
3、分离和抽提DNA
【注意事项】
1.提取总DNA只需在细胞裂解液中加适量酚/氯仿/异戊醇
2.提取叶绿体或线粒体必须从裂解液中分离出完整的细胞器、病毒或噬菌体。
3.提取质粒DNA必须使其和染色体DNA分离开。
4.提取各种生物材料DNA时,一定要出去RNA。
【大肠杆菌源质粒DNA的提取】
1.菌体的制备
2.细胞裂解:
采用碱性SDS方法或溶菌酶处理
3.DNA的分离抽提
原理:
在强碱溶液中,DNA双链的氢键断裂变性,当溶液恢复中性时,DNA双链复性。
1.闭合环状的质粒DNA,在变性后不会分离,复性快
2.染色体线性DNA和有缺口的质粒DNA变性后双链分离,难以复性而形成缠绕的结
构,与蛋白质-SDS复合物结合在-
注:
结合在后面没了,估计只需要记原理那行就行。
【注:
通过分离抽离得到DNA最关键的】:
1.去除非DNA类的物质:
如蛋白质、糖、脂肪等
2.去除质粒DNA以外的大分子DNA,根据什么原理,区分染色体DNA与质粒DNA
1 染色体DNA比质粒DNA分子大得多,且染色体DNA为线性分子,而质粒DNA为共
价闭合环状分子;
2 当用碱处理DNA溶液时,线状染色体DNA容易发生变性,共价闭环的质粒DNA在
回到中性pH时即可恢复其天然构象;
3 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀,而复性的超螺旋质
粒DNA分子则溶解状态存在液相中,从而可通过离心将两者分开。
【DNA提取制备】(以大肠杆菌质粒DNA的提取为代表):
1.溶菌(溶解细菌细胞壁)
2.细菌细胞膜破坏,蛋白质和DNA变性(体内外,缠绕沉淀,但是质粒不加入去缠)
3.中和(质粒复性而蛋白质和DNA变性沉淀)
4.离心去沉淀
5.纯化DNA(过柱等)
6.沉淀DNA(无水乙醇或异丙醇)
7.离心(取沉淀)
【试剂的作用】:
1.酚-氯仿:
蛋白质变性剂,进一步抽提DNA溶液中的蛋白质,使蛋白质沉淀。
2.TE缓冲液:
DNA保存液。
由Tris-HCL和EDTA配制。
Tris-HCL不含金属离子,有
利于以后操作;EDTA抑制DNA酶,防止DNA被酶降解。
3.乙醇:
用于沉淀DNA。
DNA分子以水合状态“溶于”水里,乙醇能夺去DNA分子的
水环境。
4.RNA酶A:
降解RNA。
以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。
【DNA的浓缩的实验室常用方法】:
1.乙醇沉淀法
2.正丁醇抽提法
3.聚乙二醇浓缩法
【核酸的定量】:
1.紫外光谱:
原理:
基于DNA(或RNA)在260nm波长处有特异的紫外吸收峰。
用微量比色杯(10μl)在紫外分光光度计直接测定。
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳
【DNA分子量估计】:
1.聚丙烯酰胺凝胶电泳
2.琼脂糖凝胶电泳,与已知分子量的DNA标准混合液对比(Marker)
原理:
利用溴化乙锭(EB)能插入DNA分子中,紫外光照下能发红色荧光,荧光强度
与已知浓度的DNA电泳带荧光强度对比,就可以估计出DNA含量
【RNA提取制备】(与DNA的相似)
关键:
防止RNA酶的污染(防止RNA酶降解RNA)
1.避免外源RNA酶的污染:
制取RNA的玻璃器皿要灭菌处理
2.抑制内源性RNA酶的活性:
加入强变性剂使之失活;在RNA的反应体系加入RNA酶抑制剂
【电泳的基本原理】(一般性掌握):
1.带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动,速度称为
电泳迁移率
2.电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比
3.电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。
4.摩擦系数主要与分子大小形状及介质粘度有关。
5.如果场强一定(电压和电极距离),电泳介质相同,分子在电场中的迁移速度主要
取决于分子本身的大小和形状(分子相对质量相关)
【方法:
琼脂糖凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳(两个电泳的基本过程)】
(看看书里有没)
第三章
【内切酶作用】:
切割DNA分子,获得含有完整基因、复制起始位点、转录启动子或转录
区等具有特定功能的DNA片段。
【类别】:
(一般性了解)
1.I型:
由三个基因构成,hsdR;hsdM;hsdS,位于染色体上,三个基因构成一个
复合体,限制酶需要ATP、Mg2+、SAM(5—腺苷甲硫氨酸)。
2.II型:
限制与修饰基因产物独立起作用,在Ecoli中这两种基因位于质粒上。
首先从流感嗜血菌中分离出来,分离的第一个是HindⅡ.(只讲了这个)
3.III型:
修饰酶与I型酶相同,hsdM与hsdS基因产物结合成一亚单位,限制酶是
独立存在的(只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异
性,被广泛应用在基因工程上)。
【限制性核酸内切酶反应系统】
1、底物:
双链DNA分子(或DNA片段),作用位点在识别序列上。
催化效率:
a、DNA纯度高低与催化速率高低成正比。
b、DNA分子构型:
切割线形DNA分子明显高于超螺旋质粒DNA和环状病毒DNA。
c、识别序列的侧面序列(长短)
d、位点偏爱:
侧面序列的核苷酸组成
e、DNA甲基化:
被甲基化酶甲基化,若在识别序列,则影响很大。
2、酶用量:
主要取决于酶本身的催化活性和底物DNA样品。
A、样品确定,则酶活性高低决定酶用量
B、能被高效切割的DNA样品,用量少(特定识别序列的密度大则用量多)
3、缓冲溶液:
各种在最适的反应缓冲液中才具最强的催化活性。
4、内切酶反应温度:
不同种类的内切酶一般不一样。
5、star活性:
某种限制性核酸内切酶在特定条件下,可以在不是原来的识别序列切割DNA,这种现象称为star活性。
出现频率因采用的限制性核酸内切酶、底物DNA和反应条件的不同而不同。
几乎所有的限制性核酸内切酶都具有star活性。
(名词解释)
【注:
划线部分是要求记住的,没划的一般性了解就行。
】
【DNA的常用切割方法】:
1.单酶切法:
最常用。
片段的两末端相同
2.双酶切法:
片段两末端不相同(同尾酶除外)。
先后分别在不同的反应系统去切割
【DNA连接酶作用】:
借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA双链DNA片段紧靠在一起
的3’-OH末端与5’-PO4末端之间形成磷酸二酯键,使两末端连接
【连接酶的作用特点】:
1.被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子
2.羟基和磷酸集团之间形成磷酸二酯键是一种耗能反应
大肠杆菌利用NAP+作为能源
动物和噬菌体利用ATP作为能源
【DNA聚合酶】:
1.E.coli聚合酶(全酶)
2.TaqDNA聚合酶(耐高温)
3.klenow大片段酶
4.T4DNA聚合酶
5.T7DNA聚合酶(比较贵)
【全酶的功能】:
1.5’-3’DNA聚合酶活性
2.3’-5’外切酶活性
3.5’-3’外切酶活性(其他酶缺这个功能)。
【DNA聚合酶作用特点】:
在引物RNA的作用下,以dNTP为底物,按模板DNA上的指令把
脱氧核苷酸连续地加到双链DNA引物链的3’-OH末端,催化核
苷酸的聚合作用。
【TaqDNA聚合酶的功能】:
能以高温度性的靶DNA分离出来的DNA为模板,从分别结合在
扩增区段两端的引物为起点,按5’-3’的方向合成新生互补DNA。
【作用范围】:
1.具有5’-3’DNA聚合酶活性
2.依赖于5’-3’聚合作用外切酶活性
3.最适反应温度75~80℃
【反转录酶功能】:
可用来把任何基因的mRNA反转录成cDNA拷贝,然后可大量扩增插入
载体后的cDNA,也可以用来标记cDNA的作为放射性的分子探针。
【碱性磷酸酶功能】:
作用特点:
能够催化核酸分子脱掉5’磷酸基团,从而使DNA(或RNA)片段的5’-P末端
转换成5’-OH末端。
使用:
为了防止线性化的载体分子发生自我连接,移去5’-P基团。
【S1核酸酶功能】:
1.去除DNA片段中突出的单链尾以产生平端
2.去除双链cDNA合成中产生的发夹环
3.分析DNA-RNA杂交体的结构
4.确定内含子的位置
【第三章:
基因克隆载体】
【克隆载体的DNA分子必须具备的条件】:
1.在宿主细胞内能够独立复制。
2、有选择性标记(带特殊基因,其表达可以被识别)
3、有一段多克隆位点,外源DNA插入其中不影响载体的复制
4、分子量小,拷贝数多
5、容易从宿主细胞中分离纯化。
(前四个为最基本条件)
【分类(一般性了解)】
【按来源分】:
1.质粒克隆载体、
2.病毒或噬菌体克隆载体、
3.质粒DNA与病毒或噬菌体DNA组成的克隆载体、
4.质粒DNA与染色体DNA片段组成的克隆载体
【按应用范围分】:
表达型克隆载体、启动子探针型克隆载体和cDNA克隆载体
【按应用对象】:
原核生物克隆载体、植物克隆载体、动物克隆载体
【构建质粒克隆载体的基本策略】:
1、构建的质粒克隆载体应该是能在转化的受体细胞中进行有效的复制,并且作为质粒克隆
载体,希望在受体细胞中有较多的拷贝数。
2、构建的质粒克隆载体必须含有允许外源DNA片段克隆的位点
3、构建的质粒克隆载体必须含有供选择克隆子的标记基因
4、构建的质粒克隆载体DNA分子应尽可能小(易进出细胞)
5、根据特殊需要,使构建的质粒克隆载体中组装各种“元件”(小DNA片段),构建成不同用途的质粒克隆载体。
【质粒的分子大小】:
1.分子大小:
1-200kb
2.小的不足2kb,大的可达100kb,多数在10kb
【如何构建质粒pBR322(不要求记,看懂即可)】:
书P113
【pBR322质粒载体优点】:
1)具有较小的相对分子质量:
4363bp,容易纯化。
2)具有两种可供利用的抗生素抗性选择标记:
Ampr和Tetr,可以作为选择标记。
而且每一个标记基因都含有单一的酶切位点,可以插入DNA。
Ampr(氨苄青霉素抗性基因)内可被PstI,PvuI,SacI(限制性核酸内切酶)切开,
Tetr(四环素抗性基因)可被BamHI,HindIII(限制性核酸内切酶)切开,
且这些限制性核酸内切酶在此质粒克隆载体只有一个识别序列,通过插入失活筛选重子。
3)具有较高的拷贝数:
受体细胞内,pBR322以多拷贝存在,一般一个细胞内可达到50-100个,而在蛋白质合成抑制剂存在条件下,如氯霉素,可达到1000-3000拷贝。
【pUC质粒优点】:
1、更小的分子量和更高的拷贝数,如pUC18为2682bp。
2、适用于组织化学方法检测重组体含有IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)和X-gal(5-
溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖)(蓝色、白色)可显色直接选择。
3、具有多克隆位点,使具有两个不同的黏性末端的外源DNA片段能方便地插入。
【标记基因】:
1.Ampr(氨苄青霉素抗性基因)
2.大肠杆菌的β-半乳糖苷酸酶基因的启动子及其编码α-肽链的DNA序列,称
LacZ’基因。
三、λ噬菌体
【λ噬菌体性质】:
1、是线状DNA分子,可自动成环(全长48520bp)
2、λ噬菌体有61个基因,有一半是必需的,与自身的活动有关,成簇排列,其他约1/3
是非必需基因。
3、λ噬菌体上有56种限制性核酸内切酶的识别位点
4、λ噬菌体有溶菌和溶原两条生长途径。
【λ噬菌体载体的特点】:
(分子量大小:
4万左右PK质粒几千kb)
【构建λ噬菌体克隆载体的基本路线】:
1用内切酶切去DNA上的非必需区(目的:
为了减小分子量。
)
1)用EcoRI部分切割λDNA;
2)用点突变或甲基化酶处理,使必需区酶的EcoRI识别位点失效。
2在λDNA的非必需内插入选择标记基因(目的:
方便筛选。
)
3建立重组λDNA分子体外包装系统(把体外包装的蛋白恢复)(区别于质粒的特点。
)
【优点(一般性了解)】
1.在转化的细胞中传播重组的DNA分子作为稳定的遗传成分
2.在可能将有缺陷的或突变的基因置于病毒调节信号的控制下以进行研究。
3、能将克隆的基因作为病毒微染色体的一部分,并能进分离。
4.转移效率较高
【缺点:
病毒载体对外源基因的最大容纳量只有2.5KB】
【柯斯质粒载体优点】:
1.大小:
是一种环形双链DNA,分子量大小4~6kb
2.具有λ噬菌体的某些特性:
λDNA的cos序列和控制包装的序列
3.具有质粒载体的特性:
1)具有PBR322质粒的复制子,抗药性基因和几个限制性酶的单一位点
2)有抗菌素抗性基因,和插入失活的克隆位点,便于选择。
4.高容量的克隆能力(45kb)(最少不能低于30kb)
5.兼具了λ噬菌体载体和pBR322质粒载体的优点。
【注:
只有插入的外源DNA片段至少达到30kb长,才能包装成具有感染性的λ噬菌体颗粒,柯斯质粒载体在克隆大片段DNA分子时特别有效。
】
【第四章目的基因的制备】
目的基因的制备方法(所有的基本原理,各自在什么情况下用什么方法)
【1、直接分离法(目的基因已掌握,才能用)】
1)内切酶酶切分离法(适用于从简单基因组中分离目的基因)详见56
a.对已定序的DNA分子;
b.对已知定位的目的基因,根据目的基因两侧的已知内切酶识别位点进行酶切。
c.通过酶切对无定序的DNA分子,构建基因文库,再进一步调取目的基因。
2)基因分离的物理化学法(一般了解)a密度梯度离心法b单链酶解法c分子杂交法
原理:
不同基因片段剪辑浮力密度和解链温度不同。
3)双抗体免疫法分离编码蛋白的基因P56
【其基本原理】核糖体沿mRNA进行多肽链合成时形成多聚核糖核蛋白。
从细胞匀浆液中制备这种多聚核糖核蛋白体,并同由待分离基因表达的蛋白产物制备的特定抗体一起保温,形成多聚核糖体同抗体的复合物。
这种复合体数量少,难以从细胞总多聚核糖体分离出来。
但加入由此特定蛋白的抗体产生的第二抗体时就可以通过不连续蔗糖梯度离心,将所要的含有特定mRNA多聚核糖体从总多聚核糖体分离出来,再通过酚、氯仿抽提去除蛋白,柱层析,就可以得到特定蛋白编码的mRNA。
【注:
材料细胞(如:
种子细胞)提取全部蛋白,分离该蛋白,纯化至单一成分,将得到的基因表达蛋白注入受体(小兔),得到抗体,分离单一抗体,器官组织分离捣碎,溶解于缓冲液,放入抗体,抗体与多聚核糖体结合,沉淀离心,得到mRNA,逆转录得到DNA。
4)利用酶促反转录法直接从特定mRNA分离基因
原理:
以目的基因的mRNA为模板,在逆转录酶的作用下合成互补的DNA,即cDNA,然后在DNA聚合酶的催化下合成双链cDNA片段,与适当的载体重组后转入受体菌,获得目的基因的cDNA克隆。
【2、构建基因组文库法(目的基因不能查到,没有资料可查)】
【A基因文库】:
某种生物的基因组的全部遗传性息通过克隆载体贮存在一个受体菌
的群体之中,这个群体即为这种生物的基因文库。
【步骤】:
用重组DNA技术将某种生物细胞的总DNA或染色体DNA的氨基酸片段R有机的连接到基因载体上,然后转移到适当的宿主细胞中,通过细胞增殖的构成各个片段的无性繁殖克隆,在制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下,这一克隆的总体被称为生物的基因文库。
【意义】:
保存基因(对难以获得的材料而言)。
【BcDNA文库的构建】:
利用某种生物的总RNA合成cDNA,再将这些cDNA与载体连接,
转入细菌细胞进行繁殖、保存和扩增,称cDNA文库。
cDNA:
以RNA为模板逆转录出的DNA,没有内含子。
【cDNA基因文库构建的一般步骤】:
(过程要分析,不能简单的回答)
(1)总mRNA提取与mRNA的分离纯化
原理:
利用mRNA都有一段PolyA尾巴将mRNA从总RNA(tRNA、rRNA)中分离纯化。
mRNA只占总RNA的1%-2%。
提取总RNA有商业化的试剂盒,分离mRNA用商业化的OligodT纤维柱。
(2)cDNA的合成与克隆
原理:
1.利用逆转录病毒的逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。
用OligodT(或随机引物)作引物,合成cDNA的第一条链。
2.用碱处理降解mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA。
【cDNA第一条链的合成】:
关键因素:
1模板mRNA2反转录酶
常用引物:
1OligodT2、6聚体寡核苷酸随机引物
cDNA第二链的合成:
A.变性降解出去DNA/RNA杂交分子中的RNA,单链cDNA3’末端环化,形成发卡结构,在DNA聚合酶作用下,合成第二链。
缺点:
由于采用S1酶降解“发卡”结构,常使这部分序列丢失。
B.用RNaseH酶使DNA/RNA杂交分子中的RNA分子水解为小片段,并以此为引物开始合成第二链。
当加入DNA连接酶时,使第二链成为完整的分子。
最后在T4DNA连接酶作用下,使双链DNA成为平头末端。
【过程】:
1.第一条cDNA链合成:
T引物与mRNA退火(反转录反应形成单链cDNA)
2.第二条cDNA链的合成:
(合成双链)
a.第一条cDNA链3’-末端加尾(dCTP)
b.限制酶切除去载体上所加的多聚C尾巴
c.与G引物退火
d.除去RNA。
e.合成第二条cDNA链
(3)cDNA与载体连接:
在双链cDNA末端接上人工接头,即可与载体连接,转入受体菌。
借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G,成为粘性末端。
(4)噬菌体的包装、转染及质粒DNA的转化
【3、利用PCR反应扩增目的基因】
【概念】:
如果已知目的基因的全序列或其两侧序列,可以通过合成一对与模板DNA互补的引物,十分有效地扩增出所需的DNA片段。
【要求】:
待扩增片段必须已知的,至少DNA片段两端长约20kb的序列已知,这样才能设计出有效的3‘和5’端的引物,进行扩增。
【PCR技术总过程】:
变性→复性→延伸→循环
【原理】:
(1)DNA变性双链DNA在受热后,配对碱基的氢键断裂,DNA两条链分开成单链。
这些单链正好成为复制新的DNA的模板(温度范围:
90-95摄氏度,大多数94℃,持续时间20s,能否完全分开,是PCR扩增DNA片段成败的重要原因)
(2)DNA复性人工合成的单链DNA小片段碱基序列分别与要扩增的DNA双链的5端相同,因而能与模板DNA复性,成小段双链,充当体内DNA复制时的引物。
(类似体内复制时的RNA引物)(复性温度:
主要取决于引物的长短和GC含量。
对于长度为20个核苷酸、GC含量为50%的典型引物来说,55摄氏度是比较合适的。
如果只有12-15个核苷酸,则复兴温度以40-45℃为宜,由于引物过量,引物与模版杂交可以在瞬时完成,所以时间短,20s)
(3)DNA链的延伸DNA聚合酶按碱基配对的原则在模板上延伸DNA链。
(类似体内前导链的复制)(在70-75℃下,时间随扩增的DNA长度而定,一般1000bp的需要1min,150bp一下不考虑延伸时间)
(4)新一轮循环开始变性——复性——延伸
(5)循环的反复(每循环一次,底物DNA的拷贝数增加一倍),
【影响PCR的因素(分析实验错误)】
(1)Taq聚合酶:
Taq聚合酶原是喜温性真细菌ThermusaquaticusBM内的一种耐热性DNA聚合酶。
后将这种酶的基因转入大肠杆菌细胞中,现在市场销售的Taq聚合酶是大肠杆菌的表达产物。
【Taq聚合酶】:
(本身质量)
1.稳定性Taq聚合酶的最大特点是热稳定性,耐高温,非常适合
2.最适温度高
3.Taq聚合酶的激活剂对金属离子尤其是Mg2+敏感
(2)引物:
是PCR过程中引导互补链DNA合成的一种脱氧核苷酸寡聚体,其3’端必须具有游离的-OH基团
【引物的作用】:
作为DNA复制的起始点,在核酸合成反应时,作为每个多核苷酸链进行
延伸的出发点而起作用的多核苷酸链。
导互补链DNA合成。
1.位置PCR引物一般是人工合成的与待扩增的DNA区段的两3‘端序列互补的短
DNA
2.引物长度一般设计为15-30kb
3.引物序列3’端必须与模板正确配对,5‘端可以不配对,根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序,RNA聚合酶识别序列,突变位点、或生物素标记等,方便以后操作
4.碱基组成:
尽可能增加CG含量达50%以上,避免连续相同碱基或内部回文序列(可能形成发卡结构);两个因为之间不能有两个以上的连续碱基互补序列,以免形成引物二聚体。
5.引物的Tm值f引物的浓度
(3)模板:
一条待扩增的特定双链DNA片段的一条单链DNA
【模板】
1.纯度PCR对模板DNA的纯度要求不高,但不能有蛋白质变性剂、DNA聚合酶、螯
合剂等影响DNA聚合酶的活性
2.模板的量不能太多
(4)dNTP浓度一般反应体系中dNTP混合物终浓度用0.2m/lL浓度过高会抑制Taq聚合酶的活性并增加错配率
(5)增加Mg2+的浓度
应用中存在问题与解决方法:
1.假阳性不应该出来的结果出来了
1)原因:
样品污染、扩增试剂污染、扩增产物交叉污染
2)解决:
隔离工作区,改进操作,避免试剂污染
2.假阴性应该出来的结果没有出来。
(原因复杂,难分析)
A.原因:
DNA样品中含有Taq酶抑制剂、DNA样品中含有重金属,时间长短,温度高低,DNA样品的进一步纯化
4、基因的化学合成(仅适用于短片段)
基因的化学本质实际上就是一段具有特定生物学功能的核苷酸序列,由鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶等四种碱基组成,如果是RNA片段,胸腺嘧啶被尿嘧啶所取代。
【第五章、目的基因的分离】
【目的基因的功能克隆】
(1)根据特异蛋白分离目的基因(原理)
基本过程:
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他蛋白分离技术从生物体的组织和器官中分离出一定发育时期的特异蛋白,应用蛋白质测序技术测定特异氨基酸序列,然后按照遗传密按照遗传密码,人工合成一段寡核苷酸片段作为探针,从cDNA文库或基因组文库中筛选相应的基因。
【笔记:
A聚丙烯酰胺凝胶电泳B蛋白质测序技术测定特异氨基酸序,按照遗传密按照遗传密码C人工合成一段寡核苷酸片段作为探针,从cDNA文库或基因组文库中筛选相应的基因。
(过程)书本207页】
工作量大,测序常常得不到结果(N端封闭),成本高。
适用于该
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