年基因工程大实验讲义.docx
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年基因工程大实验讲义.docx
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年基因工程大实验讲义
各位同学:
本学期的植物基因工程实验定于第十一周的周一至周六(10.31-11.5日)在综合楼513室进行。
望各位同学提前打印好实验讲义,并在每次实验之前对相应实验内容做好充分预习。
(实验讲义内容及日程安排见网络教学平台。
用户名2009chenshihua
密码:
123
具体实验试验内容如下:
大实验一目的基因的克隆(共计8学时)
实验一Trizol试剂快速提取植物总RNA(4学时)
实验二反转录PCR(4学时)
实验三目的基因的PCR扩增(中间穿插准备下次实验相关材料)(4学时)
大实验二表达载体的构建(共计24学时)
实验一琼脂糖凝胶电泳检测、PCR扩增基因产物的回收及重组载体的构建(4学时)
实验二大肠杆菌感受态的制备(CaCl2法)(4学时)
实验三质粒(重组载体)转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的筛选(4学时)
实验四质粒(碱法)提取及电泳检测(4学时)
实验五重组载体(质粒)的酶切和电泳检测(4学时)
大实验三目的基因的遗传转化及分子筛选/检测(共计16学时)
实验一植物转基因操作:
渗透法转化拟南芥及转化子筛选(4学时)
实验二植物基因组DNA的提取及电泳检测(4学时)
实验三转基因植物的PCR检测(及转基因动植物相关检测方法介绍)(4学时)
实验四β-葡萄糖醛酸苷酶(GUS)组织化学染色检测转基因植物(4学时)
基因工程综合实验具体日程安排:
周一上午:
总RNA(Trizol试剂)快速提取
周一下午:
RNA电泳检测及反转录PCR
周二上午:
目的基因的PCR扩增(中间穿插准备后面实验用的LB培养基)
周二下午:
琼脂糖凝胶电泳检测并回收PCR扩增基因产物及重组载体的构建
周三上午:
大肠杆菌感受态的制备(CaCl2法)
周三下午:
质粒(重组载体)转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的筛选
周四上午:
植物基因组DNA的提取及电泳检测
周四下午:
转基因植物的PCR检测(及转基因动植物相关检测方法介绍)
周五上午:
质粒(碱法)提取及电泳检测
周五下午:
重组载体(质粒)的酶切及电泳检测
周六上午:
植物转基因操作技术:
渗透法转化拟南芥及转化子筛选
周六下午:
β-葡萄糖醛酸苷酶(GUS)组织化学染色检测转基因植物
实验一Trizol试剂快速提取植物总RNA
实验二反转录PCR(RT-PCR)
实验三琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物(DNA)
实验四从琼脂糖凝胶中回收(PCR产物)DNA片段
实验五DNA片段的连接(向质粒载体中插入外源DNA)
实验六大肠杆菌感受态的制备(CaCl2法)及活性检测
实验七质粒转化
实验八、九质粒(碱法)提取及重组质粒(重组子)的筛选和酶切检测
实验十渗透法转化拟南芥及转化子筛选
实验十一植物基因组DNA的提取及转基因植物PCR检测
实验十二转基因植物的PCR检测
实验一Trizol试剂快速提取植物总RNA
实验目的
学习用试剂盒从植物组织中提取总RNA的方法。
实验原理
RNA是一类极易降解的分子,要获得完整的RNA必须在提取过程中最大限度地抑制内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解作用。
高强度变性剂异硫氰酸胍,可溶解蛋白质,破坏细胞结构,使核蛋白与核酸分离,失活RNA酶,所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。
细胞裂解后,除了RNA,还有DNA,蛋白质和细胞碎片,通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA,LiCl可以选择性的沉淀RNA,使RNA进一步得到纯化。
TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚,其中异硫氰酸胍可裂解细胞,促使核蛋白体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。
当加入氯仿时,它可抽提酸性的苯酚,而酸性苯酚可促使RNA进入水相,离心后可形成水相层和有机层,这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。
水相层(无色)主要为RNA,有机层(黄色)主要为DNA和蛋白质。
焦碳酸二乙酯(DEPC):
一种高活性的烷化剂,通过组胺基团的乙氧基甲酸化形式破坏RNase活性。
因此常用于灭活缓冲液和玻璃器皿中的RNase。
抑制RNase的活性:
准备溶液时使用无RNase的玻璃器皿、DEPC处理过的水。
180-300℃烘烤玻璃器皿4小时。
用DEPC或其他商业化产品处理塑料制品。
尽量使用无RNase的一次性移液器头和微量离心管。
在从原包装取出这些小器具时最好使用无菌的镊子!
在分离RNA的过程中用抑制剂抑制RNase的活性。
实验仪器、材料与试剂
(一)仪器
1.低温离心机
2.200℃以上烘箱
3.琼脂糖凝胶电泳系统
4.紫外线透射仪
5.高压灭菌锅
6.恒温水浴锅
7.陶瓷研钵
8.微量移液器
(二)材料
1.新鲜植物组织
2.1.5mlEppendorf离心管
3.剪刀、一次性手套等
(一)试剂
1.Trizol试剂
2.氯仿
3.异丙醇
4.70%乙醇
5.焦碳酸二乙酯(DEPC)
实验步骤
1.称取100mg新鲜植物植株,液氮研磨成粉末移入DEPC处理并灭菌的1.5mlEppendorf离心管。
2.加入1mlTrizol试剂,充分混匀。
3.15~30℃,5min。
4.4℃,13000rpm,10min。
5.取上清,加入氯仿200µl,混匀,15~30℃,放置2~5min。
6.4℃,12000rpm,10min。
7.取上清移至另一1.5mlEppendorf离心管,加预冷的异丙醇500µl,15~30℃,10min
8.4℃,12000rpm,10min(RNA成胶状)
9.弃上清,加1ml75%乙醇(用DEPC水配制),漩涡器上加一张滤纸涡匀。
10.4℃,9000rpm,5min。
11.弃上清,用灭菌枪头超净台吸干,超净台上风吹干5~10min.
12.用不含RNase的水(DEPC水)溶解RNA(用枪头反复吸打)
13.55~65℃,水浴10min(破坏二级结构)
14.-20℃,可以暂存,然后做反转录。
思考题:
1、RNA提取中需要注意的问题有哪些?
实验二反转录PCR(RT-PCR)
实验目的
学习用试剂盒进行反转录PCR的方法。
实验原理
聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)简称PCR技术,是一种体外扩增特异DNA片段的技术。
利用PCR技术可在短时间内获得数百万个特异的DNA序列的拷贝。
PCR技术在分子克隆、遗传病的基因诊断等方面得到了广泛的应用。
PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。
PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。
反应分为三步:
1变性:
在高温条件下,DNA双链解离形成单链DNA;2退火:
当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链;3延伸:
在DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+存在的条件下,聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。
以上三步为一个循环,每一循环的产物可以作为下一个循环的模板,几十个循环之后,介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制,数量可达到~106~7个拷贝。
PCR技术的参数主要有7个:
聚合酶、引物、dNTPs、反应buffer、二价离子、模板、一价离子。
反转录PCR扩增是指以RNA为模板,经过反转录酶的作用,通过聚合酶链反应(PCR)合成cDNA,并利用基因特定的引物,以合成的cDNA为模板进行PCR反应,从而克隆目的基因或检测特定基因的方法。
实验仪器、材料与试剂
(一)仪器
1.PCR仪
2.台式离心机
3.琼脂糖凝胶电泳系统
4.微量移液器
(二)材料
1.植物总RNA
2.上、下游引物(正向引物、反向引物)
(三)试剂
1.TaKaRa的RNAPCRKit(AMV) Ver.2.1
2.琼脂糖凝胶电泳所需试剂
实验步骤
1.反转录反应
反转录反应利用TaKaRa的RNAPCRKit(AMV) Ver.2.1进行。
按下列反应组成调制反转录反应液(20µl体系):
MgCl2
4
µl
10×RNAPCRBuffer
2
µl
RNaseFreedH2O
8.5
µl
dNTPMixture
2
µl
RNaseInhibitor
0.5
µl
AMVReverseTranscriptase
1
µl
SpecificreverseprimerorOligodT-Adaptor
1
µl
植物总RNA(≤1µg)
1
µl
按以下程序进行反转录反应:
42℃30min,99℃5min,5℃5min。
2.PCR扩增:
按下列反应组成调制反应液(50µl):
10×RNAPCRBuffer(含Mg++)
5
µl
灭菌蒸馏水
39.5
µl
TaKaRaTaq
0.5
µl
上游引物
1
µl
下游引物
1
µl
dNTPMixtures
1
µl
模板(反转录产物)
1
µl
轻轻混匀后,按以下条件进行PCR反应:
预变性94℃2min;变性94℃30sec,退火56℃30sec,延伸72℃1.5min,30个循环;保温72℃10min;4℃保温。
用1%的琼脂糖凝胶电泳检测基因扩增情况。
思考题:
简述反转录反应的意义。
实验三琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物(DNA)
实验目的
了解琼脂糖凝胶电泳的原理,掌握琼脂糖凝胶的制作及进行电泳的方法。
实验原理
琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中常规的实验方法,也是分离和纯化DNA的常用方法,它能检测少量的DNA(如用肉眼观察,可检测到10ng的DNA)且检测的范围很广。
不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下(如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等),有不同的迁移率,所以可通过电泳使其分离。
凝胶中的DNA可与荧光染料溴化乙锭(EB)结合,在紫外灯下可看到荧光条带,籍此可分析实验结果。
它的原理是溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光,当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时,溴化乙锭从正极向负极移动,这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物,使DNA在紫外光下发射很强的荧光。
在溴化乙锭足够的情况下,荧光的强度正比于DNA的含量,这样就可以检测DNA的浓度。
溴化乙锭为一种有毒试剂,使用时一定要戴手套操作,注意防护。
实验仪器、材料与试剂
(二)仪器
1.水平式凝胶电泳槽
2.稳压电泳仪
3.电炉
4.紫外检测仪
5.台式离心机
(三)材料
实验二中获得的PCR产物(DNA)。
(四)试剂
1.琼脂糖
2.50×TAE电泳缓冲液贮存液配方:
(50×)每升
Tris(M=121.14)242g
冰醋酸57.1ml
0.5mol/LEDTA(pH8.0)100ml
1×缓冲液浓度:
0.04mol/LTrisHAc、0.001mol/LEDTA
3.溴化乙锭溶液10mg/ml水溶液,室温,棕色瓶或铝铂纸包装保存。
1.0g 溴乙锭
100ml 三蒸水
4.10×DNA样品上样缓冲液
附注:
1.核酸电泳缓冲液
核酸电泳缓冲液有三种,分别是Tris—硼酸(TBE)、Tris—乙酸(TAE)和Tris—磷酸(TPE)。
在上述三种缓冲液中:
TBE与TPE缓冲液容量高,对DNA的分离效果好,但TPE液中含磷酸盐的浓度偏高,容易使DNA沉淀。
TAE液的缓冲容量低,价格较便宜。
本实验选用的是TBE缓冲液。
缓冲液中的EDTA可螯合正价阳离子,从而抑制DNA酶的活性,防止PCR产物被降解。
10倍浓缩的TBE缓冲液配方如下。
Tris 108g EDTA 9.3g 硼酸 55g
将上述物质溶解后,用蒸馏水定容至1000mL,调节pH为8.0~8.2备用,使用时需稀释10倍。
2.影响DNA片段琼脂糖电泳的几个因素:
1.DNA分子的大小:
线性DNA分子的迁移率与其分子量的对数值成反比。
2.琼脂糖浓度:
一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率是不相同的。
相反,在一定浓度的琼脂糖凝胶中,不同大小的DNA片段的迁移率也是不同的。
若要有效地分离不同大小的DNA,应采用适当浓度的琼脂糖凝胶。
琼脂糖凝胶浓度
可分辨的线性DNA片段大小(kb)
0.4
5~60
0.7
0.8~10
1.0
0.4~6
1.5
0.2~4
1.75
0.2~3
2.0
0.1~3
3.DNA分子的形态:
在同一浓度的琼脂糖凝胶中,超螺旋DNA分子迁移率比线性DNA分子快,线性DNA分子比开环DNA分子快。
4.电流强度:
每厘米凝胶电压不超过5V,若电压过高分辨率会降低,只有在低电压时,线性DNA分子的电泳迁移率与所用电压成正比。
实验步骤
1.洗净电泳槽、制胶槽、梳子,晾干。
2.插好梳子。
3.实验所需凝胶的浓度通常为0.8-1%,依据所需配制的凝胶体积,称取一定量的琼脂糖,放入制胶的容器中(一般用三角瓶),然后加入适量的电泳缓冲液(1×TAE)。
4.将烧瓶置于电炉上,加热煮沸,使琼脂糖完全溶解。
5.关闭电炉,取下三角烧瓶,溶液冷至约60-70℃时(手握烧瓶可以耐受),在琼脂糖溶液中加入溴化乙锭至终浓度为0.5μg/ml,轻轻摇匀(避免剧烈摇晃产生气泡),倒入制胶槽内,检查有无气泡。
6.室温下约10-20分钟后,琼脂糖溶液完全凝固,小心垂直拔出梳子和挡板,清除碎胶,将凝胶放入电泳槽中。
7.加入电泳缓冲液(1×TAE)至电泳槽中,使液面高于胶面约1-2mm。
8.取PCR获得的DNA样品20µl,加入1/10体积的10×DNA上样缓冲液(10×loadingbuffer),混匀,稍甩一下,使溶液都处于离心管底。
9.用移液器轻轻吸起离心管中溶液,移入凝胶的梳孔中。
10.插上导线,打开电泳仪电源,按照需要调节电压(或电流),电泳开始,观察电泳槽中负极的铂金丝是否有气泡出现。
11.等溴酚蓝泳动至凝胶前沿后,将电压(或电流)回零,关闭电源,停止电泳。
12.取出凝胶,在紫外观测仪上观察电泳结果。
13.根据需要切下DNA条带,放入1.5ml离心管中,放入-20℃冷冻保存,以备以后的实验用。
思考题:
在进行琼脂糖电泳操作过程中,应注意采取哪些保护措施防止溴乙啶污染?
实验四从琼脂糖凝胶中回收(PCR产物)DNA片段
实验目的
了解DNA片段回收的原理,掌握用试剂盒回收DNA的方法。
实验原理
本实验所用的回收试剂盒的原理是在NaI存在的条件下,使含有DNA片段的凝胶融化,使DNA片段吸附于硅胶树脂上。
最后用TE缓冲液或灭菌水溶出DNA。
实验仪器、材料与试剂
(一)仪器
1.高速台式离心机
2.微量取液器
(二)材料
实验二切下的含有回收片段的琼脂糖凝胶
(三)试剂
除试剂盒所带外,余同实验二。
实验步骤
DNA回收操作流程
思考题:
琼脂糖凝胶中回收DNA产物操作过程中应特别注意哪些操作环节?
实验五DNA片段的连接(向质粒载体中插入外源DNA)
实验目的
了解DNA片段连接的原理,掌握DNA连接的方法。
实验原理
外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组,这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。
重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。
DNA连接酶有两种:
T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。
两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能,而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌连接酶没有的特性,即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。
但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低,一般可提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
DNA片段之间的连接主要是在DNA连接酶的作用下,使DNA裂口上核苷酸裸露的3'羟基和5'磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键,使原来断开的DNA裂口连接起来。
实验仪器、材料与试剂
(一)仪器
1.恒温水浴锅或恒温箱
2.微量取液器
(二)材料
实验四回收的DNA片段。
(三)试剂
试剂盒所带
实验步骤
1.含有质粒载体DNA(0.03pmol)及插入片段DNA(0.1~0.3pmol)的DNA溶液(TE缓冲液或去离子水),总体积为5~10µl。
2.加入与DNA溶液等量的SolutionI(5~10µl)混合均匀,﹛SolutionI溶液中含有连接酶和酶反应缓冲液﹜。
3.16℃*1连接反应30min*2(通常连接过夜效果较好)。
4.当直接进行转化时,取上述连接反应液10~20µl*3转化至100µl的感受态细胞。
*1如果反应温度升高(>26℃),较难形成环状DNA。
因此反应必须于16℃进行。
*2当连接反应难以进行时,可以适当延长反应时间。
当连接效率仍然无所改变时,应当对DNA进行精制后再反应。
*3连接反应液可以直接用于转化,如发现转化效率偏低时,反应结束后向反应液中添加NaCl使其终浓度为500mM,然后进行转化,可改善转化效率。
另外,当转化DNA量较大或者利用电刺激转化时,先用乙醇沉淀法精制DNA。
操作流程图
实验六大肠杆菌感受态的制备(CaCl2法)及活性检测
实验目的
学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。
实验原理
用于感受态细胞制备的大肠杆菌菌株一般是限制-修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
受体细胞经过一些特殊方法(如:
电击法,CaCl2等化学试剂法)处理后,细胞膜的通透性发生变化,成为能容许带有外源DNA的载体分子进入的感受态细胞。
实验仪器、材料与试剂
(一)仪器
1.恒温摇床
2.超净工作台
3.高压灭菌锅
4.低温离心机
5.微量取液器
(二)材料
大肠杆菌DH5α。
(三)试剂
1.LB液体培养基(1升/组)
胰蛋白胨10g
酵母提取物5g
NaCl10g
加去离子水至800ml
搅拌,使溶质完全溶解,用NaOH调节pH值至7.0,加入去离子水至总体积为1升,高压蒸汽灭菌20分钟。
LB固体培养基(1升/组)
在上述LB液体培养基(1升)中加入琼脂粉15g。
2.0.1mol/LCaCl2溶液,高压蒸汽灭菌。
实验步骤
1.挑取大肠杆菌DH5α的单菌落,接种于5mlLB液体培养基中,37℃振荡培养12h。
2.取2ml菌液加入50mlLB液体培养基中,扩大培养约2-3h;测OD600值,当OD600约0.4-0.5时,停止培养。
3.菌液放置在冰上30min,无菌条件下倒入50mlBeckman离心管中,4℃,3,500rpm离心5min。
4.弃上清,在冰浴上加入8ml预冷的无菌CaCl2(0.1mol/L),轻摇使细胞悬浮。
冰上放置15min。
5.4℃,3,500rpm离心5min。
6.弃上清,用1ml预冷的无菌CaCl2(0.1mol/L)重新悬浮细胞,200µl/份分装到预冷的无菌Eppendorf管中,4℃保存备用,在一周内转化率基本不降低;如加入15%的甘油,-70℃保存,可保存一年。
7.制备的大肠杆菌感受态的活性可通过实验七“质粒的转化”进行验证,转化效率高表明则表明制备的感受态活性高。
思考题:
在感受态制备过程中,影响感受态活性的主要因素有哪些?
实际操作过程中通常采取哪些措施避免这些不利影响?
实验七质粒转化
实验目的
了解细胞转化的概念及其在分子生物学上研究中的意义;学习外源DNA转化入受体菌细胞并筛选转化体的方法。
实验原理
转化这一概念来源于遗传学:
细菌细胞的生物学特性由于吸收外源DNA发生可遗传的改变叫转化。
转化是一个自然存在的过程。
细菌处于容易吸收外源DNA状态叫感受态。
用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。
重组DNA转化细菌的技术操作关键就是通过化学方法,人工诱导细胞进入一个敏感的感受状态,以便外源DNA进入细菌内。
目前,感受态的制备方法很多,如CaCl2法、Hanahan法、超级感受态法和电转化法,相比之下,CaCl2法操作简便,重现性好,转化率一般能达到5×106-2×107转化子/µg质粒DNA,可以满足大多数的实验要求,为人们广泛接受,很多尖端实验室仍然在使用。
这项技术始于Mandel和Higa1970年的观察,他们发现细菌经过冰冷的CaCl2溶液处理及短暂热休克后,容易被λ噬菌体DNA感染,随后Cohn于1972年进一步证明质粒DNA用同样的方法也能进入细菌,其原理是细菌处于0℃,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面,经42℃短时间热冲击处理,促进细胞吸收DNA复合物,进入细胞的DNA分子通过复制、表达,实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
将经转化后的细胞在选择性培养基中培养,即可筛选出转化体(transformant),即带有异源DNA分子的受体细胞。
实验仪器、材料与试剂
(一)仪器和器皿
1.恒温摇床
2.超净工作台
3.恒温水浴锅
4.恒温箱
5.微量取液器
6.高压灭菌锅
7.玻璃培养皿
(二)材料
1.实验五所得连接产物
2.实验六制备的大肠杆菌感受态细胞
(三)试剂
1.LB液体、固体培养基
2.氨苄青霉素(Amp)100mg/ml
实验步骤
1.取适量连接产物加到分装的感受态细胞中,混匀,冰浴30min;
2.42℃热激90s,迅速在冰浴中冷3-5min;
3.上述管中加入600µlLB液体培养基,于37℃振荡培养45min-1h;
4.菌液低速离心(3,500rpm离心2min)倒掉部分上清液,保留约200µl,重悬菌液。
5.取适量(100µl)菌液涂布LB平板(含Amp50µg/ml),室温涂布均匀后(至菌液完全被吸干),于37℃倒置,过夜培养过夜;
6.观察菌落,筛选阳性克隆(利用T-载体连接的可利用兰白斑筛选)。
LB平板:
加热融化LB固体培养基,冷却至60℃左右,按50µg/ml加入Amp,倒入灭菌的培养皿中,每50ml培养基可倒3个平皿。
思考题:
1、质粒转化的机理?
2、影响转化效果的主要因素有哪些?
实验八、九质粒(碱法)提取及重组质粒(重组子)的筛选和酶切检测
实验目的
了解碱法提取质粒的原理,掌握碱法提取质粒的方法。
实验原理
质粒是一种染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。
从大肠杆菌细胞中分离质粒DNA的方法众多,其分离的依据可利用分子大小不同,碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的特点来进行。
目前常用的有碱变性抽提法,羟基磷灰石柱层析法,质粒DNA释放法,酸酚法,两相法以及溴化乙锭-氯化铯密度梯度离心法。
以上各种方法均有利弊,有的难以控制;有的得率不高;有
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