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植物组织培养课程论文
植物组织培养
题目:
烟草的再生
姓名:
专业班级:
学号:
指导老师:
烟草的再生
前言:
植物组织培养是指用无菌方法使植物体的离体器官、组织和细胞在人为提供的条件下生长和发育的所有培养技术的总称,也称之为离体培养或试管培养。
植物体的每一个具有完整细胞核的细胞都具有该物种全部遗传的物质,在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力,这就是植物细胞的全能性,这也是植物组织培养的理论基础。
组织培养材料可分为①器官:
根、茎尖、叶、花、果实等;②组织:
形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等;③细胞:
大孢子、小孢子、体细胞;④原生质体。
因此按照组织培养的材料可将植物组织培养分为
(1)组织、器官或细胞培养:
指利用生物体各部分组织、器官或细胞进行离体培养,使之形成愈伤组织或完整有机体的技术。
(2)原生质体培样:
指将微生物或植物细胞游离成原生质体,在适宜培养条件下,依据细胞全能性使其再生细胞壁,并进行细胞分裂分化,形成完整个体的技术。
一个细胞一旦沿着某一条特定的途径分化发育后,一般不会再回复到未分化状态,但在组织培养条件下,可能发生脱分化和再分化。
脱分化是将已分化的不分裂的静止细胞,放在培养基上培养后,细胞重新进入分裂状态。
一个成熟的细胞转变为分生状态的过程。
再分化是脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可转变为各种不同的细胞类型,形成完整植株的过程。
植物组织培养具有①培养条件可以人为控制;②生长周期短,繁殖率高;③管理方便,利于工厂化生产和自动化控制等特点。
植物组织培养过程为:
一、实验目的:
1.了解学习组织培养的基本操作过程。
2.实践母液的配制、培养基的配制。
二、实验材料试剂和实验仪器
1.实验材料:
烟草的叶片
2.实验试剂:
MS培养基母液所需的各类药品,蔗糖,琼脂,1mol/L的NaOH,70%酒精,升汞溶液,蒸馏水,无菌水
3.实验仪器:
无菌操作台,锥形瓶,镊子,解剖刀,酒精灯,电子天平,烧杯,高压蒸汽灭菌锅,刀片,培养皿,量筒,培养箱,牛皮纸,玻璃棒,漏斗,灭菌后的滤纸,棉线,电炉,PH试纸,冰箱,塑料瓶,移液管,洗耳球
三、实验步骤
(一)MS培养基的配制
1.大量元素母液的配制
(1)大量元素母液配制的方法
无机盐中大量元素母液按照培养基配方的用量,用感量为0.01g的天平,分别用50mL烧杯称量,用蒸馏水溶解。
溶解后在200mL容量瓶中混合定溶至200mL。
在混合定溶时,必须按表中次序混合。
(2)大量元素母液配制的配方
成分
浓缩倍数
储备液浓度
(mg/L)
配1L培养基的用量
共配的量
(ml)
称量的量
(g)
NH4NO3
50
33000
20
200
16.5
KNO3
38000
19
MgSO4·7H2O
7400
3.7
KH2PO4
3400
1.7
(3)大量元素母液配制的技巧
在配制大量元素无机盐母液时,要防止在混合各种盐类时产生沉淀,各种药品必须在充分溶解后才能混合在混合各种无机盐时,其稀释度要大,慢慢地混合,同时边混合边搅拌。
另外,在拿取药品时,注意不要拿错药品,如将KH2PO4错拿成K2HPO4。
2.微量元素母液的配制
(1)微量元素母液配制的方法
无机盐中微量元素母液按照培养基配方用量,用感量为0.0001g的电子天平,分别用50mL烧杯称量,用蒸馏水(或重蒸水)溶解,也可用酒精灯缓缓加热,以加快溶解速度。
全部溶解后,按表混合定溶于100mL容量瓶中保存于5-8℃冰箱中备用。
(2)微量元素母液配制的配方
成分
浓缩倍数
储备液浓度
(mg/L)
配1L培养基的用量
共配的量
(ml)
称量的量
(g)
KI
200
166
5
100
0.0166
H3BO3
1240
0.124
MnSO4·4H2O
4460
0.446
ZnSO4·7H2O
1720
0.172
Na2MoO4·2H2O
50
0.005
CuSO4·5H2O
5
0.0005
CoCl2·6H2O
5
0.0005
(3)微量元素母液配制的技巧
在配制微量元素混合母液时也要注意药品的添加顺序,以免产生沉淀。
由于微量元素过多会产生毒性,所以必须严格按照用量添加,切不可算错添加倍数或是称量时看错小数点位数。
否则极易造成实验的失败。
3.铁盐母液的配制
(1)铁盐母液配制的方法
是用天平称取0.556g硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)和0.746g乙二胺四乙酸二钠(Na2.EDTA.2H2O),分别加入蒸馏水加热搅拌使之溶解,将两种溶液混合定溶至100ml,在常温下保存。
配制MS培养基时,每升培养基取铁盐母液5mL。
(2)铁盐母液配制的配方
成分
浓缩倍数
储备液浓度
(mg/L)
配1L培养基的用量
共配的量
(ml)
称量的量
(g)
FeSO4•7H2O
200
5560
5
100
0.556
Na2.EDTA.2H2O
7460
0.746
(3)铁盐母液配制的技巧
铁盐必须单独配制,因为与其他母液混合容易产生沉淀,在培养基中,采用螯合铁的形式配制,即硫酸亚铁和Na2-EDTA的混合物,在pH值7.6~8.0时也可保证铁的供应源。
4.植物激素和其他母液配制
(1)植物激素和其他母液配制的方法
激素类、维生素类以及用量较小的有机物类,为了使用方便和准确,也应配制成母液。
母液浓度应根据配方的需要量灵活确定,经常应用的浓度一般为0.2-2mg/mL,但如肌醇等用量较大时,可配成10-20mg/mL浓度的母液。
这类化合物必须用0.0001g的电子分析天平称量。
(2)植物激素和其他母液配制的配方
成分
浓缩倍数
储备液浓度
(mg/L)
配1L培养基的用量
共配的量
(ml)
称量的量
(g)
肌醇
200
20000
5
100
2
盐酸
100
0.01
盐酸吡哆醇
100
0.01
盐酸硫胺素
20
0.002
甘氨酸
400
0.04
(3)植物激素和其他母液配制的技巧
植物激素过多或过少都不易于植物生长,所以必须严格按照用量添加,切不可算错添加倍数或是称量时看错小数点位数。
否则极易造成实验的失败。
5.CaCl2母液的配制
(1)CaCl2母液配制的方法
将称量好的CaCl2溶于蒸馏水中,定容至100ml。
(2)CaCl2母液配制的配方
成分
浓缩倍数
储备液浓度
(mg/L)
配1L培养基的用量
共配的量
(ml)
称量的量
(g)
CaCl2
50
8800
20
200
3.32244
6.母液的保存:
配制好的母液应分别贴上标签,注明母液号、配制倍数、日期及配1L培养基时应取的量。
母液最好在2℃~4℃的冰箱中贮存,特别是激素与有机类物质要求较严。
贮存时间不宜过长,无机盐母液最好在一个月内用完。
如发现有霉菌和沉淀产生,就不能再使用。
7.培养基配制前准备工作
(1)将贮藏的母液按顺序排好
(2)将各种玻璃器皿、量筒、烧杯、吸管、玻璃棒、漏斗等放在指定的位置
(3)称好所需的琼脂、蔗糖,准备好蒸馏水及作盖瓶用的棉塞、包纸、橡皮筋等
7.MS培养基配制过程
按照比例向1000ml烧杯中添加四种母液,加入30g蔗糖,充分溶解,用蒸馏水定容到1000ml,调节溶液PH至5.8-6.0,分装至150ml小锥形瓶中,每瓶装50ml,并加入0.5g琼脂条,用牛皮纸和棉线封口。
将封口后的锥形瓶做好标记,同时准备滤纸,空的锥形瓶,以及在500ml锥形瓶中加入蒸馏水,一起置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌。
水、药、糖、琼脂→混合→加热溶解→调pH
↓分装
玻璃器皿→加棉塞→高压灭菌→冷却→凝固→接种
8.培养基的保存
灭菌后的培养基经冷却和凝固后即可使用检验灭菌效果。
检验方法:
将培养基置于培养室中3天,若没有污染现象,说明灭菌可靠,可以使用。
保存在低温条件下。
常温下保存时要进行防尘和避光处理。
保存时间不可过长。
(二)初代培养的接种
1.前期准备
(1)接种室消毒:
每次接种前应进行地面的清洁卫生工作,并用70%酒精喷雾使空气的灰尘沉降,并用紫外线灯照射20min。
接种前工作台面要用新洁尔灭或酒精擦洗,使用超净工作台对接种环境污染的控制更有成效。
但它应置放在洁净的房间,窗户密封,并定期清洗过滤膜,以延长使用寿命。
(2)材料采集:
采集新鲜幼嫩的烟草叶片
2.无菌操作的要求
(1)接种时要防止交叉污染的发生,在无菌滤纸上切取材料
(2)刀和镊子等接种工具使用一次应放入70%(或95%)酒精中浸泡,然后灼烧放凉备用
2.材料消毒和准备
将叶片用消毒冷却后的镊子夹起至装有70%酒精的锥形瓶中浸泡5秒钟,然后用0.1%升汞溶液浸泡4min,消毒后用无菌水漂洗3次。
将消毒后的叶片置于无菌滤纸上,吸干水分,将镊子和解剖刀置于酒精灯上加热灭菌,冷却后用解剖刀将叶片边缘和两端以及主脉切去,留下叶肉,后将剩下的叶片切成0.5cm2左右大小的外植体备用。
3.接种
左手拿装有培养基的锥形瓶底部,右手轻轻取下包头纸,将牛皮纸正立在桌面上,锥形瓶的瓶口靠近酒精灯火焰,瓶口倾斜,以免空气中的微生物落入瓶中。
然后用灼烧后冷却的镊子将外植体移入瓶中,叶片背面与培养基接触,轻轻按压使植物能紧贴培养基,材料在培养容器内的分布要均匀,以保证必要的营养面积和光照条件。
镊子使用后放回消毒酒精中,将瓶口在火焰上旋转灼烧数秒钟,后包扎好瓶口,作好标记。
(4)定期观察并拍照
定期观察烟草的叶片的生长状况,及时记录并拍照,并移走霉变的锥形瓶。
四、实验结果
(一)初代培养接种四天后
分析:
锥形瓶中叶片四周上翘,叶片厚度变厚,但是有部分组织有变白透明现象。
(二)初代培养接种19天后
五、实验分析与讨论
在这次烟草的初代培养实验中,我接种的三个锥形瓶中都成功长出了愈伤组织,且没有出现霉变现象。
在实验后第四天的观察中,我观察到虽然叶片的四周上卷,但是却也出现了部分透明现象,我推断,是由于在叶片消毒时,镊子夹取时太用力,刺伤了原本就脆弱的烟草幼叶,致使部分组织损伤,故出现透明现象。
在实验后第19天我观察到,叶片已经完全卷曲起来,面积和体积也增加不少。
长势良好,且接种时切的比较大的叶片长势更好。
其他的组织块虽然长势较慢,但是不影响实验结果。
六、实验注意事项
1.在配制母液时,应正确计算,小心称量,避免某些物质添加过多或过少,影响组织生长。
2.加入母液或生长调节物质时,应事先检查这些药品是否已变色或产生沉淀
3.先在量筒或烧杯内放一定量的水,以免加入药液时溅出。
再按母液顺序,根据母液的不同倍数量取规定的量。
4.注意调pH值:
调到5.8.一般用1mol/LNaOH和1mol/LHCl调节
5.分装一般以占试管、三角烧瓶等培养容器的1/4-1/3左右为宜,分装时要注意不要将培养基沾到管壁上,以免引起污染,分装后立即塞上棉塞或加上盖子,有不同的处理还要及时做好标记。
7灭菌时不能仅仅只灭培养基,而要灭上无菌水,空瓶,滤纸,培养皿等公用仪器和材料。
6.由于琼脂条是后加入锥形瓶中,故灭菌后应将培养基摇匀。
7.在接种过程中应该严格遵循无菌操作,避免杂菌污染,出现培养基内发霉等情况。
8.在接种过程中应该严格控制叶片在升汞和酒精中停留的时间。
9.应该选取较为强壮的叶片作为实验材料,且叶子不要过早摘下,以免干掉。
10.实验中一定要注意安全,尤其是点酒精灯时,手应放在酒精灯后方,以免烧到手上的酒精,造成不必要的伤害。
11.无菌水应及时更换,点酒精灯时应观察酒精灯内酒精的余量,防止酒精灯烧干。
12.接种时应该头脑清醒,胆大心细。
13.接种时用镊子夹取要轻柔,防止破坏组织。
六、参考文献
[1]李浚明,朱登云.植物组织培养教程[M].北京:
中国农业大学出版社,2005:
313-316.
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