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家蚕生物反应器平台姓名.docx
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家蚕生物反应器平台姓名
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以家蚕作为生物反应器,利用分子生物学手段,构建了系统的家蚕杆状病毒高效表达药用外源蛋白体系,建立了全方位的具有自主知识产权的生物医药产业化平台。
我们在国际上首次克隆家蚕杆状病毒〔BmNPV〕的P10基因并证明P10启动子也是强启动子,具备作为表达载体启动子的功能特点,首次利用BmNPVP10启动子在家蚕细胞中表达了氯霉素乙酰基转移酶。
成功构建重组可救活线性化家蚕核多角体病毒基因工程载体,选择效率提高1000倍,时刻缩短10倍;成功构建半胱氨酸蛋白缺失型家蚕核多角体病毒基因工程载体,表达效率提高40%。
通过构建一系列的新型重组病毒和表达载体,形成全新的家蚕生物反应器技术平台。
此后,以家蚕生物反应器技术平台生产口服疫苗和药物为研究特色,建立了家蚕生物反应器生物制药技术平台和家蚕功能基因组研究技术平台,要紧致力于应用基因工程技术和生化下游技术制备药物及疫苗,探究基因工程药物〔疫苗〕口服途径及其产业化,同时开展家蚕功能基因组学的研究,探究家蚕生长发育中的基因调控机制。
在国内外学术刊物上发表研究论文170余篇,其中被SCI收录40余篇,编写专著6本;完成科研项目26项,其中国家级13项,省部级10项,在研项目4项;获得国家发明专利14项,公布国家发明专利5项;在国际学术刊物上发表研究论文37篇;申请国家发明专利17项,获得国家发明专利7项。
在家蚕生物反应器生产口服药物和疫苗的研究、家蚕功能基因组学和蛋白质组学以及家蚕RNA相关研究中都取得了新的突破。
平台具体内容、研究成果:
一、家蚕生物反应器生产口服蛋白质药物技术平台体系的构建
通过一系列的新型基因工程载体的构建,成功建立家蚕生物反应器蛋白表达技术平台。
家蚕生物反应器表达的产物经证实能够直截了当用于口服药物的开发,目前差不多证明家蚕表达生产的药物由于有蚕血淋巴本身的大量蛋白的爱护作用和一些未知的机理,直截了当经口服给药而进入血液循环。
这类药物既能够免去药物的分离纯化过程,又可解除病人注射的痛楚和被感染的危险。
(1)家蚕生物反应器蛋白高效表达技术平台的构建
国际上首次克隆并测序家蚕杆状病毒〔BmNPV〕的P10基因〔GenBank登录号为S76783〕,并证明P10启动子也是强启动子,具备作为表达载体启动子的功能特点,此后,首次利用P10启动子在家蚕细胞中表达了氯霉素乙酰基转移酶;通过野生型家蚕核多角体病毒中国镇江株BmNPVZJ8基因组与修饰型苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒AcNPVBacPAK6基因组在家蚕细胞内同源重组,构建成重组救活可线性化修饰型家蚕核多角体病毒基因工程载体BmBacPAK6。
BmBacPAK6含有LacZ基因和两个Bsu36I酶切位点用于线性化。
BmBacPAK6用作外源基因表达重组救活病毒筛出率几近100%。
BmBacPAK6用作载体表达人EPO基因,感染家蚕虫体和家蚕蛹时,EPO表达量达7.4×104U/ml血淋巴;在此基础上,成功构建半胱氨酸蛋白酶缺失型BmNPV基因工程载体,通过一种半胱氨酸蛋白酶基因缺失型家蚕核多角体病毒BmZJCP基因组DNA和构建的转移载体pCP-GFP与上述BmBacPAK6共转染家蚕细胞,经细胞内同源重组获得。
此半胱氨酸蛋白酶缺失型病毒感染的家蚕细胞中,外源基因表达量比对比高约40%,宿主存活期及产物高表达期延长,从而提高总表达量。
通过构建一系列的新型重组病毒和新型表达载体,形成全新的家蚕生物反应器蛋白高效表达技术平台。
(2)口服有效的rhGM-CSF蛋白药物的制备及其生白成效
至今,有专门多的外源蛋白在家蚕细胞和幼虫中得到表达,但作为生物反应器,家蚕蛹可能更加适合表达外源目的基因。
我们通过重组家蚕杆状病毒在家蚕蛹中成功表达了人粒细胞-巨细胞激落刺激因子〔hGM-CSF〕。
表达的重组蛋白rhGM-CSF分子量为29kDa,等电点5.1,脱糖基化分析说明和大肠杆菌表达rhGM-CSF相比,家蚕蛹表达rhGM-CSF通过了糖基化后修饰,同时还可能通过了其他的翻译后修饰。
重组家蚕蛹蛋白粗提物中rhGM-CSF比活达到6.8×106cfumg-1,经纯化我们得到比活大于8.4×106cfumg-1的重组蛋白。
本研究说明家蚕蛹能够作为一种方便的低成本的生物反应器用于外源基因的表达。
相关研究成果发表在J.Biotechnol.上。
我们通过家蚕蛹生物反应器高效表达了rhGM-CSF,为了进一步研究家蚕蛹所表达的rhGM-CSF药效功能,从家蚕蛹中大规模纯化重组蛋白成为一个较大的挑战。
我们建立了两个大量纯化重组蛋白的方法:
分别采纳硫酸铵分级沉淀和等电点沉淀法得到重组蛋白的初步纯化产物,然后再结合凝胶过滤和离子交换色谱法得到纯化的蛋白。
研究说明,采纳等电点沉淀法可能更加有效,通过这种方法,我们从1000g接种感染的蚕蛹中纯化得到95%纯度的重组蛋白11.7mg,其比活高达9.0×106cfumg-1。
和其他方法相比,该方法纯化蛋白的得率提高了大约40%。
相关研究成果发表在Appl.Biochem.Biotech.上。
家蚕生物反应器表达的rhGM-CSF为29kDa糖蛋白〔BmrhGM-CSF〕。
生物活性检测说明,BmrhGM-CSF具有刺激人骨髓细胞形成集落的能力,集落形成成效和BmrhGM-CSF成剂量依靠关系,和γ射线的照耀的浓度呈负相关。
动物试验说明,口服BmrhGM-CSF15分钟后,能够在老鼠的血液中检测到20kDa125I标记的BmrhGM-CSF蛋白片段。
免疫组化试验显示能够在老鼠肠的组织细胞中检测到BmrhGM-CSF。
这些结果说明BmrhGM-CSF可能通过动物肠微绒毛被吸取到动物血液中。
动物药理学试验进一步证实:
〔1〕BmrhGM-CSF能提高白细胞减少症小鼠脾脏的CFU-S形成能力和骨髓细胞中DNA合成能力;〔2〕BmrhGM-CSF能显著诱导恒河猴和狗骨髓粒细胞和核细胞的生长,口服BmrhGM-CSF9天后,动物的白细胞水平显著提高,且呈剂量依靠关系。
高剂量组狗的白细胞水平达到1.5×109cells/L,远远高于阴性对比组的狗。
同时骨髓涂片试验说明,口服BmrhGM-CSF动物的白细胞中肌胚细胞和前颗粒性细胞所占百分比远远高于阴性对比组动物。
以上结果说明家蚕生物反应器生产的29kDaBmrhGM-CSF作为具有生物活性的细胞因子能够通过口服产生成效,这为蛋白口服药物的研制开创了一条新的途径。
研制hGM-CSF胶囊〔瑞福康〕,经国家新药评审中心评审同意进入临床试验〔临床批件号:
2003L02511〕,〝蚕表达基因工程生白细胞药物的方法〞已获得国家发明专利〔专利号:
ZL98124614.1〕,相关研究成果发表在Eur.J.Pharm.Sci.上。
为了研究家蚕生物反应器表达的BmrhGM-CSF在人体内的口服吸取利用度,我们以每100mg蚕蛹粉中含12µg的BmrhGM-CSF制成胶囊,依照双处理、双周期、两序列的随机交叉试验设计方法,选择21例理想者,口服BmrhGM-CSF8µg/kg或皮下注射大肠杆菌表达的rhGM-CSF3.75µg/kg,给药后按0、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、12.0h自臂静脉取血,ELISA法测定血液中hGM-CSF浓度,结果说明19人口服BmrhGM-CSF后,有15人血液中检测到与正常血浆有显著差异的血药浓度,用梯形面积法运算药时曲线下面积AUC,依照试验品的AUC与参比品的AUC比值运算相对生物利用度F值,BmrhGM-CSF经口服后在人体中平均生物利用度为0.605%,在15人中有效吸取的平均生物利用度为0.959%,最高为3.097%。
受试者的血浆经质谱分析找到了来自hGM-CSF的相关片段的序列,序列最大分子量达到7336Da,最小达到2039Da,说明BmrhGM-CSF通过口服能被人体吸取。
5个剂量组27名受试者单次口服150~900μg的rhGM-CSF胶囊的一样检查、血生化、血液学、尿液和心电图检查结果用药前后均无具临床意义的改变,无药物不良反应发生。
18例恶性肿瘤患者在化疗终止24小时后开始口服BmrhGM-CSF胶囊相对安慰剂组能明显减慢或阻止白细胞下降。
30例同意放、化疗患者口服BmrhGM-CSF胶囊,5天内使白细胞复原到4×109/L上,总有效率达90%,说明经吸取的BmrhGM-CSF在人体内具有活性、具有升高白细胞的功能。
相关研究成果拟发表在PLoSOne。
(3)糖尿病基因工程口服疫苗的制备及其对I型糖尿病的治疗研究
由于家蚕生物反应器表达蛋白进行翻译后修饰,其表达产物生物活性能够和天然蛋白相比美,我们开展了口服家蚕表达霍乱毒素B亚基〔CTB〕与胰岛素融合蛋白对治疗自身免疫性糖尿病的研究。
I型糖尿病由胰岛素分泌缺陷产生,它是一种针对胰岛β细胞的自身免疫性疫病。
动物实验说明通过口服一种自身抗原,如胰岛素或GAD,即诱导了免疫耐受,产生了爱护作用,进而抑制糖尿病的发生。
口服疾病特异性自身抗原能诱导口服免疫耐受,并能有效延缓或抑制自身免疫性疾病症状的发生。
在体内成功诱导免疫耐受需要长期口服大量的蛋白抗原,CTB可作为诱导口服耐受的强大粘膜运载系统,自身抗原通过与CTB蛋白偶联可极大地较少口服自身抗原的剂量。
这些都暗示CTB偶联自身抗原不仅使口服耐受防治
型糖尿病等自身免疫性疫病更具有实际应用价值,而且还有潜在的治疗前景。
因此,在本研究中我们构建了CTB与人胰岛素融合基因〔CTB-INS〕,并在家蚕中得到高效表达,融合蛋白〔20kDa〕在家蚕幼虫的蚕血淋巴中表达量达到0.3mg/ml。
经检测,该融合蛋白在家蚕中以五聚体形式存在,同时保持GM1神经节苷脂的受体结合特性以及CTB和胰岛素的抗原性。
非肥胖性糖尿病〔NOD〕小鼠经口服含微克级的CTB与胰岛素融合蛋白的蚕血淋巴,病理组织切片实验说明胰岛发炎程度显著减轻。
适时监测血糖的实验结果亦说明糖尿病的病理症状得到明显延缓,过继转移实验亦说明口服该融合蛋白产生了潜在的调剂性T细胞从而抑制糖尿病的发生。
这些结果说明家蚕生物反应器是一个合适的生产口服疫苗系统,并通过该系统诱导针对T细胞介导的自身免疫疾病的免疫耐受,该研究是利用我国自身蚕业资源优势研制抗I型糖尿病口服疫苗,为I型糖尿病的治疗开创了新的途径。
相关研究成果发表在J.Biotechnol.和J.Biochem.Mol.Biol.上。
为了提高融合基因CTB-INS在家蚕杆状病毒表达系统中的表达水平,我们同时开展了部分多角体同源序列对外源基因在杆状病毒表达系统中表达的阻碍分析。
本研究在融合基因CTB-INS的5’端融合了部分来自多角体基因的5’非编码区〔ATAAAT〕和编码区〔ATGCCGAAT〕共15bp的核酸序列,因此与原CTB-INS融合蛋白相比,通过修饰的融合蛋白〔mCTB-INS〕在其N末端增加了两个氨基酸Pro-Asn。
我们将新的融合蛋白mCTB-INS在家蚕细胞和幼虫中分别表达,结果发觉由于融合了部分多角体同源序列〔PPHS〕,新的蛋白的表达量与原CTB-INS蛋白相比提高了近4倍。
进一步分析得知,新蛋白N端增加的两个氨基酸并未显著阻碍其与神经节苷脂〔GM1〕的结合能力。
因此,本实验中所使用的15bp多角体同源序列可被用作为一个结构元件,在多角体启动子下游促进外源基因的高效表达。
相关研究成果发表在Biotech.Appl.Biochem.上。
我们同时关注口服家蚕表达CTB与胰岛素B链融合蛋白对治疗糖尿病的成效。
胰岛素B链包含了胰岛素的要紧抗原决定族,仅仅口服胰岛素B链在动物模型中同样能抑制糖尿病的发生,其成效与口服胰岛素完整蛋白相近。
经检测,我们构建的CTB与人胰岛素B链融合蛋白在家蚕中以五聚体形式存在,同时保持GM1神经节苷脂的受体结合特性以及CTB的抗原性。
非肥胖性糖尿病小鼠经口服含微克级的CTB与胰岛素B链融合蛋白的蚕血淋巴,病理组织切片实验说明小鼠胰岛发炎程度显著减轻。
同时适时监测血糖的实验结果亦说明口服中剂量的融合蛋白能延缓糖尿病的病理症状的发生。
本研究说明口服家蚕表达的CTB与人胰岛素B链融合蛋白能够作为一种口服蛋白疫苗,并对NOD模型鼠的胰岛炎症具有专门好的抑制作用。
相关研究成果发表在Vaccine上。
(4)家蚕生物反应器生产其他口服药物和疫苗的研究
我们同时还开展了其他许多重要药用蛋白和疫苗的表达和口服研究工作。
〔i〕家蚕表达SARS基因制备抗SARS病毒口服疫苗的研究
我们获得了SARS病毒基因组中与致病性相关的假设干个基因,经测序鉴定正确后克隆至重组转移载体pBacPAK8中,与线性化的杆状病毒共转染家蚕培养细胞,经重组病毒筛,获得高效表达重组杆状病毒。
在将表达的几种SARS基因疫苗注入实验小鼠体内后,成功地在实验小鼠体内检测到了非典〔抗SARS病毒〕抗体,而非接种组均无抗体反应。
相关研究成果发表在ActaBiochim.Biophys.Sin.上。
〔ii〕家蚕表达人乳铁蛋白生产口服治疗溃疡性结肠炎药物研究
我们获得了在蚕体中能高效表达人乳铁蛋白〔hLf〕基因的重组家蚕杆状病毒,在家蚕中表达量高达192μg/ml蚕血淋巴。
动物实验采纳葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠急性结肠炎模型,受实验动物举荐剂量为80μg/次/kg体重。
采取灌喂法,连续给药10天后,测定各项指标。
空白对比组每日灌喂等量蒸馏水。
结果说明利用重组hLf治疗溃疡性结肠炎,反映临床表现的DAI和组织学得到改善,髓过氧化物酶〔MPO〕明显降低,有效的缓解硫酸葡聚糖钠〔DSS〕诱导的溃疡性急性结肠炎,为进一步进入临床,生产口服治疗溃疡性结肠炎药物打下理论基础。
相关研究成果发表在J.Biotechnol.和ActaBiochim.Biophys.Sin.上。
〔iii〕家蚕表达人破骨细胞形成抑制因子生产口服治疗高血钙、骨质疏松症药物的研究
我们获得了在家蚕中能高效表达破骨细胞形成抑制因子OPG及变体OPG-372的重组杆状病毒病毒,并发觉rh-OPG在家蚕幼虫的表达产物还有二聚体的形式。
将含rh-OPG-372的家蚕血淋巴注射到小鼠腹腔,结果说明,家蚕杆状病毒表达系统表达出的重组人OPG-372蛋白具有良好的降血钙生物活性,0.75mg/kgrh-OPG-372就能显著地降低小鼠体内Ca2+,并呈剂量依靠关系,6mg/kgrh-OPG-372的降钙成效几乎与鲑鱼降钙素〔sCT〕相当。
对小鼠每天腹腔注射一次含重组蛋白的蚕血淋巴。
一个月后在股骨远端骨松质观看到骨小梁纵切面面积明显增加,说明重组蛋白具有较好的生物活性。
通过灌胃的方式,对小鼠进行了降血钙和骨爱护的口服研究。
结果说明,通过口服方式,一定剂量的重组蛋白也能有效的降低小鼠的血清钙离子浓度。
尽管剂量要求比注射方式要重些,但从时刻来看,成效比后者连续的更久些。
我们将雌性小鼠的卵巢切割,模拟妇女绝经后雌激素分泌下降导致的骨质疏松,将含重组蛋白OPG的蚕血淋巴对小鼠进行灌胃,实验结果说明重组蛋白能有效的阻止因雌激素缺失导致的骨流失。
以上结果说明,家蚕杆状病毒表达系统表达的OPG具有潜在预防和治疗高血钙、骨质疏松等骨相关疾病的功能。
其临床应用和产业化生产还有待于进一步的研究。
相关研究成果发表在ActaBiochim.Biophys.Sin.和Mol.Biotechnol.上。
〔iv〕家蚕表达鸡传染性法氏囊病毒VP2基因生产抗鸡传染性法氏囊病口服疫苗
通过RT-PCR技术,获得了鸡传染性法氏囊病毒〔IBDV〕的VP2基因,并用家蚕表达IBDV的抗原决定族基因制成口服基因工程疫苗,已申请国家发明专利〔公布号为CN1300850A〕,并获得农业部中试开释批件〔农基安审字〔2004〕第018号〕。
相关研究成果发表在AvianDis.和ActaBiochim.Biophys.Sin.上。
〔v〕人EGF基因的表达与治疗胃溃疡的研究
我们通过家蚕生物反应器大量表达人表皮生长因子hEGF蛋白,通过和多角体蛋白融合,在多角体启动子的启动下在家蚕细胞BmN,幼虫和蛹中被高效表达。
ELISA检测说明在家蚕幼虫和蛹中,感染重组病毒后第四天hEGF蛋白表达量达到最大。
表达重组蛋白的细胞粗提物和感染重组病毒的家蚕幼虫血淋巴都能有效地促进Balb/c3T3细胞的分化。
动物试验说明,感染重组病毒和野生病毒的家蚕蛹都能爱护小鼠胃粘膜防止酒精诱导的胃损害。
什么缘故野生病毒感染的家蚕蛹也能发挥爱护作用?
尽管其成效和重组病毒相比较差,其机制还有待于进一步研究。
相关研究成果发表在AfricanJ.Biotechnol.上。
〔vi〕人促红细胞生成素(rhEPO)口服剂型研究
获得在家蚕中能高效表达了的hEPO基因的重组家蚕杆状病毒,在家蚕中表达量高达5.16×105单位/蚕,蛹中表达量为2.01×106单位/蛹。
通过低温冷冻干燥及剂型的研制,研制了rhEPO胶囊(康血宝)。
〝用家蚕表达重组人促红细胞生成素制备药物的方法〞已获得国家发明专利〔专利号:
ZL98124616.8〕。
〔vii〕蚕表达丙肝抗原制备治疗和抗丙型肝炎口服药物的研究
用蚕表达的丙型肝炎〔HCV〕的C+E1基因产物,每头蚕可表达0.5mg,能够应用HCV抗体的检测,用蚕表达的HCV的C+E1基因产物,通过剂型研制,进行动物口服试验,通过三百只老鼠的试验,口服组的HCV抗体阳性率超过到95%以上,为口服疫苗的研制提供依据。
〝用蚕表达丙肝抗原制备口服药物的方法〞已获得国家发明专利〔专利号:
ZL98124615.8〕。
二、家蚕杆状病毒表面展现技术平台体系的构建与安全有效的人用禽流感疫苗的快速制备
(1)家蚕杆状病毒表面展现技术平台体系的建立
家蚕杆状病毒gp64蛋白N端为信号肽序列,近C端为跨膜结构域,外源蛋白在信号肽的C端与跨膜结构域N端之间发生融合,融合蛋白通过真核细胞内质网加工后,信号肽被切除,形成的N端融合蛋白可稳固地展现于杆状病毒的表面,形成刺猬状〝伪病毒〞。
我们构建融合了家蚕囊膜蛋白gp64蛋白N端信号肽和近C端跨膜结构域的转移载体,能够方便的将目的基因和gp64信号肽与跨膜域融合,融合基因能够成功在杆状病毒中表达并展现在杆状病毒的囊膜表面,形成一个带外源病毒抗原的伪病毒,该伪病毒具有外源病毒的抗原性,能够作为基因工程疫苗,安全性高。
同时,杆状病毒表面展现系统能够完成翻译后蛋白质的加工修饰,使外源产物具有较高生物学活性。
(2)安全有效的人用禽流感疫苗快速制备生产工艺的建立
运用杆状病毒表面展现技术构建表达H5N1型人禽流感病毒HA蛋白的重组杆状病毒Bmgp64HA,以家蚕蛹作为生物反应器生产重组杆状病毒,并以此重组杆状病毒作为人用禽流感疫苗,同时建立人用禽流感疫苗的生产工艺。
人工合成含有杆状病毒gp64信号肽、跨膜区与A/Zhejiang/16/06(H5N1)毒株的HA基因的融合基因,构建重组转移载体pBacPAK-gp64-HA,与线性化的野生型杆状病毒BacPAK6共转染家蚕BmN细胞,通过多轮选择,获得表达HA蛋白的重组杆状病毒Bmgp64HA。
重组杆状病毒接种家蚕蛹,建立以家蚕蛹为生物反应器生产重组疫苗的生产工艺。
将重组杆状病毒接种蚕蛹后5-6天收成蚕蛹,通过多步离心、超速离心、区带离心、超滤等方法收成重组杆状病毒。
每100g蚕蛹生产重组杆状病毒8-16mg。
(3)重组人用禽流感疫苗临床前的有效性评判
每组14只的BALB/C小鼠按高中低剂量组分别以150μg/kg体重,30μg/kg体重,6μg/kg体重免疫总体积1ml的禽流感疫苗,免疫3次,每次间隔2周,抗体效价达到最高峰时攻毒,观看疫苗的免疫爱护成效。
重组疫苗对小鼠具有较好的安全性。
病毒分离、RT-PCR结果显示重组疫苗可能有抵御病毒攻击的作用。
模拟临床途径将重组疫苗分高、中、低剂量〔480μg/kg体重、160μg/kg体重、53μg/kg体重〕进行免疫恒河猴,每组4只,当抗体效价达到1:
100时用A/tiger/harbin/(01)/2002(H5N1)毒株进行攻毒。
免疫及攻毒后,各组试验动物的血生化、血常规指标均在正常范畴内。
免疫后动物未显现专门的临床表现,提示疫苗具有较好的安全性。
攻毒后第2天高、中、低剂量组分别有2、1、1只动物中和抗体达到1:
4,攻毒后第5天高、低剂量组各有1只动物中和抗体达到1:
4,攻毒后第7天高、中、低剂量组分别有4、2、1只动物中和抗体达到1:
8,攻毒后第14天高、中、低剂量组分别有2、1、1只动物中和抗体达到1:
16。
病毒接种后第2天,中剂量组各有1只动物的咽拭子为阳性,高、低剂量组未分离出病毒,模型对比组均为阳性,第5、7、14天的咽拭子均未分离出病毒。
病毒接种后第7天,低剂量组和模型对比组各有1只动物的肺组织中分离出病毒。
14天时肺组织的病毒分离结果均为阴性。
试验结果说明疫苗组的高、中剂量组有抵御病毒攻击的作用。
(4)重组人用禽流感疫苗临床前的安全性评判
〔a〕禽流感疫苗对精神神经系统的阻碍
小鼠一样行为、自主活动和阈下催眠剂量戊巴比妥钠协同试验和小鼠旋转和谐机能试验结果显示:
小鼠经皮下注射给予禽流感疫苗16、8、4mg/kg和溶媒5ml/kg剂量,对小鼠精神神经系统无明显阻碍。
〔b〕禽流感疫苗对心血管、呼吸系统及体温的阻碍
猴心血管及呼吸系统试验说明:
猴分别皮下注射给予禽流感疫苗3.2、1.6、0.8mg/kg和溶媒1ml/kg剂量,对猴心血管系统和呼吸系统的各项指标均无明显阻碍,其血压、呼吸频率、呼吸幅度和心电各指标均与给药前相似〔P>0.05〕;对猴体温也无明显阻碍,其各测量时刻段的平均体温与给药前相似〔P>0.05〕,也与相应时刻对比组相似〔P>0.05〕。
在本试验剂量条件下,批号为20061207的禽流感疫苗对小鼠精神神经系统无明显阻碍。
对猴心血管系统、呼吸系统和体温也无明显阻碍。
〔c〕禽流感疫苗大鼠、小鼠急性毒性试验
健康清洁级SD大鼠和ICR小鼠分别单次皮下注射〔sc〕给予禽流感疫苗94mg/kg和141mg/kg剂量,要紧的毒副反应为注射部位显现直径为0.1~0.3cm颗粒状硬块。
对大鼠、小鼠皮下注射的最大耐受剂量分别为:
大鼠>94mg/kg〔相当于人临床拟用剂量的18800倍、大鼠有效剂量的250倍〕;小鼠>141mg/kg〔相当于人临床拟用剂量的28200倍、小鼠等效剂量的263倍〕。
〔d〕禽流感疫苗猴长期毒性试验
食蟹猴连续8次〔每10天给药1次〕分别皮下注射给予禽流感疫苗3.2、1.6、0.8mg/〔kg·次〕、溶媒对比和0.9%NaCl注射液1ml/〔kg·次〕剂量,其中禽流感疫苗三个剂量组和溶媒对比组对注射部位有一定的专门作用。
安全无毒剂量大于3.2mg/kg。
禽流感疫苗在高达人临床拟用剂量640倍的剂量下对猴的要紧毒性反应仅表现为注射部位结痂、红斑等损害。
〔e〕禽流感疫苗大鼠长期毒性试验
SD大鼠连续八次皮下注射给予批号为20061002、20061201的禽流感疫苗,对大鼠的要紧毒副反应为注射部位显现肉芽肿样结节但停药有逐步缩小的趋势,个别血液学指标〔Grn↑,MCV↓〕和脏器的重量及系数〔肝脏系数、脾脏重量及系数↑〕的升降阻碍。
毒性靶器官为脾脏,但呈可逆性阻碍。
中毒剂量未明显显示。
毒副反应剂量为1.88mg/(kg.次),无毒〔阻碍〕剂量大于0.375mg/〔kg.次〕。
〔f〕禽流感疫苗豚鼠全身主动过敏试验资料
健康白色豚鼠分别皮下注射禽流感疫苗1700μg、340μg/(kg.次),牛血清白蛋白生理盐水溶液60mg〔2ml〕/〔kg.次〕和溶媒2ml/〔kg.次〕剂量,隔日一次,连续3次进行致敏。
末次致敏后第12天由静脉单次注射4倍致敏剂量的以上相应受试物进行激发。
结果显示:
禽流感疫苗对豚鼠过敏反应为极强阳性,呈剂量反应关系。
上述结果说明家蚕生物反应器
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