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作用于DNA拓扑异构酶的抗癌药研究
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酶’l一~¨作用于DNA拓扑异构酶的抗癌药研究军事医学科学院邑—里综述夏寿萱审校R77罗.』摘要近年丰,以DNA拓扑异构酶为靶分子设计喜类抑制剂,用作抗癌药物的研究异常活跃,代表着肿瘤化疗的又一新方向.本文在夼姆DNA拓扑碡髓能的基础上,对其抑制剂的作用方式,抗癌机制,以厦疗效评价进行7阐述和讨论.DNA拓扑异构酶(DNAtopoiso—merases,简写Topo)最初自大肠杆菌中发现,后被证实在生物界普遍存在,它催化超螺旋DNA的解旋反应,是直接参与或影响DNA复制,转录,以及细胞分裂时同源染色体分离的重要酶类.该酶的这一特性为以其抑制剂作为抗菌,抗病毒及抗癌药物的研究提供了理论依据].本文仅就抗癌药方面的研究进展作一综述.生理功能与生化特性DNA的拓扑异构现象,是指DNA分子在双螺旋的基础上更高层次的结构紧张状态与松弛状态,即超螺旋状态与解旋状态之间的相互转换过程,其中不发生碱基组成或颠序的任何改变.DNA拓扑异构酶是催化这类转换反应的酶,超螺旋的解旋是复制与转录前的必要准备,除了缓解张力以利于复制或转录过程的正常进行外,更重要的是暴露DNA分子中的结合位点,使参与复制或转录的各种调控蛋白发挥作用.当复制或转录完成后,亲代与子代DNA的分离别叉要求由解旋状态恢复或转变到超螺旋状态.无论真核或原核细胞内的DNA分子,天然状态时以超螺旋为主要存在形式,上述拓扑异构化过程均是发生在分子局部,并在瞬间完成的I而在体外实验中,如质粒一类的小分子DNA,经拓扑酶作用后.可能会有相当的时阃停留在解旋状态.因此,对于各种来源的拓扑酶,通常都是采用小分子DNA作底物来检涮括性的].DNA分子更高层次的空间结构(或称三级结构)除超螺旋(supercoiling)gb,尚有纽结(knotting)和连环(catenating)两种形式.真核和原核细胞来源的DNA拓扑酶普遍分为两种类型,即拓扑异构酶I(TopoI)和拓扑异构酶I/(TopoI/).尽管两种拓扑酶均可催化上述三种DNA拓扑异构化的转换反应,但在催化机制,反应条件以及酶蛋自理化性质等方面却存在着明显差异.TopoI的催化机制是先切开双链DNA中的一条链,使链的末端沿螺旋轴按拧松超螺旋的方向转动,尔后将切口接合,反应过程中无需能量及二价金属离子的参与fTopoⅡ利是同时切断两条链,让双链DNA从切断处穿过后,再把断离的末端连接起来,并需ATP提供能量,Mg2也是绝对必要的.此外,两种拓扑酶对细胞DNA复制的贡献也不尽相同.例如,某些TopoI基因映陷的大肠杆菌突变株,只表现了比正常菌稍慢的生长速度,提示TopoI并非细菌繁殖所必需的酶,而TopoⅡ则无论对于原核或真核细胞的DNA复制,都是不可缺少的.附图上半部显示了两种拓扑酶所催化的DNA三种形式的拓扑异构化反应.目前,已纯化了包括微生物和动,植物在内的各种橱种来源的DNA拓扑酶.人TopoI的分子量约为100kDa,是一个由单拷贝基因(位于第20号染色体)编码的单亚基蛋白}TopoⅡ系由两个相同亚基组成的二囊体,分子量近170kDa,基因亦属单挎贝,位于第l7号染色体”,.其它真棱细鼍来源国外医学药学分册t或sDS卜\,i———一5———Ho—y臣至『复合物恢复嘹状f转录子的恬复戋细胞死亡l=={垂}//1一.,每.7Ho—J黪DNA链断裂附图DNA拓扑酶的生理功能殛抑制剂的作用的DNA拓扑酶也大都显示出与此相似的生化切开单链或双链DNA后,酶蛋白与末端特性与遗传背景.DNA非共价结合形成一种暂时性的易解离复抑制剂作用与抗癌机制应该指出的是,DNA拓扑酶抑制剂的抗癌机制并非由于抑制该酶的催化活性,而是通过阻断酶与DNA反应的最后一步,即单链或双链DNA在切口部位的重新接合而实现的.鉴于这一区别,现已将此作用统称为拓扑酶“中毒”.正常情况下,TopoI或TopoⅡ在.合物(cleavablecomplex),在此过程中完成切口的接合.具有中毒效应的抑制剂在于使这种易解高复台物趋于稳定和僵化,具体地说,或是使TopoI第723位酪氟酸与单链DNA3端的磷酸基,或是使TopoII第804位酪氟酸与双链DNA每一5末端的磷酸基形成共价键].中毒后的复合物如经修复尚有复原的可能,但着遇到碱或十二烷基硫酸992年第19卷第4期钠(SDS)之类的蛋白变性剂,就会造成复合物连同断离的DNA束端在切口处充分暴露(见附图下半部)因此,抑制剂的作用实际上是使细胞内功能正常的拓扑酶转变为导致DNA链断裂的致伤物.喜树碱(camptothecin)是一种来自木本植物喜树的生物碱,也是迄今唯一的一类作用于TopoI的抗癌药.作为中草药的有效成分,喜树碱在7O年代曾被广泛用于正常功能,并进一步造成DNA的链断裂损伤.非嵌入型抑制剂则是直接作用于TopoⅡ,或是仅仅与双链DNA中的一条链结合,以影响酶功能.近年来,有关TopoⅡ抑制剂作用机理方面的研究又取得了新进展.例如,Hsiang等人用氨萘非特(amonaflde)的各种衍生物作比较实验,结果发现喹啉环上的侧链不同,既可使抑制剂表现出造成DNA链断裂的不同效能,也可表现出嵌入DNA链不同部位的特异性.结合对4一(9一吖啶基亚氨基)一甲磺酰一问一甲氧基苯胺(m—AMSA),阿霉素和致瑰树碱等药研究的实验结果,可以得出以下结论t嵌入型抑制剂所致DNA链断裂的能力及链断裂部位与碱基序列的相关性,不仅取决于分子中多环结构的差异,而且与连接在多环结构上的侧链基团有关.此外,新近又发现了诸如merbraone,阿柔比星(aclarubicin),磷曲星(fostriecin)等TopoⅡ的新型抑制剂,它们非但不会干扰酶与DNA形203成复合物或造成DNA链断裂,相反对其他嵌入型抑制剂产生的这类效应具有羟呲咔哇鬼臼乙x甙iVP16).鬼臼嘻畸甙/VM26genestein已经证实的拓扑酶抑制剂对细胞存活的影响,包括抑制DNA复制,阻断RNA合成(即转录),干扰细胞分裂周期(延迟G,期),以及使染色体DNA产生断裂,降解与畸变等多种效应”.如前所述,这些效应多系DNA损伤的后果,而非酶的失活所致.尽管如此,抑制剂杀伤肿瘤细胞的机制仍十分复杂.Nelson和Hsiang等人的实验表明:
癌细胞的最终死亡很可能是多种调控蛋白及复制叉(replicationfork)协同作用的综合结果.而抑制剂所完成的仅是垒部过程中一个必要的起始步骤C17,Is3.抗癌效果的实验与应用研究肿瘤细胞内的拓扑酶水平是检验抑制剂抗癌效果的重要指标.由于拓扑酶的活性不直接反映抑制剂的实际作用,因此这里所说的”水平”更多地是指采用免疫学方法或通过mRNA检测到的酶蛋白含量或基因表达量.来自正常培养细胞的实验结果表明:
两种拓扑酶在细胞?
2o4?
生长不同时期的含量变化与调节机制存在明显差异.TopoⅡ在处于增殖状态的细胞中含量最高,进人静止或分化期后降至最低水平}而且,细胞密度,血清生长因子等影响细胞增殖的外部因素也与Topoi]的含量变化有关4193.与此相反,TopoI在人成纤维细胞中的含量与细胞生长状态无关,即使是静止期也能维持较高水平c203.与正常细胞的情况不同,TopoI和TopoⅡ在肿瘤细胞中一致表现出不受其他因素影响的高水平表达,尽管其中原因尚不清楚,但逸却是拓扑酶抑制剂对肿瘤细胞具有特殊疗效的细胞学基础.拓扑酶水平的变化差异也可为临床上某些恶性肿瘤的抗药性提供解释.例如,阿霉素和放线菌素(均为Topoi]抑制剂)治疗结肠癌的短期缓解率只有20%,但喜树碱(TopoI抑制剂)的疗效尚好.为此,研究者从未经化疗的手术患者的癌肿组织中检测了两种拓扑酶的含量,结果发现TopoI明显高于TopoⅡ,从而提示了选择用药的依据”.再如,柔毛霉素(DxR)尽管被广泛用于淋巴癌的治疗,但对慢性淋巴细胞性白血病(CLL)却普遍无效.用抗体怯比较cLL细胞与正常细胞中拓扑酶含量的结果表明:
CLL细胞中TopoⅡ的含量是增殖期的LI210细胞的1%.DNA拯伤的指标也显示出类似的区别:
即使将DXR的浓度加至50g/m1也无法测到CLL细胞的DNA链断裂,而m—AMSA和VP—l6所致CLL细胞的DNA损伤程度是LI210细胞的0.02倍c223.这些结果无疑说明,Topo1I水平过低是CLL细胞耐受该酶抑制剂的根本原因.鉴于这类情况,目前临床上已开展了在进行拓扑酶抑制剂化疗的同时,加用细胞刺激药物以提高肿瘤细胞拓扑酶水平的协同用药方案,并收到满意效果∞].小结与展望国外医学药学舟册途径,其作用机制的深人研究不仅改变了以往盲目选择细胞毒性药物的状况,也为有的放矢地研制抗癌新药与辅助疗法提供了重要线索.例如,由于肿瘤细胞内参与DNA复制的多种调控蛋白.均与拓扑酶经抑制剂作用后形成的僵化型复合物的复原过程有关4243,因此这类蛋白的抑制剂很可能成为增进疗效或独具特点的新型抗癌药.最近有关DNA拓扑酶与细胞辐射敏感性的实验结果表明:
喜埘碱与一拉帕醒(口一lapachone)可有效地增强或X射线对肿瘤细胞的杀伤效应],提示了拓扑酶抑制剂作为肿瘤放疗增敏剂的应用价值.总之,以拓扑异构酶为靶分子兼顾DNA损伤的抗癌机理研究,孕育着新药开发与综合应用的广阔前景.参考文献1WangJC.JMolBiol,197155(3):
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对映异构体的薄层色谱直接拆分法军事医学科学院三—综述张其楷审校R.f摘要薄层色谱法直接拆分对映异构体,是近年发展起来的一种新型拆分法.在原理上,被法体现7HPLC法的特色,既包括纤堆素厦其衍生物,口一环糊精,手性氨基酸金属配体交按厦电荷转移复合物作固定相的手性固定相拆分法,叉包括舔加手性试荆于展开晕统的手性流动相拆分法J在技术上,谊法还其奋快速,方便厦经济的特点.含有不对称结构的对映体药物分子常具有不同的生物活性.某些药物的对映体之一可能呈现所需的疗效,而另一构型却引起相反的生理作用,甚至产生毒副作用].因此.研究对映体分子的拆分,对于药物研究意义是很重大的.经典的制备非对映体分子的拆分珐,实验冗繁,得率低,并且对映体易于消旋化,因此发展了其它方法,如不对称合成法和酶法.色谱法是新近发展的重要拆分法之一,特别是HPLC在拆分对映体分子方面取得了夺人瞩目的进展.但HPLC法需使用较精密的仪器设备以及昂贵的手性桂,即使条件具备,对某些对映体分子也不能达到有效的分离,薄层色谱(TLC)法因此应运而生.目前TLC法已较成熟地发展了多种分离技术,如离心薄层,加压展开,各种梯度展开以及高效薄层分离,分离的效率大为提高.高效薄板的理论塔板教可达5000板/米,检测手段也已现代化,选在客观上使TLC法拆分对映体分子成为可能.该法的快速,准确,经济以及应用范围广,已在研究中不断得到证实.手性固定相拆分法纤维素曩其衍生物为藏体用色谱法分离对映体始于1951年,Kotake等报道以纸色谱法分离谷氮酸和酪氯酸消旋俸.在其后的20年中,用该法分离其它DL一氯基酸取得了极大成功.纸色谱法中的载体主要为纤维素,据认为该结构中所含不
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