牛乳微生物测定方法.docx

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牛乳微生物测定方法

微生物的生长于繁殖的感念

生长—微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢，当同化作用大于异化作用时，生命个体的重量和体积不断增大的过程。

繁殖-生命个体生长到一定阶段，通过特定方式进行新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。

发育—从生长到繁殖，是生物的构造和机能从简单到复杂、从量变到质变的发展变化过程，这一过程称为发育。

个体生长—微生物细胞个体吸收营养物质，进行新陈代谢，原生质与细胞组成的增加为个体生长。

群体生长—群体中个体数目的增加，可以用重量、体积、密度或浓度来衡量。

由于微生物的个体极小，所以用群体生长来反映个体生长的状况。

个体生长—个体繁殖—群体生长

群体生长=个体生长+个体繁殖

平板菌落计数法

最常用的活菌计数法。

将适当稀释的菌液倾注平板或涂布在平板表面，经保温培养后，以平板上出现的菌落数乘以稀释度就可以计算出原菌液的含菌量。

直径9CM的培养皿平板上出现菌落数一遍以50-500为宜。

按照国家标准规定的样品菌落总数测定的计数原则，以平板菌落在30-300之间的为报告依据。

技术要求：

样品充分混匀，操作熟练快速，一般10-20分钟完成操作，严格无菌操作。

注意事项：

每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处理，倾注平板时的培养基温度。

适用范围：

中温、好氧和兼性厌氧，能在营养琼脂上生长的微生物。

误差：

多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有由于样品内菌体分布不均匀、以及不当操作。

微生物的个体生长和同步生长

由于微生物细胞及其微小，研究其个体生长存在着技术上的困难。

同步生长的概念：

一个细胞群体中各个细胞都在同一个时间进行分裂的状态，称为同步生长。

进行同步分裂的细胞称为同步细胞。

同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的同一相，彼此间形态、生化特征都很一致，因而是细胞学、生理学和生化学等研究的良好材料。

二、微生物的群体生长

1、无分支单细胞微生物的群体生长特征

无分支单细胞微生物主要包括细菌和酵母菌，其群体生长是以群体中细胞数量的增加来表示的。

由一个细胞分裂成为两个细胞的时间间隔称为世代，一个世代所需要的时间就是代时（GenerationG）代时也就是群体细胞数目扩大一倍所需时间，有时也称为倍增时间。

下图表示的是一个细胞经过若干代分裂后的情况。

由下图可见，每经过一个代时，细胞数目就增加一倍，呈指数增加，因而被称为指数生长，这就是单细胞群体生长的特征。

指数生长可以用下式表示：

2、无分支单细胞微生物的群体生长曲线

以细菌为例介绍无分支单细胞微生物群体生长规律，其结论也基本适用于酵母菌。

生长曲线代表了细菌在新的环境中从开始生长、分裂直至死亡的整个动态变化过程。

每种细菌都有各自的典型生长曲线，但它们的生长过程却有着共同的规律性。

一般可将生长曲线分为四个时期。

时期的划分：

按照生长速率常数（growthraceconstant）不同

1、延滞期（lagphase）

其他名称：

停滞期、调整期、适应期

1.1现象：

活菌数没增加，曲线平行于横轴

1.2特点：

生长速率常数=0

细胞形态变大或增大

细胞内RNA特别是rRNA含量增加，原生质嗜碱性增强

合成代谢活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快）、易产生诱导酶

对外界不良条件敏感，如氯化钠的浓度、温度、抗生素化学药物

1.3原因：

适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物。

影响延迟期长短的因素

菌种：

繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短：

接种物菌龄：

用对数生长期的菌种接种时，其延迟期较短，甚至检查不到延迟期。

接种量：

一般来说，接种量增大可缩短甚至消除延迟期（发酵工业上一般采用十分之一的接种量）

培养基成分：

在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期，比在合成培养基上生长的时短。

接种后培养基成分有较大的变化时，会使延滞期加长，所以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分和种子培养基接近。

认识延迟期的特点及形成原因对实践的指导意义：

在发酵工业上需要设法尽量缩短延滞期：

采取的缩短延滞期的措施有：

A、增加接种量：

群体优势-适应性增强

B、采用对数生长期的健壮菌种：

C、调整培养基的成分，在种子基中加入发酵培养基的某些成分

D、选用繁殖快的菌种

在食品工业上，尽量在此期间进行消毒或灭菌

2、对数期（logarithmicphase）

其他名称：

指数期

2.1现象：

细胞数以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。

2.2特点：

生长速率常数最大，即代时最短。

细胞进行平衡生长，菌体大小、形态、生理特征等比较一致，代谢最旺盛

细胞对理化因素较敏感

2.3影响因素：

菌种

营养成分

营养物浓度

培养温度

2.4应用意义：

由于此时期的菌种比较健壮，增殖噬菌体的最适菌龄；生产上用作接种的最佳菌龄。

发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度。

食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期。

是生理代谢及遗传研究或进行染色，形态观察等的良好材料。

3、稳定期（stationaryphase）

又称横定期或最高生长期

3.1特点：

新增殖的细胞数和老细胞数的死亡数几乎相等，微生物的生长速率处于动态平衡，培养物中的细胞数达到最高值。

细胞分裂速度下降，开始积累内含物，产芽孢的细菌开始产芽孢。

此时期的微生物开始合成次生代谢产物，对于发酵生产来说，一般在稳定期的后期产物积累达到高峰，是最佳的收获期。

3.2产生原因：

营养物尤其是生长限制因子的耗尽。

营养物的比例失调，如碳氮比不合适；有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等）物化条件（如PH、氧化还原势等）不合适；

4、衰亡期（declinephase）

4.1特点

细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，群体中的活菌数目急剧下降，出现“负增长”。

细胞内颗粒更明显，细胞出现多形态，畸形或衰退形，芽孢开始释放。

因菌体本身产生的酶以及代谢产物的作用，使菌体死亡、自溶等，发生自溶的菌生长曲线表现为向下跌落的趋势。

衰亡期比其他各时期时间长，它的长短也与菌体和环境条件有关。

4.2产生原因

生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡。