HBsAb快速定量检测上转发光免疫层析试纸的研制及临床应用精.docx

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HBsAb快速定量检测上转发光免疫层析试纸的研制及临床应用精

中国医科大学

博士学位论文

HBsAb快速定量检测上转发光免疫层析试纸的研制及临床应用

姓名：

李鲁平

申请学位级别：

博士

专业：

免疫学

指导教师：

吕昌龙

20090401

・中文论著摘要・

快速定量检测ＨＢｓＡｂ上转发光免疫层析试纸

的研制及临床应用

目

乙型肝炎病毒（ＨｅｐａｔｉｔｉｓＢ的Ｖｉｒｕｓ，ＨＢＶ）是一种严重危害人类健康的致病因子，是慢性肝炎、肝硬变和肝细胞癌最重要的病因之一。

据估计，全球有３亿人是ＨＢＶ的持续携带者，其中１／３在中国。

全球约４５％的人口生活在慢性ＨＢＶ感染的高风险地区，约２０亿人感染ＨＢＶ，每年有１００万人死于ＨＢＶ感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝癌。

我国属ＨＢＶ感染高流行区，一般人群的乙型肝炎表面抗原（ｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｓｕｒｆａｃｅａｎｔｉｇｅｎ，ＨＢｓＡｇ）阳性率为９．７５％。

尽管疫苗接种卓有成效，但仍有部分人群对乙肝疫苗无应答。

诸多因素，包括衰老、吸烟、肥胖、性别和遗传因子等均与免疫应答的降低相关，男性无应答者的出现频率高于女性。

因此，定量检测各类疫苗接种者在接种后的乙型肝炎表面抗体（ｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｓｕｒｆａｃｅａｎｔｉｂｏｄｙ，ＨＢｓＡｂ）水平十分必要，特别是检测疫苗接种后的医务工作者，对防止ＨＢＶ在医院内的传播具有重要意义。

对于那些为防止因偶然因素导致母婴传播和接触传播而注射乙肝免疫球蛋白（ｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ，ＨＢＩｇ）的个体来说，定量检测ＨＢｓＡｂ也十分重要。

肝移植接受者为了预防乙肝，通常需要注射ＨＢＩｇ。

为了有效预防乙肝的发生，血液中的ＨＢＩｇ水平应当高于１００ｍｌＵ／ｍＬ。

因此，开发血液中ＨＢＩｇ的定量检测技术也势在必行。

上转发光（ｕｐ—ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇｐｈｏｓｐｈｏｒ，ＵＣＰ）材料是一种含有稀土元素的亚显微陶瓷微粒，它的特殊组成和结构为其提供一个独特的光学特征，既在红外光激发下，可以发射可见光。

这种能量上转现象使ＵＣＰ成为一种能够摆脱荧光焯灭现象和样品自发荧光干扰的示踪物。

ＵＣＰ作为示踪物与免疫层析（１ａｔｅｒａｌ．ｆｌｏｗ，ＬＦ）技术结合而成的上转发光免疫层析检测技术（ＵＣＰｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ｂａｓｅｄＬＦａｓｓａｙ，ＵＰＴ．ＬＦ）为高敏感性的、精确的定量检测奠定了坚实的基础。

目前已经开发出多种ＵＰＴ免疫层析试纸，并且在违禁药品监控、核酸、ＩＮＦ７、

血吸虫循环抗原、大肠埃希菌、鼠疫耶尔森菌、呼吸道合胞病毒等的敏感检测中显示了ＵＣＰ示踪物的作用。

但迄今为止，在国内外的相关文献中，尚未发现ＵＣＰ．ＬＦ在ＨＢＶ血清标志物定量检测方面的应用。

本研究的目的是研制一种用于定量检测ＨＢｓＡｂ的上转发光免疫层析技术，并通过对临床样品的检测评估其应用的可行性。

实验方法

利用ＰＣＧＥＮＥ计算机软件，分析已知的ＨＢＶ基因组序列，结合国内克隆的ＨＢｓＡｇ编码区序列设计、合成引物。

扩增目的基因的，回收、纯化ＰＣＲ产物，与ｐＧＥＭ．Ｔｅａｙｓ载体的ＴＡ克隆连接。

从亚克隆质粒载体中获取Ｓ基因，与表达载体ｐＲＥＳＥＴ．Ａ的连接，采用ＤＨ５ａ感受态细菌试剂盒转化连接产物，筛选及鉴定重组克隆。

挑取转化工程菌单菌落，接种于ＬＢ（含氨苄青霉素５０Ｉ＿ｔｇ／ｍｌ和氯霉素３５｝ｔｇ／ｍ１）液体培养基，３７℃振荡培养过夜。

培养物中加入异丙基硫代半乳糖昔（ＩＰＴＧ）至终浓度为ｌｍｏｌ／Ｌ，３７。

Ｃ振摇培养，诱导培养４ｈ。

收集细菌，选择最佳ＩＰＴＧ诱导浓度。

Ｔｒｉｓ．甘氨酸ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ．ＰＡＧＥ）分析表达产物，大量表达工程菌，采用ＨｉｓＴｒａｐ亲和层析柱纯化Ｈｉｓ融合蛋白，Ｗｅｓｔｅｒｎ分析表达产物。

ｂｌｏｔ

ＵＣＴ免疫层析试纸主要是由五部分组成，包括：

样品挚、结合垫、分析膜、吸水垫和粘性底衬。

样品垫、结合垫、分析膜和吸水垫通过粘胶固定于粘性底衬上。

ＨＢｓＡｇ和羊抗ＨＢｓＡｇ分别包被在分析膜上作为检测带和质控带。

将ＵＣＰ－ＨＢｓＡｇ结合物固化在结合挚上，特殊的终点指示带能显示颜色变化，用以提示免疫层析反应的结束。

将制备完成的测试条放入塑料盒式存储器内，样品垫、分析膜（检测带和质控带）、吸收垫（终点指示带）的连接部分重叠，分别对应加样孔、结果扫描窗和终点指示窗。

将７０“Ｌ血清样品和７０“Ｌ样品处理缓冲夜混合后，加到加样孔中。

当样品垫被浸透后（约在加样后１０ｍｉｎ），样品的流动将停止，而此时在吸水垫末端的终点指示带将由白色转变为蓝色，提示ＵＰＴ传感器读取结果。

ＵＰＴ传感器扫描在分析膜上的检测带和质控带，以采集数据。

阳性样品将出现２个主要的峰值信号（检测带和质控带），而阴性样品将只出现一个单一的主要峰值信号（只有质控带）。

对应检测带和质控带的峰值区域分别命名为Ｔ和Ｃ，Ｔ／Ｃ的比率即为检测结果。

在２

本研究中是采用本法检澳ｔＪ５２份健康献血者的血清样品，以确定其ｃｕｔ．Ｏ髓。

本研究中，同时应用目前常规检ｉ贝ｌＪＨｂｓＡｂ的二种方法抗原夹心法ＥＬＩＳＡ和雅培酶促免疫荧光试验（ＡｂｂｏｔｔＡｘｓｙｍＡＵＳＡＢａｓｓａｙ，ＡＵＳＡＢ）检测ＨＢｓＡ－ｂ，以估价ＵＰＴ．ＬＦ澳ＩＪ定法的特异性和敏感性。

抗原夹心法ＥＬＩＳＡ检测结果以ＯＤ值表述，ｃｕｔ—Ｏｆ瞄为０．１０５。

ＡＵＳＡＢ法以结合在微粒子表面的重组ＨＢｓＡｇ（ａｄ／ａｙ）作为固相抗原，以连接在重组ＨＢｓＡｇ上的生物素为标记物。

碱性磷酸酶标记的抗生物素抗体与抗原一生物素复合物结合。

ＡＵＳＡＢ的定量范围为０一－１０００ｍｌＵ／ｍＬ，其ｃｕｔ．ｏｆｆ值是１０ｍｌＵ／ｍＬ。

为评价实验的重复性和敏感性，推导ＵＰＴ．ＬＦ试验的标准量化方程，对１３份标准ＨＢｓＡｂ阳性血清样品（已知浓度为２０＂－－９００ｍＩＵ／ｍＬ不等）均采用３种方法测试；进而检澳ｔ］３０６份临床样品，每份样品均采用上述３种方法进行检测，评估其敏感性，特异性和ＵＣＴ．ＬＦ检测结果同另二种检测结果的符合率。

实验结果

一、乙型肝炎病毒表面抗原基因的克隆与表达

ＨＢｓＡｇ基因扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，可见扩增出一条大小约７００ｂｐ的特异性片段，无非特异性产物。

以限制性内切酶ＥｃｏＲＩ酶切质粒ｐＧＥＭ—Ｔｅａｓｙ．ＨＢｓＡｇ，获得ＨＢｓＡｇ编码基因目的片段，约７００ｂｐ，与预期值相符。

ＤＮＡ双向测序证实，证明ＨＢｓＡｇ表达载体己成功构建。

ＨＢＶＳ基因编码序列产物经大量表达和纯化，ＳＤＳ．ＰＡＧＥ鉴定显示，重组表达ＨＢＶ表面抗原Ｓ蛋白（ｒ－ＢＳ）的纯度在９０％以上，可以作为进一步使用的免疫原。

二、ＵＰＴ－ＬＦ方法的建立

检Ｎ５２份健康献血者血清样品获得的Ｔ／Ｃ比率范围为０．０５３＂－－０．０８２，Ｒ＝０．０６５，ｓ＝０．００９。

ＵＰＴ．ＬＦ、狈ｔＪ定法检测ＨＢｓＡｂ的ｃｕｔ．ＯｆＦ值确定为０．０９２（酣３ｓ）。

通过测试１３份标准样品（已矢Ｉ］ＨＢｓＡｂ浓度为２０＂－－９００ｍｌＵ／ｍＬ不等），推导出标准量化方程。

方程式如下：

ｙ＝３２７．９３１ｎ（ｘ）４－７８３．４３

为比较不同测定法的重复性和敏感性，对１３份已知ＨＢｓＡｂ浓度的样品同时进行了ＥＬＩＳＡ和ＡＵＳＡＢ法的检测。

ＵＰＴ．ＬＦ方法的变异系数为３．０００＂－－２５．１５７（叉＝１５．４９０），而ＥＬＩＳＡ和ＡＵＳＡＢ方法的变异系数分别为２．４４６－－－，７５４．９８３（又＝９３．４１６）３

和０．９９４，－．一４８．５４０（３－－２７．２１３）。

三、ＵＰＴ－ＬＦ方法的临床应用

本实验同时采用上述三种测定法对３０６份临床血清样品进行了检测，其中２７９份样品在三种方法检测中获得相同结果：

２２６例阳性，５３例阴性，符合率为９１．２％。

其余２７份样品的三种检测结果不相符合（即对某一样品的检测结果，有的方法呈阳性，有的方法呈阴性）。

按统一后的标准（２４５例真实阳性，６１例真实阴性）评价三种方法的表现。

ＵＰＴ－ＬＦ在三种方法中的敏感性最高（９９．１８％），ＥＬＩＳＡ的敏感性为９７．５５％，ＡＵＳＡＢ为９５．５１％。

虽然与ＡＵＳＡＢ（特异性１００％）相比，ＵＰＴ．ＬＦ方法的特异性（９５．０８％）不令人满意，但该法的调整一致性（代表检测技术的精确性）为９７．４３％，在三种方法中位居首位。

对ＡＵＳＡＢ方法而言，相对较低的敏感性是其在操作中的负面效应（调整一致性为９５．０６％）。

ＥＬＩＳＡ方法因敏感性和特异性的欠缺，以及不能进行定量检测而限制了它的应用。

结论

１、本实验成功构建了对应２２６个氨基酸的ＨＢｓＡｇ原核表达质粒重组体并在大肠杆菌中进行了表达。

表达产物经ＳＤＳ．ＰＡＧＥ、ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ及ＥＬＩＳＡ检测和鉴定，分子量大小与预期相符，为进一步对ＨＢｓＡｂ检测方法的研究奠定了基础。

２、ＵＣＰ作为示踪物进一步增强了免疫层析技术的敏感性和特异性，并赋予其定量检测能力。

３、成功建立了用于ＨｂｓＡｂ快速定量检测的ＵＰＴ．ＬＦ方法，该技术在三种检测方法（ＵＰＴ．ＬＦ、ＡＵＳＡＢ和ＥＬＩＳＡ）中敏感性最强和重复性最好。

并经临床样品检测结果证明ＵＰＴ．ＬＦ的实际应用的可行性。

关键词

上转发光；免疫层析技术；乙型肝炎表面抗体；定量检测４

英文论著摘要●

Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｕｐ—ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ

ｐｈｏｓｐｈｏｒｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－－ｂａｓｅｄｌａｔｅｒａｌ－－ｆｌｏｗａｓｓａｙｆｏｒｒａｐｉｄｌｙｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｓｕｒｆａｃｅ

ａｎｔｉｂｏｄｙ

ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ

ＨｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕｓ（ＨＢＶ）ｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｍｏｓｔｉｍｐｏｒｔａｎｔｃａｕｓｅｓｏｆｃｈｒｏｎｉｃｈｅｐａｔｉｔｉｓ，

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Ｍｅｔｈｏｄｓ

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ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ），ｔｈｅ

ｆｌｏｗｏｆｔｈｅｓａｍｐｌｅｗｏｕｌｄｓｔｏｐｗｈｉｌｅｔｈｅｅｎｄｉｎｇｉｎｄｅｘｌｉｎｅ

ｔｈｅｅｎｄｏｆｔｈｅａｂｓｏｒｂｅｎｔ

ｐａｄｔｕｒｎｅｄｆｒｏｍｗｈｉｔｅｔｏｂｌｕｅ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔｔｈｅｒｅｓｕｌｔｃｏｕｌｄｂｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｔｈｅ

ＵＰＴ—ｂａｓｅｄｂｉｏｓｅｎｓｏｒ．Ｆｏｒｄａｔａｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ．ｔｈｅＵＰＴ—ｂａｓｅｄｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓｃａｎｎｅｄｔｈｅ

ｌｉｎｅａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｅ

ｏｎ

ｔｅｓｔ

ｔｈｅａｎａｌｙｔｉｃａｌｍｅｍｂｒａｎｅ．Ａｐｏｓｉｔｉｖｅｓａｍｐｌｅｇａｖｅ２ｍａｊｏｒｐｅａｋ

ｓｉｇｎａｌｓ（ｔｅｓｔ

ａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｅ

ｌｉｎｅｓ），ｗｈｅｒｅａｓ

ａ

ｎｅｇａｔｉｖｅ

ｏｎｅ

ｓｈｏｗｅｄ

ａ

ｓｉｎｇｌｅ

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ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｅ

ｓｉｇｎａｌ（ｃｏｎｔｒｏｌｏｎｌｙ）．Ｔｈｅ

ｐｅａｋａｒｅａｓｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｔｏｔｈｅｔｅｓｔｌｉｎｅ

ａｎｄ

ｗｅｒｅａｓｓｉｇｎｅｄａｓ

Ｔ（ｔｅｓｔ）ａｎｄＣ（ｃｏｎｔｒ０１），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄ

Ｔ／Ｃｒａｔｉｏｗａｓｒｅｐｏｒｔｅｄａｓ

ｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔ．ＴｈｅＨＢｓＡｇｒｅｓｕｌｔＷａｓｓｈｏｗｎａｓＡｂｂｏｔｔＡｘｓｙｍ

ｓａｎｄｗｉｃｈ

ＥＬＩＳＡＷａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔ

ＨＢｓＡｂ．Ｔｈｅ

ＯＤ（ＯｐｔｉｃａｌＤｅｎｓｉｔｙ）ｖａｌｕｅ

ｗｉｔｈｃｕｔｏｆｆｔｈｒｅｓｈｏｌｄｏｆ０．１０５．Ｔｈｅ

ＨＢｓＡｇｏｎｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓａｓ

ＡＵＳＡＢ（ＡＵＳＡＢ）ａｓｓａｙｕｓｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ

ｔｏ

ｔｈｅｓｏｌｉｄｐｈａｓｅａｎｄｂｉｏｔｉｎｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＨＢｓＡｇａｓｔｈｅｃｏｎｊｕｇａｔｅ．Ａｌｋａｌｉｎｅ

ｗｉｌｌｂｉｎｄｔｏｔｈｅ

ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄａｎｔｉｂｉｏｔｉｎａｎｔｉｂｏｄｙ

ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ

ａｎｔｉｇｅｎ

ｓａｎｄｗｉｃｈ．Ｔｈｅ

ｒａｎｇｅ

ｏｆＡＵＳＡＢｉｓｆｒｏｍ０ｔｏ１０００ｍｌＵ／ｍＬ、析ｍｔｈｅｃｕｔｏｆｆｔｈｒｅｓｈｏｌｄｏｆ

１０ｍｌＵ／ｍＬ．Ｆｉｆｔｙ—ｔｗｏｓｅｒｕｍｓａｍｐｌｅｓｆｒｏｍｈｅａｌｔｈｙｐｅｏｐｌｅｗｅｒｅｔｅｓｔｅｄｂｙＵＰＴ－ＬＦ

ａｓｓａｙ

ｔｏ

ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｃｕｔｏｆｆｔｈｒｅｓｈｏｌｄ．Ｔｈｉｒｔｅｅｎｓａｍｐｌｅｓｗｉｔｌｌｓｔａｎｄａｒｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ

ｔｏ９００

ｆｒｏｍ２０

ｍｌＵ／ｍＬｗｅｒｅｔｅｓｔｅｄｔｈｒｉｃｅｂｙｅａｃｈｏｆｔｈｅ３ａｓｓａｙｓｔｏｅｓｔｉｍａｔｅｔｈｅｉｒ

ｄｅｄｕｃｅｔｈｅｓｔａｎｄａｒｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｅｑｕａｔｉｏｎｏｆＵＰＴ－ＬＦ

ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ

ａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｔｏ

ａｓｓａｙ，ａｎｄ

ｔｏ

ｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅａｃｃｕｒａｃｙｏｆｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｂｙＡＵＳＡＢａｓｓａｙ．Ｔｈｅｎ，

３０６ｃｌｉｎｉｃａｌｓｅｒｕｍｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｔｅｓｔｅｄｂｙｔｈｅ３ａｓｓａｙｓｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙｔｏｅｓｔｉｍａｔｅｔｈｅ

ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ａｎｄｃｏｎｃｏｒｄａｎｃｅｏ