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交上去的那份
初步探究miR-519d介导肝细胞癌侵袭转移的机制
12级全科医学范嘉玲姚慧李潇冉田海波
1.立项依据与研究内容
1.1.研究背景及研究意义
1.1.1.HCC的发病率高、复发率高
据统计,全球每年有超过600,000患者死于肝细胞肝癌。
由全国肿瘤登记中心发布的《2013年中国肿瘤登记年报》可知,我国每分钟约有6人被诊断为癌症,其中死亡率最高的是肺癌、肝癌、胃癌,而我国肝脏肿瘤中任以肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)为主,占78.4%[1]。
目前,肝细胞癌的治疗手段主要包括手术切除、肝移植、射频消融和索拉非尼等治疗方法[2]。
中山医科大学肿瘤医院肝胆外科自1964年至2000年共手术切除肝癌1502例,其5年生存率为16.1%、10年生存率为8.1%,而术后第一年复发率为26.8%、第二年复发率为12.2%、第三年及以后复发率为15.2%,总体复发率为54.2%,HCC复发占了死亡原因的一半以上[3]。
肝癌射频消融术的术后总体复发率为66.0%[4]。
1980年至2010年,全国累计实行肝移植手术近18113例,累计复发率分别为19.78%、30.46%、35.77%[5]。
综上,虽然肝癌治疗已得到巨大进步,但肝癌复发仍是肝癌患者术后的主要威胁。
1.1.2.复发率高主要由侵袭转移所导致
HCC切除术后的高复发率,除了HCC病灶多中心发生的因素外,更主要的原因在于HCC极易在早期通过门脉系统发生转移,导致肝内肿瘤播散,而且因肝内转移而复发的HCC比多中心发生的HCC预后差。
因HCC肝内播散早及恶性程度高的特点,患者往往在尚未出现远处转移时即告不治。
因此加强对HCC的侵袭和转移机制的研究则显得尤为重要[6]。
1.2.HCC侵袭转移机制的研究现状
肝细胞癌侵袭转移的分子改变多种多样,包括基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMPs)、钙黏蛋白(E-cadherin,E-cad)、整合素(Integrin)、CD24、CD44、丝氨酸蛋白酶、肿瘤血管生成因子等,但其中起主要作用的是MMPs和E-cad[7]。
1.2.1.基质金属蛋白酶
基质金属蛋白酶是一组含锌离子的依赖性内切酶,现已发现24种。
其中与肝癌侵袭转移关系最为密切的有MMP-2、MMP-9等。
MMPs主要的功能体现在两个方面,一是MMPs几乎能够降解除多糖以外的全部ECM,其二是可以使别的MMPs激活,形成瀑布效应[8]。
研究表明,MMPs表达增多会导致肿瘤的转移,其机制是MMPs通过降解ECM,破坏肿瘤细胞周围的物理屏障,导致肿瘤细胞脱落;从而使肿瘤向周围组织浸润并侵入血管、淋巴管;它还可以促进肿瘤血管的生成,并促进上皮间质转化[9-12]。
现已有研究证明磷酸肌酸转运蛋白3(PITPNM3)、上皮形成素(Epimorphin)、葡萄糖调节蛋白(GRP)均可以调控黏着斑激酶(focaladhesionkinase,FAK),FAK可再通过MMP-2和MMP-9发挥促肝癌细胞转移的作用[13-16]。
1.2.2.钙黏蛋白
跨膜糖蛋白E-cad定位于上皮细胞间的黏接接头部位,参与了细胞间黏附结构的形成,对于维持上皮细胞的黏附性和完整性发挥着重要作用[17]。
E-cad降低后细胞骨架重构,细胞间原本紧密的链接变得松散,细胞黏附能力下降易于从原发肿瘤部位脱落,增强了细胞的运动能力和侵袭能力[18]。
钙黏蛋白是上皮间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)中最为重要的上皮标记物,MMPs可以降解细胞表面的E-cad,促进EMT[18]。
EMT是指上皮细胞失去细胞极性、丢失细胞间紧密连接和黏附连接,获得了浸润性和游走能力,变成了具有间质细胞功能和特性的细胞。
主要特征包括:
①细胞黏附相关分子E-cadherin表达降低,导致细胞黏附减弱,细胞分散;②细胞骨架重排,由角蛋白骨架变成波形蛋白骨架;③上皮细胞由原来排列紧密的圆形或方形细胞变成排列松散的梭形细胞形态[19];④波形蛋白(vimentin)、纤连蛋白(fibronectin)及其他间质标记蛋白表达上调。
近年来已有相当多的证据表明,EMT是肝癌侵袭、转移的关键[21]。
比如:
应激活化蛋白激酶相互作用蛋白1(SIN1)、转录因子FOXC1可通过促进EMT现象导致肝癌细胞侵袭转移[22,23]。
sv-cyst通过增加E-cadherin,降低Twist来抑制EMT现象从而抑制MHCC97H的转移[24]。
这些分子并不是相互独立的,而是相互联系的。
比如分泌型簇蛋白(sCLU)和转录因子snail既可以通过上调MMP-2,也可以通过下调E-cadherin,促进EMT现象,来增强肝癌细胞的侵袭力[25,26]。
这种调控方式与下文中我们猜想的mir-519d参与肝癌细胞转移的机制相类似。
1.3.mir-519d与MMPs和E-cad介导的EMT有关
近年来有报道表明,mir-519d可能在肝癌细胞的侵袭转移中起重要作用。
Fornari等检测了56例肝癌组织及其癌旁正常组织的miRNA,发现mir-519d在癌组织中表达明显高于癌旁正常组织,其表达和患者血清AFP值和肿瘤的多灶性密切相关。
并证实,mir-519d的过表达状态促进了肝癌细胞的增殖,mir-519d可通过与PTEN、p21、AKT、TIMPs等靶基因作用而发挥功能[27-30]。
其中PTEN是抑癌基因;P21基因的表达产物通过抑制周期素、周期素依赖激酶复合物活性,来协调细胞周期、DNA复制与修复之间的关系;Akt,亦被称为蛋白激酶B(PKB),是在细胞凋亡、增殖转录及迁移等多种过程中起到重要作用的一种丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶;基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissueinhibitorsofmetalloproteinase,TIMPs)是组织中MMPs主要的内源性抑制因子,能特异地抑制MMPs家族的基质降解[31]。
已有研究表明,mir-519d在多种肿瘤细胞中表达异常,并参与肿瘤的增殖、侵袭、迁移和凋亡等过程[32,33]。
如戴劲等证实mir-519d能靶向结合OCT43'UTR序列,通过下调OCT4的表达来抑制膀胱癌细胞系5637的增殖[34]。
而且目前已有报道mir-217、mir-198、mir-590-5p、mir-96、mir-139、mir-214等20余种microRNA对肝细胞癌侵袭转移起促进或抑制作用。
而关于mir-519d在肝癌细胞侵袭转移中的作用机制还未见报道[35,36]。
已研究的miRNA对肝癌细胞侵袭转移的作用也主要是通过上文介绍的途径实现的。
比如mir-224通过HOXD10/p-pak4/MMP-9通路破坏细胞外基质来促进转移[37]。
mir-29a通过抑制DNMT来影响DNA甲基化,进而调节TGF-β诱导的EMT[38]。
1.4.研究假设
本文旨在探究mir-519d介导HCC侵袭转移的机制,根据PTEN、p21、AKT、TIMPs分别在细胞中发挥的作用和1.2中分子调控HCC侵袭转移的机制来分析,我们认为,AKT和TIMPs可能是其中最重要的两个分子,而AKT作为一个信号分子,可能涉及的途径过于复杂;而TIMPs、MMPs与mir-519d促进侵袭转移的联系就较为简单明显而且便于研究。
我们提出的假设为:
miR-519d可以抑制TIMPs的表达,因此TIMPs表达下调。
TIMPs是MMPs的抑制剂,从而MMPs表达上调,MMPs会破坏基底膜,参与细胞侵袭转移;同时,MMPs降解了E-cad,来诱导肿瘤细胞发生EMT,从而mir-519d促进了HCC侵袭转移。
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907-919.
2.项目的研究目标、研究内容以及拟解决的关键科学问题
2.1.研究目标
通过对SMMC-7721肝癌细胞株的mir-519d含量的先下调再上调,检测这两个过程中TIMPs、MMPs的含量变化以及是否发生EMT现象,从大体和细胞两个层面探究肿瘤侵袭转移能力,初步探究mir-519d可能的参与肿瘤侵袭转移的可能机制,加深对mir-519d在肝癌侵袭转移中所起的作用的理解,为可能的新药研发提供理论依据。
2.2.研究内容
已知mir-519d的靶基因中有TIMPs,其他研究者们又证明了TIMPs、MMPs之间的关系,以及MMPs与发生EMT之间的关系,这些基础研究之间的联系使我们不由得把mir-519d、EMT与侵袭转移联系起来,并假设他们之间有一部分信号通路如图1所示:
图-1:
表示不排除有其他分子参与调节,(-)表示“抑制”。
miR-519d在HCC中表达上调,miR-519d可以抑制TIMPs的表达,因此TIMPs表达会下调。
TIMPs是MMPs的抑制剂,从而MMPs表达上调,MMPs会破坏基底膜,参与细胞侵袭转移;MMPs的表达还可以诱导肝癌细胞发生EMT,参与细胞侵袭转移。
2.2.1.从分子水平研究mir-519d介导HCC侵袭转移的机制
2.2.1.1.QRT-PCR技术测mir-519d的含量
QRT-PCR技术现已成熟,用其进行HCC中mir-519d的实时监测,可初步了解原肝癌细胞中mir-519d的含量,从细胞水平初步了解肝癌细胞中mir-519d的含量。
2.2.1.2.细胞转染
Anti-miRhsa-mir-519dmiRNA转染肝癌细胞,进入细胞后可降低mir-519d的表达;Pre-miR™hsa-mir-519dmiRNAPrecursor转染肝癌细胞,进入细胞后可升高mir-519d的表达。
通过上调和下调肝癌细胞中mir-519d的含量以及这两者之间的比较,可从中得到mir-519d在介导肝癌侵袭转移中发挥的作用及其原理。
2.2.1.3.WesternBlot定量测定TIMPs和MMPs
本实验用WesternBlot定量测定蛋白质实验能够定量肝癌细胞中TIMPs和MMPs,分析它们的含量变化,同时定量E-cadherin和Vimentin,
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