新城疫油苗和冻干苗疫苗的生产工艺流程.docx
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新城疫油苗和冻干苗疫苗的生产工艺流程
新城疫冻干疫苗生产工艺流程
1生产用毒种制备
1.1毒种繁殖将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释(如10-4或10-5),尿囊腔内接种
10日龄SPF鸡胚,每胚0.1ml。
选接种后72〜120小时死亡、且病痕明显的鸡胚,分别收获鸡胚液(尿囊液及羊水),装于灭菌容器内。
将检验无菌、且对1%鸟红细胞凝集价1:
640(微量法1:
512)的鸡胚液混合,定量分装于安甑中,冷冻保存。
注明收获日期,毒种代数等。
1.2毒种鉴定
1.2.1病毒含量按含毒鸡胚液量用灭菌生理盐水作为10倍系列稀释,取10-7、
10-8、10-93个稀释度各尿囊腔内接种10日SPF鸡胚5个,每胚0.1ml,置36〜37c继续孵育,48小时以前死亡的鸡胚弃去不计,在48〜120小时死亡的鸡胚随时取出,
收获鸡胚液,同一稀释度
的胚液等量混合,按稀释度分别测定红细胞凝集价,至120小时,取出所有活胚,逐个收获
鸡胚液,分别测定红细胞凝集价,凝集价》1:
160(微量法1:
128)者判为感染,计算EID50,每0.1ml病毒含量应)108EID50O
1.2.2纯净应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染,分别按《无菌检验或纯粹检验标准操作规程》、《支原体检验标准操作规程》、《外源病毒检验标准操作规程》进行。
1.3毒种保存在-15C以下保存,应不超过1年。
1.4毒种继代应不超过3代。
2制苗材料选择选择发育良好的9〜11日龄SPF鸡胚作为制苗材料。
3制苗用毒液的制备
接种取生产用毒种用灭菌生理盐水作适当稀释(如10-4或10-5),每胚尿囊腔
内接种0.1ml,接种后密封针孔,置36〜37c继续孵育,不必翻蛋。
孵育和观察鸡胚接种后,每日照蛋一次,将在60小时前死亡的鸡胚弃去。
60小时后,每4〜8小时照蛋一次,死亡的鸡胚随时取出,直至96或120小时,不论死亡与否,全部取出,气室向上直立,置于2〜8c冷却。
收获将冷却4〜24小时的鸡胚取出,用碘酊消毒气室部位,然后以无菌手术剥除气室部卵壳,剪开尿囊膜,吸鸡胚液,每若干个鸡胚的胚液混合为一组。
收获
后的胚液置于灭菌瓶中,作好标识,留样后,结冻保存。
在收获胚液的同时,应逐个检查鸡胚,如胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者弃去不用。
4半成品检验
6.1无菌检验经处理过的胚液,每组分别取样,按《无菌检验或纯粹检验标准操作规程》进行无菌检验,应无细菌生长。
6.2病毒含量测定
按含毒鸡胚液量用灭菌生理盐水作为10倍系列稀释,取10-7、10-8、10-93个稀释
度各尿囊腔内接种10日SPF鸡胚5个,每胚0.1ml,置36〜37c继续见?
育,48小时以前死亡的鸡胚弃去不计,在48〜120小时死亡的鸡胚随时取出,收获鸡胚液,
同一稀释度的胚液等量混合,按稀释度分别测定红细胞凝集价,至120小时,取出所有活胚,逐个收获鸡胚液,分别测定红细胞凝集价,凝集价》1:
160(微量法
1:
128)者判为感染,计算EID50,每0.1ml病毒含量>107EID50者可用于配制疫苗。
5配苗及分装
将检验合格的若干组鸡胚液滤过,混合于同一容器内,按规定羽份,加一定比例的蔗糖脱脂奶粉作稳定剂,使其最终蔗糖含量为2.5%,脱脂奶粉含量为5%同时加入适宜的抗生素,充分摇匀,定量分装,每羽份病毒含量应》106EID5o。
分装后迅速进行冷冻真空干燥。
6成品检验
1物理性状
1.3外观检查疫苗瓶上的标签,打印出的羽份或头份、生产批号、有效日期
清晰可见、位置适当。
瓶上的铝盖稳固不松动。
1.3眼观检查将疫苗拿到与眼平行位置观察呈微黄色,海绵状疏松团块,然后再轻微振动,疫苗松动并与瓶壁分离,判为合格。
1.3溶解性检查用稀释液注射到疫苗瓶内,经轻微振动,疫苗应迅速完全溶解,无粘块或粘团出现,判为溶解性良好。
1无菌检验按《无菌检验或纯粹检验标准操作规程》进行,如有菌生长,应
进行杂菌计数,并作病原性鉴定(按《杂菌计数和病原性鉴定操作细则》进行)
和禽沙门氏菌检验每羽份非病原菌数应不超过1个(按《禽沙门氏菌检验法》进
行)0
1支原体检验按《支原体检验法》进行,应无支原体生长。
1鉴别检验
1.6选择发育良好的10日龄SPF鸡胚10只,划出尿囊腔接种部位。
1.6将疫苗用无菌生理盐水稀释至1050EID5o/0.1mL,与等量抗鸡新城疫病毒特
异性血清混合,室温中和1小时后,尿囊腔接种,每胚0.1mL。
1.6将接种后鸡胚用石蜡封孔后,置37c继续孵育,观察120小时,在24〜120
小时内应不引起特异死亡,且至少存活8只,鸡胚液作红细胞凝集试验,应为阴
性。
1外源病毒检验按《外源病毒检验法》进行。
1安全检验下列方法任择其一。
1.8用鸡胚检验将疫苗用无菌生理盐水稀释,尿囊腔内接种10日龄鸡胚10
只,每胚0.1ml(含10个使用剂量),接种后24〜72小时,鸡胚死亡率应不超过20%;合格。
如死亡率超过20%可用20个鸡胚重检1次,重检结果死亡率仍超过20%该批疫苗判为不合格。
1.8用鸡检验用2〜7日龄SPF雏鸡20只,合成两组,第1组10只,每只滴
鼻接种0.05mL(10个使用剂量);第2组10只,不接种作为对照,两组在相同条件下分别饲养管理,观察10日,应无不良反应。
如有非特异性死亡,免疫组与对照组均不超过1只。
1效力检验下列方法任择其一。
1.9用鸡胚检验
1.9.1鸡胚选择选择发育良好的10日龄SPF鸡胚15个,划出尿囊腔接种部
位,作出批组及滴度标记,每一滴度接种5个。
1.9.1疫苗稀释将疫苗按瓶签注明羽份,用灭菌生理盐水稀释至1羽份
/0.1mL,再作10倍系列稀释至10-7。
1.9.1接种分别取10-7、10-6、10-5三个稀释度尿囊腔内接种鸡胚各5个,每
胚0.1mL,用石蜡封孔。
1.9.1孵育置37c继续孵育至120小时,每天上、下午各照检1次,48小时以前死亡的鸡胚弃去不计,在48〜120小时死亡的鸡胚,随时取出放在2〜8c冰箱中,至120小时取出全部活胚放在2〜8CC冰箱中24小时。
1.9.1凝集价(HA)测定与计算鸡胚半数感染量(EID50)将冷却鸡胚取出,将同一稀释度的死亡鸡胚液等量混合,分别测定红细胞凝集价;将活胚逐个收获鸡胚液,分别测定红
细胞凝集价,HA>160(微量法128)者判为感染,计算半数感染量,每羽份
>1065EID5o(国家标准每羽份)106.0EID50),判为合格。
1.9用鸡检验
1.9.2鸡的选择选取30-60日龄健康易感鸡(血凝集抑制价应04)10只。
1.9.2疫苗稀释将疫苗按瓶签注明羽份,用灭菌生理盐水稀释成每0.05mL
含1/100使用剂量。
1.9.2免疫及攻毒每只鸡滴鼻接种0.05mL,10〜14日后,连同条件相同的对照鸡3只,各肌肉注射鸡新城疫北京株强毒104.°ELD50,观察10-14日,对照鸡全部发病死亡,免疫鸡至少保护9只为合格。
1剩余水分测定按《剩余水分测定方法》进行,应符合规定。
1真空度测定按《真空度测定方法》进行,应符合规定。
鸡新城疫低毒力活疫苗生产工艺流程图、主要过程控制点和控制项目
的胚液等量混合,按稀程度分另测定红细里凝集价,至120小时,取出所有活胚,
逐个收获
>装箱入库
算EID50,每0.1ml病毒含量应)108EID50。
1毒种保存在-15C以下保存,应不超过6个月。
1毒种继代应不超过3代。
2制苗材料选择选择发育良好9〜10日龄的易感鸡胚作为制苗材料。
3制苗用毒液的制备
接种取生产用毒种,用灭菌生理盐水作适当稀释(如10-4或10-5),每胚尿
囊内接种0.1ml,接种后密封针孔,置36〜37c继续孵育,不必翻蛋。
孵育和观察鸡胚接种后,每日照蛋1次,将60小时前死亡的鸡胚弃去。
此后,每4〜6小时照蛋1次,死亡的鸡胚随时取出,直至96小时,不论死亡与否,全部取出,气室向上直立,置于2〜8c冷却4〜24小时。
收获
鸡胚液的收获将冷却的鸡胚取出,用碘酊消毒气室部位,然后以无菌手术破除气室部卵壳,揭去卵壳膜,剪破绒毛尿囊膜及羊膜(谨防卵黄破裂),吸取
胚液。
对每个鸡胚在
吸取胚液前均应注意检查,凡胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者,弃去不用。
死胚和活胚分别收获,每若干个鸡胚分为一组,吸取胚液放于同一灭菌的容
器内,每组抽样测定血凝价,血凝价低于1:
160(微量法1:
128)者应弃去。
同
时作无菌检查,应无细菌生长。
收获的胚液灭活前在2〜8c左右保存,应不超过
5日。
鸡胚胎儿收获及浸出液的制备在收获及胚液的同时,取病变胎儿,去头、脚,用生理盐水洗2〜3次,磨碎,制成(1:
5)〜(1:
10)孚L剂J,加适宜的抗生素适量,然后离心或以4层纱布一层铜纱网滤过,置自然沉淀1〜2日,然后取样作无菌检查。
以上清夜作为配制双相油乳剂疫苗用。
4灭活将上述无菌胚液以4层纱布及一层细铜纱网滤过,混合于一个大玻璃瓶
内,吸出数毫升样品备测毒价。
其余胚液和鸡胚浸出液分别计量加入10卿醛溶液,
随加随摇,使其能充分混合,甲醛溶液的最终浓度为0.1%。
加甲醛溶液后最好倾
倒另一瓶中,以避免瓶口附近黏附的病毒未能接触灭活剂。
然后在37c灭活16
小时(以瓶内温度达到37c开始计时)。
期间振摇3〜4次。
在2〜8c保存,应不超过1个月。
5半成品检验
5.1无菌检验取灭活的胚液及鸡胚浸出液分别按附录448进行,应无菌生长。
5.2灭活检验取10日龄无新城疫病毒抗体的鸡胚6个,每个接种灭活胚液
0.23ml,每日照蛋2次,观察5日,鸡胚非特异死亡不应超过1个。
对所有胚液
分别测定血凝价,应不出现血凝,认为灭活完全。
如有可疑,应将可疑胚液进行重检,重检不合格者报废。
鸡胚浸出液也按照上述方法检查。
5.3毒价测定将灭活前取出的胚液进行10倍系列稀释,取10-7、10-8、10-93个稀释度分别接种9〜10日龄无鸡新城疫病毒抗体的鸡胚5个,每胚尿囊内0.1ml,每日照蛋2次,观察5日,无论死胚、活胚均应测定血凝价,血凝价〉1:
80(微量法1:
64)以上者,判为感染,计算EID50,每0.1ml病毒含量)108EID50,方可用于制苗。
6单相油乳剂灭活疫苗制备
1油相制备取注射用白油94份,加司本-806份,混合后,加硬脂酸铝2
份,随加随搅拌至透明为止,高压灭菌备用
1水相制备取吐温-804份装入带玻璃珠的瓶中灭菌,冷却后加灭活胚液
96份,充分振瑶使吐温-80完全溶解为止。
1乳化取油相3份放于乳化罐内,开动电机慢速转动搅拌,同时徐徐加入水
相1份,加完后再以10000r/min搅拌2〜5分钟,在终止搅拌前加入1%硫柳汞溶液,使其最终浓度为0.01%。
乳化后,取3〜5ml以3000r/min离心15分钟,若有分层现,应重复搅拌1次。
7双相油乳剂疫苗制备
用乳化罐乳化
水相、油相制备同单相苗,但水相制备中,鸡胚液是按4物口入吐温,而鸡胚浸出液则按6物口吐温。
取油相2份放入乳化罐内,开动电机慢速转动搅拌,同时徐徐加入胚液1份,加完后再以10000r/min搅拌。
取鸡胚浸出液(单相苗鸡胚液等量)放于乳化罐,开动电机缓缓加入上述
油包水单相苗,加完后再以10000r/min搅拌2〜5分钟,在终止搅拌前加入1嘛
柳汞溶液,使最终浓度为0.01.%。
乳化后取3〜5ml以3000r/min离心10分钟,若分层严重应再搅拌1次。
用乳化罐乳化。
定量分装,加盖密封。
检验
物理性状
1外观为乳白色乳剂。
1剂型单相苗为油包水型。
取一清洁吸管,吸取少量疫苗滴于冷水中,应
呈油滴状不扩散。
双相苗为水包油包水型,滴于冷水中,应呈云雾状扩散。
9.1.3稳定性在37c左右条件下放置21日,应不破乳。
9.1.4粘度用1ml吸管(出口内径1.2mnj),吸取25c左右的疫苗1ml,令其垂
直自然流出,记录流出0.4ml所需时间。
单相苗在8秒以内,双相苗在5秒以内
为合格。
9.2无菌检验
按《无菌检验或纯粹检验标准操作规程》进行,应无菌生长。
9.3安全检验
用30〜60日龄健康易感鸡(HI抗体01:
4)6只,各肌肉或颈
部皮下注射疫苗
1ml,观察14日,应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反
应。
9.4效力检验
用30〜60日龄健康易感鸡(HI抗体01:
4)15只,其中10只
各皮下或肌肉注射疫苗20〃(用0.5ml以下的注射器注射),另5只不免疫作对
照,21〜28日后,连同条件相同的对照鸡
5只,各肌肉注射105ELD0强毒,观察
14日,对照组全部死亡,免疫组至少保护
7只为合格。
9.5甲醛含量测定按《甲醛含量测定法》
进行,应符合《制品检验的有关规定》。
主要过程控制点和控制项目
鸡新城疫灭活疫苗生产工艺流程图、
前孵化
•,接种途径•’,'
■4BFI■I4
1.剩余水份测定通
妾种
无相应抗体,
一,..1,,药术依据及原J
[:
照其力间’「[y-
U氏快嵬利SHIM的碘和二氧化硫在砒惊种中醇洛掖中<的就/陪叙.
陷副血应《娜理,林而测定水份
*冷蛋
力,1号:
M相仪器、试剂的准备及基本要求
器及设畲装瓶
清洗
0
-15C冷冻保存
灭活
►收获
),分装前*中、后无检•
清洗
*脉动蒸汽灭菌
*重
电子分析天平(精度0.1mg,称量范围0〜110g),费休水份滴定仪(梅特勒
DL31)。
1试齐U
卡氏试剂、无水甲醇,纯水。
1检验器具
止血钳(开启苗瓶),玻璃棒(或能捣碎检品的器具),10ul注射器,烧杯。
1样品每批疫苗4个样品。
1其它检验记录纸、笔、纱布和汗布手套。
3检验步骤
4.3接通电源、打开费休水份滴定仪(梅特勒DL31)主机、打印机、天平开关。
4.4按滴定仪的RUN®滴定仪自动滴定至终点。
4.5滴定仪屏幕显示待机模式Dr惟值在25以下指示箭头稳定“(平指)时,开
始滴定标定滴度:
4按F2键至显示屏出现H2OISO3696
4连续按F3键至显示屏出现pleaseaddsample0.0100g
4天平去皮,通过进样孔注入已称重的纯水,(用10dl注射器抽取10dl
纯水置天平称重)注射器放回天平后按F3;
4按F1自动输入样品量;
4按F2显示样品重量;
4按F3确认样品重量;
4滴定至终点自动打印出结果,打印结束按F3返回到待机模式;
4重复标定只需依上述第1条开始同法操作。
4.6水份测定:
4将样品置天平称重
4连续按F3键,显示屏出现pleaseaddsample0.0000g〜5.000g;
4天平去皮后通过进样口将已称重的样品加入滴定杯中,将载样杯放回天
平。
4按F3预滴定
4按F1自动输入样品量
4按F2显示样品重量
4按F3确认样品重量
4滴定至终点自动打印出结果,打印结束,按F3返回到待机模式
4
4记录与计算
5结果判定
每瓶样品含水量不得超过4.0%,如有超过时,可重检一次。
2.真空度测定法
1技术依据及原理
依据《兽用生物制品质量标准》附录中的真空度测定法,即使用高频火花真空测定器测定。
它的基本原理是利用本仪器振动形成火花束,激励谐振荡回路,使次线线圈感应出高频高压脉冲电压,使被检物产生不同颜色的辉光,根据颜色的变化来判断疫苗的真空度。
2注意事项
3.1按照规定要求,在检验过程中至少要有一名检验员和一名复核员共同进行,确保检验结果的准确性。
3.2检验要在光线较暗的操作室里进行,便于结果判定的准确性。
3.3被检样品从冷库中取出应擦干瓶壁上的水份,样品达到室温后再进行测定。
3材料、仪器、试剂的准备及基本要求
仪器及设备
电火花真空检测器。
样品所有被检样品。
检验记录纸、笔。
4检验步骤
取待检样品,一字排列于暗室的操作台上,使瓶与瓶之间有一定距离。
将真空检测器尾部电源插头插入220V电源插座里。
将放电簧头对准被检样品(簧头不要触到瓶壁),打开开关,间歇适用(时
开时关)。
观察并记录逐瓶样品的真空状态。
5安全措施
使用真空检测器时,人体不要接近仪器的头部电簧,以免高频电流的电击,(但没有生命危险)。
测定样品真空时,检测器必须缓慢移动,放电簧不应在一点停留时间过长,以免把玻璃击穿,影响样品本身的效果。
测定样品真空时,注意远离疫苗瓶上的金属帽,否则会造成错误信号,甚至在金属处将玻璃击穿而造成漏洞。
6结果判定
如果容器内出现白色、粉色或紫色辉光,则真空度检查合格
3.无菌检验和纯粹检验
1技术依据及原理:
生物制品(除另有规定者外)都不应有外源微生物污染。
灭活疫苗不得含有
活的本菌或本毒。
各类生物制品必须按规定作无菌检验或纯粹检验,全部操作应在无菌条件下进行。
2注意事项
抽样后逐瓶检查包装、胶塞、瓶签有无破损和毁坏,瓶内有无杂质。
为防止交叉污染,一个样品用一个吸管或一个注射器。
各类生物制品的检验操作应在无菌条件下进行。
检验过程要仔细、认真。
保持实验室的清洁卫生,严格遵守常规的消毒制度。
3材料、仪器、试剂的准备及基本要求
仪器
24〜26C、36〜38c温箱,检验器具,试管架,10ml、5ml、1ml吸管,记号笔,记
录纸。
检验用培养基
无菌检验
厌氧性及需氧性细菌的检验用含硫乙醇酸盐培养基(简称T.G)和酪月东琼脂
培养基(简称G.A)0
霉菌及腐生菌检验用葡萄糖蛋白月东汤(简称G.P)o
纯粹检验用适宜本菌生长的培养基。
4检验步骤
抽样应随机取样并注意代表性。
制造疫苗用的各种原菌液、毒液和其它配苗组织乳剂、稳定剂及半成品的
无菌或纯粹检验,应每瓶(罐)分别抽样进行,抽样量为2〜10ml。
成品的无菌或纯粹检验应按每批或每个亚批进行,每批按瓶数百分之一抽
样,但不应少于5瓶,最多不超过10瓶,分别进行检验。
检验用培养基
无菌检验
厌氧性及需氧性细菌的检验用硫乙醇酸盐培养基(T.G)及酪月东琼脂
(G.A)。
霉菌及腐生菌检验用葡萄糖蛋白月东汤(G.P)°
活菌纯粹检验用适于本菌生长的培养基。
灭活检验用适于本菌生长的培养基,或对本毒敏感的细胞、组织和动
物。
杂菌计数用马丁琼脂或G.A培养基。
病原性鉴定用T.G培养基或其他适宜培养基。
检验方法及结果判定
细菌原菌液及活菌苗半成品的纯粹检验取样接种T.G小管及适宜于本菌
生长的其他培养基斜面各2支,每支0.2ml,1支置37c培养;1支置25c培养,观察3〜5日,应纯粹。
病毒原毒液和其它配苗组织乳剂、稳定剂及半成品的无菌检验取样接种
T.G小管及G.A斜面各2支,每支0.2m1,1支置37c培养;1支置25c培养,观察3〜5日,应无菌生长。
灭活检验细菌灭活后,用适于本菌生长的培养基2支,各接种0.2ml,
置37c培养5日,应无菌生长。
病毒液灭活后和细菌毒素脱毒后接种对本毒敏感的细胞、禽胚或实验动物,应正常。
含甲醛、苯酚、汞类等防腐剂和抗生素的制品用T.G培养基50ml,接
种样品(冻干制品先做10倍稀释)1ml,置37c培养,3日后自小瓶中吸取培养物。
分别接种T.G小管和G.A斜面各2支,每支0.2m1,1支置37C;1支置25C,另取0.2ml,接种1支G.P小管置25C,均培养5日,应无菌生长。
如制品允许含一定数量非病原菌,应进一步作杂菌计数和病原性鉴定。
细菌性活疫苗(冻干制品恢复原量)及不含防腐剂、抗生素的其它制品或稀释液,将样品直接接种T.G小管、G.A斜面或适于本菌生长的其他培养基各2
支,每支0.2m1,
1支置37C;1支置25C,另用1支G.P小管,接种0.2m1置25C,均培养5日。
细菌性活疫苗应纯粹,其他制品应无菌生长。
如培养后混浊不易判定时,可移植l次,再判定。
每批抽检的样品必须全部无菌或纯粹生长。
如发现个别瓶有杂菌或结果可
疑时,可重检原瓶(如为安甑或冻干制品,可重抽样品),如无菌或无杂菌生长,
可作无菌或纯粹通过。
如仍有杂菌,可抽取加倍数量的样品重检,个别瓶仍有杂菌,则作为污染杂菌处理。
5安全措施
检验过程中注意防止对检验人员和环境的污染。
检验人员必须穿戴工作服和口罩。
滴撒在操作台、地面的异物要进行消毒处理。
检验完毕后开封的检品均要经过高压灭菌处理。
6记录和计算
检品在接种相关培养基后,每天观察温箱内的培养情况并记录观察结
4.杂菌计数
1技术依据及原理
某些疫(菌)苗允许有一定数量的非病原性杂菌,但这类制品如污染杂菌,必
须作杂菌计数。
2注意事项
为防止交叉污染,一个样品用一个吸管或一个注射器。
各类生物制品的检验操作应在无菌条件下进行。
检验过程要仔细、认真。
3材料、仪器、试剂的准备及基本要求
仪器
36〜38c普通温箱,试管架,10ml、5ml、1ml吸管,记号笔,记录纸,显微镜。
培养基(含4%ft清及0.1%裂解血球全血)马丁琼脂或酪月东琼脂培养基(G.A)。
4检验步骤
污染杂菌的制品至少重新抽检3瓶,分别进行杂菌计数。
用普通肉汤或蛋白陈水50倍稀释,接种于含4炖清及0.1%裂解血球全血的马丁琼脂平板或酪月东琼脂
(G.A)平板上,每个样品接种2付平板,放置36〜38c培养48小时,再放置室
温24小时,然后分别计算杂菌菌落(CFUo
5安全措施
检验过程中注意防止对检验人员和环境的污染。
检验人员必须穿戴工作服和口罩。
滴撒在操作台、地面的异物要进行消毒处理。
检验完毕后开封的检品均要经过高压灭菌处理。
6记录和计算
培养72小时后,分别计算每个平板的杂菌数,并把两付平板的杂菌数相加后
求平均数,作为该瓶的杂菌数。
如污染霉菌,亦作为杂菌计算。
7结果判定
任彳<1瓶每克组织(或每头剂)的非病原菌数,不应超过所检产品的规定数量。
原体检验
1技术依据及原理
病毒性活疫苗不得含有支原体。
2注意事项
在检测中必须遵守规定的程序,每次都必须设阳性和阴性对照。
对每批支原体检验用培养基进行质量检测,并作记录。
操作时禁止口吹吸管。
操作人员必须戴口罩、工作帽,穿工作服,禁止检验人员将头发留在帽外。
保持实验室的清洁卫生,严格遵守常规的消毒制度。
必须在无菌、无支原体污染的环境条件下操作。
3材料、仪器、试剂的准备及基本要求
仪器
36〜38c普通温箱,36〜38c二氧化碳培养箱,显微镜,试管架,10ml、5ml、
2ml、1ml吸管,小试管和100ml培养瓶,记号笔,记录纸。
培养基
检测由禽胚组织或其细胞制成的活疫苗用改良Frey氏培养基。
检测其他种类的活疫苗用支原体培养基。
4检验步骤
样品处理
每批制品取样3〜5瓶,混合后备用。
如为冻干制品,则加液体培养基复原成混悬液后混合。
接种与观察
液体培养基培养取5ml疫苗混合物接种于盛20ml小瓶液体培养基中,再从
小瓶中分别取0.2m1移植接种于2支小管液体培养基内,将小瓶与小管放36〜38c培养,每日观察培养物有无颜色变黄或变红。
如在5日尚未见变化,再从小瓶中取0.2m1移植于另2支管液体培养基内,继续培养观察5日,如此重复3次。
若
仍无变化,在最后一次接种小管的培养物经14天观察后停止观察。
在观察期内,
如果发现小瓶或任何一支小管培养物颜色出现明显变化,pH值变化达±0.5时,
应立即移植于小管液体培养基和固体培养基,观察在液体培养基中是否出现恒定的pH变化,及在固体上有无典型的“煎蛋”状支原体菌落。
琼脂固体平板培养在每次液体培养物移植小管培养的同时,取培养物0.1〜
0.2m1接种琼脂平板2付,放在
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