幽门螺杆菌Cag致病岛hp0540基因的克隆表达及其多克隆抗体的制备.docx

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幽门螺杆菌Cag致病岛hp0540基因的克隆表达及其多克隆抗体的制备

幽门螺杆菌Cag致病岛hp0540基因的克隆表达及其多克隆抗体的制备

韩军，邵世和，谢立苹，黄世腾，田树伟，黄河

【摘要】目的：

构建幽门螺杆菌（Helicobacterpylori，Hp）Cag致病岛（Cagpathogenicityisland，CagPAI）编码的hp0540基因的原核表达系统，并制备其多克隆抗体。

方式：

应用PCR技术从Hp11637基因组DNA中扩增hp0540基因片段，克隆至pMD182T载体后，进行序列测定，并对其序列进行生物信息学分析;构建pET28ahp0540原核表达载体，转化表达宿主菌BL21DE3;经IPTG诱导表达后，SDS-PAGE法鉴定目的蛋白的表达，并以Ni2+NTA柱分离纯化目的蛋白;将纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并测定抗体效价。

结果：

成功克隆了hp0540基因，全长1086bp，编码361个氨基酸，与基因库发布的其他Hp菌株基因序列的核苷酸同源性为98%。

工程菌诱导后SDSPAGE显示新生表达蛋白带，相对分子质量约为39000，经Ni2+NTA柱纯化后可取得重组蛋白，重组蛋白免疫新西兰大白兔后取得效价为1∶160000的多克隆抗体。

结论：

成功构建了hp0540基因的原核表达系统并制备了其多克隆抗体，为研究该基因的功能奠定了基础。

【关键词】幽门螺杆菌;Cag致病岛;CagI;多克隆抗体

　　[Abstract]Objective:

Toconstructtheexpressionsystemofhp0540fromstrainNCTC11637ofHelicobacterpylori（Hp）andpreparethepolyclonalantibodyserumofCagI.Methods:

Thehp0540genewasamplifiedbyPCRwiththegenomicDNAofHpNCTC11637astemplate.TheplasmidpMD182Thp0540wasconstructedviaTAclonemethodandsequenced.Thesequenceofhp0540wasanalyzedthroughbioinformaticsapproach.TheexpressionvectorpET28ahp0540wasconstructedandtransformedintoBL21DE3bymolecularcloningmethod.TheproteinwasexpressedandcharacterizedviaSDSPAGEmethodafterinducedbyIPTG.ThetargetproteinCagIwaspurifiedandcollectedbyNi2+NTAagarose.Thepuriedproteinwasusedtoimmunizerabbittopreparepolyclonalantibodyserum.Results:

Thehp0540hasbeenclonedsuccessfully.Thesequenceanalysisforhp0540showedthatitshared98%homologywithotherstrainsofHpinGenBank.Themolecularmassofthepurifiedproteinwas39000.Thepotencyofthepolyclonalantibodyserumwas1∶160000.Conclusion:

Weconstructedtheprokaryoticexpressionsystemandpreparedthepolyclonalantibodyserumsuccessfully,whichestablishedafoundationforthefunctioninvestigationofthehp0540.

　　[Keywords]Helicobacterpylori;Cagpathogenicityisland;CagI;polyclonalantibody

　　幽门螺杆菌（Helicobacterpylori，Hp）是一微需氧革兰阴性细菌，世界上有50%人口因感染该菌而致使慢性胃炎、消化性胃溃疡、胃腺癌、淋巴样组织瘤等消化道疾病，世界卫生组织于1994年将其列为第一类致癌原[1-3]。

高致病性菌株都含有一长度为40kb的Cag致病岛（Cagpathogenicityisland，CagPAI），用以编码四型分泌系统（typeIVsecretionsystem，TFSS），通过该系统细菌能够把一些诸如细胞毒素抗原（CagA）、空泡毒素A（VacA）、肽聚糖等致病因子注入宿主细胞，并进而引发细胞在增殖、骨架重排、细胞连接、形态延伸与散射等方面的改变[4]。

hp0540是CagPAI内的第19号基因，与根癌农杆菌的TiDNA转运系统中的基因不具有同源性，由hp0540编码的CagI蛋白是TFSS的一伴侣样蛋白。

有研究说明CagI蛋白能够与新近发觉的宿主整合素受体β1发生彼此作用，从而阻碍毒力因子CagA的转运，但其具体的作用机制及完整的功能尚不清楚[5]。

因此，本文通过对CagPAI中的hp0540基因进行克隆表达及其多克隆抗体的制备，将为进一步研究该基因在Hp致病机制中的作用奠定基础。

　　1材料和方式

　　材料

　　菌株HpNCTC11637购自中国预防科学院流行病学研究所,大肠埃希菌DH5α及BL21DE3为江苏大学医学技术学院中心实验室保留。

　　要紧试剂和仪器哥伦比亚培育基、厌氧袋购自OXOID公司;ExTaqDNA聚合酶、dNTP、限制性核酸内切酶EcoRⅠ与XhoⅠ，T4DNA连接酶（快速连接试剂盒）、IPTG、2000bp、15000bpDNA标准参照物及蛋白质分子量标准（低）均购自TaKaRa公司;10kbDNA标准参照物购自TOYOBO;Ni2+NTA购自Qiagen公司;pET28a载体由江苏大学医学技术学院中心实验室保留;PCR基因扩增仪（MastercyclerGracent，Eppendor公司）、自动凝胶成像系统（美国UVP公司），其他常规试剂依照《分子克隆实验指南》配制。

　　方法

　　Hp的培育与鉴定及基因组DNA提取HpNCTC11637标准菌株按常规微需氧方式进行培育与鉴定。

DNA用常规酚、氯仿抽提法取得，-20℃保留备用。

　　hp0540基因的克隆及工程菌的构建依照基因库中已报导的Hp26695NC_000915的hp0540基因序列进行信号肽预测，显示前60bp编码信号肽，去除前60bp后利用软件设计引物：

p1:

5′ATAGAATTCACAGAAGTAGTAATAACGCTTGAAC3′（34bp）;p2:

5′AGACTCGAGTTTGACAATAACTTTAGAGCTAG3′（34bp）。

在上游引物5′端加EcoRⅠ酶切位点;在下游引物5′端加XhoⅠ酶切位点。

预期的PCR产物长度为1086bp。

引物由上海生工生物技术合成。

以HpNCTC11637菌株基因组DNA为模板,依照常规PCR条件进行扩增,反映体积为50μl。

反映条件:

94℃预变性10min,94℃50s,60℃45s,72℃50s,30个循环,最后于72℃延伸10min。

PCR产物用%琼脂糖凝胶电泳进行分析后，用DNA回收试剂盒进行回收纯化。

将纯化的PCR产物克隆到载体pMD182T上,连接产物转化大肠埃希菌DH5a，选择阳性克隆进行酶切鉴定。

用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切鉴定阳性质粒pMD182Thp0540,双酶切取得目的基因片段,然后连接到原核表达载体pET28a，连接产物转化大肠埃希菌BL21DE3,酶切鉴定阳性重组质粒pET28ahp0540取得重组工程菌。

　　DNA序列测定分析及编码蛋白特性预测将通过鉴定的阳性重组质粒寄至上海生工测序。

基因片段的同源性分析利用NCBI的Blast在nr数据库中对基因的同源性进行比对分析;应用软件DNAStar分析hp0540编码氨基酸序列的理化特性。

登岸SMART数据库预测与CagI（hp0540）具有彼此作用的蛋白并进行同源性比对。

　　目的蛋白的表达纯化与抗体的制备取经酶切鉴定构建成功的重组工程菌,接种于含卡那霉素的3mlLB液体培育基中,在37℃振荡培育至光密度D（600nm）为时，以不同浓度的IPTG诱导不同的时刻后搜集菌液,用PBS洗涤3次,SDSPAGE检测,以未经转化的大肠埃希菌BL21DE3及转化空载体pET28a诱导的菌液为阴性对照。

确信表达的最正确条件后，大量诱导工程菌，按镍柱Ni2+NTA纯化目的蛋白步骤提取重组蛋白。

以纯化蛋白为抗原加弗氏佐剂免疫新西兰大白兔制备兔抗重组蛋白多克隆抗体血清，以ELISA鉴定其免疫性。

　　2结果

　　Hp的分离培育与鉴定

　　培育96h后的NCTC11637经革兰染色，在油镜下可见海鸥状、弧形、s形的革兰阴性菌，尿素酶、氧化酶、触酶实验均阳性。

　　hp0540基因PCR扩增结果

　　PCR结果显示在1086bp周围显现了条带（图1），与预期大小相符，无非特异性条带。

　　TA克隆重组质粒的挑选与鉴定

　　将胶回收后的PCR产物与pMD182T载体连接，产物转化至感受态大肠埃希菌DH5α，涂板、37℃培育12h后随机挑取单菌落摇菌，提取质粒，双酶切鉴定产物，电泳结果显示在3000bp与1086bp左右显现条带（图2）。

　　M：

10kbDNA标准参照物;1：

EcoRⅠ单酶切鉴定pMD182Thp0540;2：

EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定pMD182Thp0540;3：

PCR产物

　　重组表达质粒的酶切鉴定

　　将酶切鉴定为阳性的TA质粒与pET28a载体别离用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切，回收目的片段，16℃连接留宿后转化至感受态大肠埃希菌Bl21DE3，涂板、37℃培育12h，随机挑取单菌落摇菌，提取质粒，双酶切鉴定产物电泳结果显示大约在5000bp与1086bp处显现条带（图3）。

　　M1：

2000bpDNA标准参照物;1：

PCR产物;2：

EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定pET28ahp0540;3：

EcoRⅠ单酶切鉴定pET28ahp0540;M2：

15000bpDNA标准参照物

　　hp0540基因片段的序列测定及编码蛋白的理化特性预测

　　将鉴定后的重组质粒送往上海生工进行核苷酸序列测定，DNA测序结果说明，构建的重组质粒上的hp0540长度为1086bp，与设计序列大小完全一致。

将测得序列别离与已知的两种国际标准菌株Hp26695和J99的hp0540基因的核苷酸序列进行比对，同源性别离为98%（1067/1086）、98%（1066/1078）。

应用DNAStar软件分析取得CagI（hp0540）的相对分子质量为39377，等电点PI为。

应用JamesonWolf法对其抗原性进行了分析（图4）。

登录SMART数据库进行的相关蛋白预测显示：

CagI蛋白可能与致病岛中的CagL、CagH、CagA、CagG、CagF、CagE、CagD、CagC等蛋白（括号内为可信度）具有彼此作用。

　　目的蛋白在大肠埃希菌中的表达

　　将重组质粒pET28ahp0540转化大肠杆菌BL21DE3,经IPTG诱导表达,搜集菌液进行SDSPAGE电泳检测。

结果显示在大约40000处有特异性条带（图5），与预期大小一致,而作为对照的宿主菌与pET28a空质粒宿主菌在相应位置未见到蛋白条带。

　　M：

蛋白标准参照物;1：

BL21DE3菌株;2：

转化了pET28a空载体的BL21DE3;3：

转化了重组质粒却未经IPTG诱导的BL21DE3;4、5：

转化了重组质粒并经IPTG诱导的BL21DE3

　　多克隆抗体的制备与效价测定

　　将纯化蛋白免疫家兔，取得抗CagI多克隆抗体，以避免疫之前兔的血清作为阴性对照，对抗体进行倍比稀释后做ELISA，测得抗体效价为1∶160000。

　　3讨论

　　在幽门螺杆菌的致病机制中，由Cag致病岛编码的蛋白所组成的TFSS组成了其最重要的致病因子之一[6-9]。

除幽门螺杆菌外，TFSS还存在军团杆菌属、巴尔通（氏）体属、博德特氏菌属等病原菌中，在这些病原菌中TFSS拥有的一个一起功能确实是能够将一些致病因子转移至宿主细胞，进而引发相应的疾病[10-12]。

在幽门螺杆菌致病机制的前期研究中，已经说明四型分泌系统的伴侣样蛋白CagL可与宿主细胞表面的整合素a5β1受体发生彼此作用，从而启动细菌要紧毒力因子CagA的转运，并激活细胞内的信号级联放大反映，进而引发一系列的病理转变[6]。

最新的研究揭露了CagA的转运还依托于宿主细胞的另一整合素受体β1，JiménezSoto等[5]已通过酵母双杂交的方式证明了CagA的N端，CagY（hp0527）的C端及CagI（hp0540）均与整合素β1具有彼此作用。

　　随着伴侣样蛋白CagL可启动细菌要紧毒力因子CagA转运的发觉，伴侣样蛋白在致病机制中的作用已慢慢引发了重视。

幽门螺杆菌CagA蛋白转运的伴侣样蛋白除CagL与CagI外，还包括CagZ（hp0526）、CagU（hp0531）、CagM（hp0537）、CagN（hp0538）、CagG（hp0542）、CagF（hp0543）、CagD（hp0545）。

Fischer等[13]的研究说明，在这些蛋白中，CagZ与CagI关于CagA转运是必需的，但对IL8的诱导并非产生阻碍，而CagN、CagG、CagF、CagD对CagA的转运与IL8的诱导都是必需的，可能与这几种蛋白具有稳固TFSS结构的功能有关。

还有研究说明CagM关于hp0532基因的表达具有调剂作用，而对CagU蛋白的功能研究却未见报导。

目前，关于这些基因的研究尚不够深切与全面，而全面地揭露这些基因的功能，关于更好地熟悉幽门螺杆菌的致病机制及其四型分泌系统的结构都极为必要。

　　本研究成功地克隆了幽门螺杆菌NCTC11637的hp0540基因，并制备了CagI蛋白的多克隆抗体。

DNA测序后的序列比对结果说明，该基因具有高度保守性，与Hp其他菌株的同源性达到了98%。

在SMART数据库进行的相关蛋白预测显示，CagI可能与致病岛中的CagL、CagH、CagA、CagG、CagF、CagE、CagD、CagC等蛋白具有彼此作用。

这将为进一步研究该基因对CagA的转运、TFSS的组装及其致病相关因子的彼此作用奠定了基础，从而更好地揭露该基因在幽门螺杆菌致病机制中的作用。

【参考文献】

　　[1]CorreaP,PiazueloMB.NaturalhistoryofHelicobacterpyloriinfection[J].DigLiverDis,2020,40（7）:

490-496.

　　[2]BackertS，SchwarzT，MiehlkeS，etal.FunctionalanalysisofthecagpathogenicityislandinHelicobacterpyloriisolatesfrompatientswithgastritis,pepticulcer,andgastriccancer[J].InfectImmun,2004,72

（2）:

1043-1056.

　　[3]董苏荣,邵世和,殷秀杰,等.幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cagX基因的克隆及生物信息学特点预测[J].江苏大学学报：

医学版,2020,18

（2）:

97-101.

　　[4]BackertS,SelbachM.RoleoftypeIVsecretioninHelicobacterpyloripathogenesis[J].CellMicrobiol,2020,10（8）:

1573-1581.

　　[5]JiménezSotoLF,KutterS,SewaldX,etal.HelicobacterpyloritypeIVsecretionapparatusexploitsbetalintegrininanovelRGDindependentmanner[J].PLoSPathog，2020，5（12）:

e1000684.

　　[6]KwokT,ZablerD,UrmanS,etal.HelicobacterexploitsintegrinfortypeIVsecretionandkinaseactivation[J].Nature,2007,449（7164）:

862-866.

　　[7]KurosawaA,MiwaH,HiroseM,etal.InhibitionofcellproliferationandinductionofapoptosisbyHelicobacterpylorithroughincreasedphosphorylatedp53,p21andBaxexpressioninendothelialcells[J].JMedMicrobiol,2002,51（5）:

385-391.

　　[8]YamauchiK,ChoiIJ,LuH,etal.RegulationofIL18inHelicobacterpyloriinfection[J].JImmunol,2020,180

（2）:

1207-1216.

　　[9]DampierW,TozerenA.SignalingperturbationsinducedbyinvadingH.pyloriproteinsinthehostepithelialcells:

amathematicalmodelingapproach[J].JTheorBiol,2007,248

（1）:

130-144.

　　[10]BurnsDL.TypeIVtransportersofpathogenicbacteria[J].CurrOpinMicrobiol,2003,6

（1）:

29-34.

　　[11]BackertS,MeyerTF.TypeIVsecretionsystemsandtheireffectorsinbacterialpathogenesis[J].CurrOpinMicrobiol,2006,9

（2）:

207-217.

　　[12]AndrzejewskaJ,LeeSK,OlbermannP,etal.CharacterizationofthepilinorthologoftheHelicobacterpyloritypeIVcagpathogenicityapparatus,asurfaceassociatedproteinexpressedduringinfection[J].JBacteriol,2006,188（16）：

5865-5877.

　　[13]FischerW,PülsJ,BuhrdorfR,etal.SystematicmutagenesisoftheHelicobacterpyloricagpathogenicityisland:

essentialgenesforCagAtranslocationinhostcellsandinductionofinterleukin8[J].MolMicrobiol,2001,42（5）:

1337-1348.