分子生物学与细胞生物学实验基本技术2.docx
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分子生物学与细胞生物学实验基本技术2.docx
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分子生物学与细胞生物学实验基本技术2
实验十九SSCP技术检测基因突变
一、目的
学习分析基因突变的SSCP技术。
二、概述
单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象,这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的,当有一个碱基发生改变时,会或多或少地影响其空间构象,使构象发生改变,空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同.因此,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开.该方法称为单链构象多态性(Single-StrandConformationPolymorphism,SSCP)分析。
将SSCP用于检查PCR扩增产物的基因突变,从而建立了PCR-SSCP技术,进一步提高了检测突变方法的简便性和灵敏性.。
三、材料
电泳仪,垂直板电泳槽,移液器,枪头,载样缓冲液,凝胶图象分析仪等。
四、实验步骤
1、通过PCR方法扩增DNA片段,从琼脂糖凝胶电泳中回收及纯化DNA片段。
2、制备聚丙烯酰胺凝胶(PAG):
1)制备适宜浓度的胶液,加入胶模的两块玻璃板之间。
2)在胶凝固之前,将梳子插入模子。
3)室温放置1h使之凝固.然后拔掉梳子,顶部加入1×TBE封闭,备用。
3、加样
1)DNA变性:
将DNA样品与载样缓冲液(含50%去离子甲酰胺的pH8.0 20mmol/LTris-HCL)混合,在90-95℃加热3-5分钟,然后立即置于冰浴中。
使双链DNA片段变性成为单链DNA。
2)每孔加样量5-15ul。
4、电泳
在10-15℃下电泳.开始在20W电泳,待样品进入胶后,再调节功率至30W,电泳1-3小时。
若以恒定电压进行电泳,电压可维持在10-20V/cm。
电泳结束后取下凝胶,将其浸在含0.5ug/ml溴化锭的1×TBE缓冲液中染色30--45min,在紫外灯下观察,或进行银染。
5、银染法
1)将凝胶用去离子水洗二次,浸入10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定30min,不断摇晃。
2)倒掉固定液,用去离子水洗二次。
3)再浸入染色液(0.15%AgNO3)中,染色10分钟。
4)倒掉染色液,用去离子水洗3--5次。
5)将凝胶浸入显色液(0.5%NaOH和0.15%甲醛)中显色,直至条带显示最佳颜色(约10min)。
6)立即倒掉显色液,加入终止液(10%冰乙酸),终止反应。
.
7)将凝胶置无水乙醇中脱水,凝胶图象分析仪观察拍照,或将凝胶封入塑料袋中,可以保存较长时间。
五、注意事项:
1.PCR-SSCP只能作为一种突变检测方法,要最后确定突变的位置和类型,还需进一步测序。
2.由于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的,这样就可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小时,再加上其他条件的影响,使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检。
3、经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变,90%可被SSCP发现。
3.在小于1Kb长度的情况下,DNA片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下:
DNA片段长度(核苷酸数)
丙烯酰胺(%)
1Kb~700b
3.5
700b~500b
5
500b~200b
8
200b
12
审
实验二十PCR-RFLP
一、目的
掌握PCR-RFLP方法及其在基因突变检测中的应用
二、概述
PCR-RFLP技术:
PCR-RFLP全称多聚酶链反应(PCR)一限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthPolymorphism,RFLP)分析.PCR-RFLP主要有三个环节:
(1)靶基因PCR扩增;
(2)扩增的DNA片段限制性酶切图谱(长度多态性).该术应用PCR将目的基因片段扩增百万倍以上,即使被测样品核酸量小于pg水平,也能被扩增出来,这不仅大大提高了基因分析的灵敏度,而且无需标记或放射性探针杂交过程.PCR-RFLP主要用于核酸变异性分析与比较,当DNA或RNA分子由于单碱基突变或序列重排,使某种酶切位点增加,减少或消失,导致限制性酶切片段长度发生改变,就产生了限制性片段长度多态性,由于限制性内切酶在DNA分子上有特异的酶切位点,根据其识别序列的位置和数量,可以把大小相似而序列有差异DNA切割成不同的片段通过核酸电泳,可将长度不等的DNA片分离而显出其长度多态性(片段的大小).PCR-RFLP用于基因分析具有分辩率高,重复性好,简便快速直观等优点,主要用于微生物的分群分型分亚型,癌基因分析,遗传病的诊断,HLA分型及载脂蛋白基因的分析等.
三、材料及试剂
1.ALW261内切酶及反应buffer
2.PCR产物样品
3.去离子水
4.eppendorf管及Tip头
5.PCR仪
6.标记笔、无粉手套等
四、操作步骤
1.设置20ul反应体系,在200ulEP管中加入:
PCR产物样品17.5ul
10×buffer2ul
ALW2610.5ul
2.充分混匀,离心20S。
3.置于PCR议上37℃反应过夜
4.用6×上样buffer上样电泳(1.5%琼脂糖凝胶)
5.凝胶成像及观察
审
实验二一动物组织细胞的裂解与全细胞蛋白提取、浓度测定
一、目的
掌握动物细胞裂解释放细胞全蛋白及其浓度测定的方法及保存条件
二、概述
组织细胞在特定的物理化学条件下,释放部分或全部蛋白质,通过离心等步骤加以分离,即可获得蛋白质粗品。
制备细胞裂解物是分离蛋白质的一个重要步骤,裂解细胞的方法取决于不同的实验目的与要求。
Celllysisbuffer1用于释放细胞浆蛋白,Celllysisbuffer11用分离全细胞蛋白,本实验以Celllysisbuffer11为细胞裂解液提取全细胞蛋白。
根据蛋白质性质,测定蛋白质的方法主要有:
Bradford法:
蛋白质与考马斯亮蓝染料的结合量不同,其OD595值也不同,与OD595成直线关系;Lowry法:
蛋白质在碱性溶液中与铜形成复合物,此复合物及芳香族氨基酸还原磷钼酸-磷钨酸试剂产生蓝色;紫外分光光度法:
蛋白质的芳香族氨基酸在280nm有吸收;双缩脲法:
凯氏定氮法。
本实验利用考马斯亮蓝法对提取细胞全蛋白质进行定量。
三、试剂与材料
1.Celllysisbuffer11(50mMTris-Cl,150mMNaCl,0.0%NaN3,0.1%SDS,1mMPMSF,1%NP-40,0.5%去氧胆酸钠)
2.低温高速冷冻离心机
3.电动匀浆机
4.移液器
5.EP管
6.Tip头
7.制冰机
8.Bovineserumalbumin(BSA)
9.生理盐水
10.紫外分光光度计或装备有595nm滤光器酶标仪
11.考马斯亮蓝G-250(0.01%考马斯亮蓝G-250,4.75%乙醇V/V,10%磷酸(V/V))
四、操作步骤
(一)、全细胞蛋白提取
1.组织需用预冷的PBS洗净残血,每100mg组织加入CelllysisbufferⅢ1ml,电动匀浆机匀浆至无完整细胞结构(4℃)。
2.EP管分装,离心(12000g×20min,4℃)。
3.上清液即为全细胞蛋白质,EP管分装后-70℃保存;部分用于蛋白质浓度测定。
(二)、蛋白质浓度测定
1.BSA标准管蛋白的配制:
取1.5mlEP管6个,分别加入0.5mg/mlBSA0ull、5ul、10ul、15ul、20ul、25ul,用0.9%NaCl补足至100ul。
同样方法制备样品。
2.每管分别加入1ml考马斯亮蓝G-250,震荡片刻,室温放置2分钟。
3.加入酶标板或比色皿进行测定,读取OD595nm,以BSA标准管蛋白建立标准曲线和相关方程式,求出被测标本的蛋白质浓度。
五、注意事项
1.制备蛋白质时一般要求在4℃条件下操作,并加入一定的蛋白酶抑制剂,以防蛋白质降解。
2.被检测样品的稀释度应在标准曲线范围内,所以要摸索好条件,再进行检测。
审
实验二二SDS-PAGEandWESTERNBLOT
一、目的
熟悉SDS-PAGE电泳方法及其应用,掌握WESTERNBLOT检测蛋白质表达水平
二、概述
不同带电颗粒在同一电场中泳动的速度不同,常用泳动率或迁移率来表示。
泳动度是指带电颗粒在单位电场强度下电泳的速度。
其影响主要因素有:
带电颗粒净电荷的数量、大小及形状,电场强度,电泳液PH值及粒子强度,电渗作用。
在SDS-PAGE过程中,加入SDS以消除带电颗粒本身电荷的影响,使电泳迁移率只决定于待分离物质分子的大小,与本身电荷无关。
在变性条件下进行单向凝胶电泳,蛋白质在凝胶介质中向阳极泳动时因分子量大小不同而得到分离。
灌制聚丙烯酰胺先灌制分离胶,待分离胶凝固后在其上灌制浓缩胶,然后固定在电泳装置上,蛋白质在SDS存在下煮沸变性溶解,上样电泳后电转移至硝酸纤维膜或尼龙膜上,与放射性或非放射性物质标记的抗体特异性结合,成像或现色以检测相关抗原的质与量。
三、试剂及材料
1.Proteinmarker
2.Bovineserumalbumin(BSA)
3.Trisbase(ultrpure)
4.SDS(ultrpure)
5.30%Acrylamide/Bis-Acrylamide
6.0.1MPMSF(biotechgrade)
7.Glycine
8.DTT
9.TEMED
10.二巯基乙醇(化学纯)
11.0.5%丽春红(分析纯)
12.5×SDSelectrophoresisbuffer(0.125MTris,0.96MGlycine,0.5%SDS)
13.2×SDSlandingbuffer(0.1MTris,20%Glycerol,4%SDS,2%2-ME,tracebromophenolblue)
14.TBST(0.1MTris-Cl,09%NaCl,0.05%Tween-20,PH7.5)
15.Blockingbuffer(TBST+5%non-fatdrymilk)
16.Antibodiesdilutedbuffer(TBST+0.4%BSA)
17.Transferbuffer(25mMTris-Cl,192mMGlycine,20%methanol)
18.考马斯亮蓝R-250(0.05%考马斯亮蓝R-250,50%甲醇,10%乙酸)
19.Bio-Radprotein111)电泳仪电泳槽、转移槽
20.台式高速冷冻离心机
四、操作步骤
(一)、SDS-PAGE
1.按电泳仪说明书组装好灌胶模块。
2.按table1配制凝胶溶液,按要求制备分离胶和积层胶,凝固后备用。
3.上样:
调整蛋白质样品浓度为5μg/μl,加入等体积的2×SDS上样缓冲液,隔水煮沸5mim,冷却后按顺序依次上样(电转移胶每孔上样20μl,银染胶每孔上样8μl,含合适的proteinmarker。
4.电泳:
接通电源,恒压电泳(30mA,1小时,Tris-Glycine电泳缓冲液)至染料前沿到达凝胶底部。
5.凝胶考马斯亮蓝染色:
将凝胶置于盛有考马斯亮蓝染色(10%乙酸,45%甲醇,45%水,0.05%考马斯亮蓝G-250)中,室温染色2小时以上,脱色液(10%乙酸,45%甲醇,45%水)脱色4小时以上至蛋白条带清新为止。
6.凝胶银染略。
Table1
Contens
10%separationgel(ml)
5%condensinggel(ml)
Non-ionwater
4
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