牛奶中金黄色葡萄球菌的检测.docx
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牛奶中金黄色葡萄球菌的检测
食品科学技术学院
综合设计性实验立项申请书
课题名称:
牛奶中金黄色葡萄球菌的检测
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申请日期:
年月日
一、研究目的意义、国内外研究现状、主要参考文献
目的意义:
金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,金葡菌)是一种革兰氏阳性球菌,广泛分布于自然界,可以引起人和动物的感染。
在人体主要寄殖于鼻前庭粘膜、腹股沟、会阴部和新生儿脐带残端等部位,偶尔也寄生于口咽部、皮肤、肠道及阴道口等,是医院感染常见的病原体之一。
金黄色葡萄球菌也是引起食物中毒的重要致病菌之一,检测食品中金黄色葡萄球菌对于预防和控制金黄色葡萄球菌引起的食物中毒具有重要意义。
(1)掌握金黄色葡萄球菌的生理特性、致病性、流行学特点、分布,熟悉金黄色葡萄球菌的污染控制方法。
(2)掌握金黄色葡萄球菌的检验方法,观察金黄色葡萄球菌的革兰氏染色镜检形态。
(3)掌握金黄色葡萄球菌增菌培养技术、分离技术、鉴定技术。
国内外研究现状:
金黄色葡萄球菌是院内感染的常见细菌之一,许多国家都设有专门机构,应对金葡菌的院内感染问题。
随着ß-内酰胺类抗生素的广泛应用,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)随之增加,且引起的感染和病死率有逐年增加的趋势。
MRSA可通过接触途径进行传播,即易感人群从携带者或感染者身上获得MRSA,导致传播流行。
美国第一例MRSA发现于1968年,1975年MRSA在临床分离出的金葡菌中仅占2.4%,而1991年则迅速增至29%。
现在美国的某些医院MRSA在临床分离出的金葡菌中可以占到30%-50%。
同样在欧洲的葡萄牙和意大利,MRSA在临床分离出的金葡菌中占50%;土耳其和希腊>30%。
荷兰非常低,只有2%,这归功于荷兰人行之有效的控制策略。
在欧洲的调查中,瑞士的流行率最低(1.8%),这主要由于他们在医院内实行了一些新的干预行为,如坚持医护人员的手部卫生管理,以减少MRSA的传播。
在北欧国家MRSA在临床分离出的金葡菌中不足1%。
在芬兰MRSA是非常少见的,直到20世纪90年代医院的病人中只有散发的病例,近几年有报道由不同的流行株引起的医院感染暴发。
同时,MRSA在社区感染中所占的比例也不断增加。
1997年日本报道了第一例耐万古霉素的金葡菌(vancomycin-intermediatestaphylococcusau-reus.VISA),表明金葡菌的耐药问题日益严重。
国内情况:
上海地区1977~1979年MRSA占5%,1985~1986年占24%,1990年综合性大医院增至50%,而1993年则上升到60%。
重庆地区1983~1985年为8.3%,1989~1992年上升为18.7%;1995年北京5家教学医院MRSA分离率平均为47%。
广州地区1990~1995年临床分离的MRSA占金黄色葡萄球菌的比例分别为17.9%、23.5%、30.9%、41.6%、51.9%及56.18%。
其它地区的报道也一般在25%~60%之间,各个地区和医院的MRSA检出率都明显有逐年增加的趋势。
主要参考文献:
(1)《食品微生物检验》(第1版),国家质量监督检验检疫总局职业技能鉴定指导中心主编.北京:
中国计量出版社.2002.
(3)《食品卫生微生物检验标准手册》(第1版),罗雪云、刘宏道主编.北京:
中国标准出版社.1995.
(4)《食品卫生微生物学检验》2003版中华人民共和国国家标准.中华人民共和国卫生部中国国家标准化管理委员会发布
(5)《药品微生物学检验手册》马绪荣苏德模等主编.科学出版社.2001.
(6)《食品中金黄色葡萄球菌检测方法研究进展》唐俊妮、杨蓉生(1.西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;王小玲(2.西南民族大学电气信息工程学院,四川成都610041)中图分类号:
TS207.4 文献标识码:
A 文章编号:
1002-0306(2011)05-0459-03
(7)GB/T4789.食品卫生微生物学检验[S].
(8)陈敏,王颖,顾其芳.巧克力中金黄色葡萄球菌存活及产毒情况观察[J].中国卫生检验杂志,2000,10(5):
532-533.
(9)徐景野,等.棒冰中金黄色葡萄球菌存活观察[J].中国卫生检验杂志,1998,8(5):
293.
(10)汪复,朱德妹,张婴元.上海部分医院细菌耐药监测及其临床意义.中华传染病杂志,1996,14(3):
148.
二、研究内容、预期成果:
研究内容:
1、形态与染色:
典型的金黄色葡萄球菌为球型,直径0.8μm左右,显微镜下排列成葡萄串状。
金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛,大多数无荚膜。
2、培养特性:
金黄色葡萄球菌营养要求不高,在普通培养基上生长良好,需氧或兼性厌氧,最适生长温度37°C,最适生长pH7.4。
平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起,直径1-2mm。
血平板菌落周围形成透明的溶血环。
金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性,可在10-15%NaCl肉汤中生长。
3、生化特性:
可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖,产酸不产气。
甲基红反应阳性,VP反应弱阳性。
许多菌株可分解精氨酸,水解尿素,还原硝酸盐,液化明胶。
金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力,对磺胺类药物敏感性低,但对青霉素、红霉素等高度敏感。
对分型进行简单的了解
1、血清学分型:
金葡水解,获得两种抗原成分:
蛋白抗原和多糖抗原。
蛋白抗原是凝集抗原,无特异性。
多糖抗原有特异性。
绝大多数金葡含有A型抗原,B型抗原主要存在于凝固酶阴性菌株,C型抗原在致病性和非致病性菌株中都存在。
2、噬菌体分型:
3、根据肠毒素分型:
4、根据血浆凝固酶分型:
金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌,可引起局部化脓感染,也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等,甚至败血症、脓毒症等全身感染。
金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶:
a.溶血毒素:
外毒素,分α、β、γ、δ四种,能损伤血小板,破坏溶酶体,引起肌体局部缺血和坏死;
b.杀白细胞素:
可破坏人的白细胞和巨噬细胞;
c.血浆凝固酶:
当金黄色葡萄球菌侵入人体时,该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固,阻碍吞噬细胞的吞噬作用。
葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关;
d.脱氧核糖核酸酶:
金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温,可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌;
e.肠毒素:
金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素,分为A、B、C、D、E及F五种血清型。
当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品,如牛奶和奶制品、肉、蛋等,在温度条件适宜时,经8-10小时即可相当数量的肠毒素。
肠毒素可耐受100°C煮沸30分钟而不被破坏,它引起的食物中毒症状是呕吐和腹泻。
此外,金黄色葡萄球菌还产生溶表皮素、明胶酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。
预期结果:
革兰氏阳性菌染色为蓝色,革兰氏阴性菌染色为红色,金黄色葡萄球菌革兰氏染色为阳性。
三、研究方法和进度安排:
1.研究方法:
(1).革兰氏染色:
1.1涂片、火焰固定。
1.2草酸铵结晶紫染1min。
草酸铵结晶紫染液的配制:
溶液A:
结晶紫2g,95%酒精20mL,溶液B:
草酸铵0.8g,蒸馏水80mL。
将A、B溶液混合,用滤纸过滤后即可使用。
1.3自来水冲洗。
1.4加碘液覆盖涂面染约1min。
1.5水洗,用吸水纸吸去水分。
1.6加95%酒精数滴,并轻轻摇动进行脱色,20s后水洗,吸去水分。
1.7沙黄液(稀)染2min后,自来水冲洗。
干燥,镜检。
革兰氏阳性菌染色为蓝色,革兰氏阴性菌染色为红色
(2).触酶试验:
取槽置于洁净的试管内或玻片上,然后加3%过氧化氢数滴;或直接滴加3%过氧化氢于不含血液的细菌培养物中,立即观察结果。
有大量气泡产生者为阳性,无则为阴性。
2.样品采集:
选取怀疑有金黄色葡萄球菌感染的牛奶进行试验,将其每样取5ml于无菌乳样杯中,待检。
3病原菌的分离培养
初步诊断:
将少量乳汁涂片、革兰氏染色、镜检。
如发现圆球形革兰氏阳性细菌可怀疑为葡萄球菌。
分离培养:
将乳样摇匀,分别取适量接种于营养肉汤(10%血清)、鲜血琼脂、麦康凯琼脂培养基(平板)后,置于37℃温箱培养24~48h。
观察每个平板中细菌生长的情况,记录菌落生长表现。
普通琼脂平板上,37℃,24~72h培养后,可见到湿润、光滑、隆起的圆形金黄色菌落。
挑取典型菌落涂片、染色、镜检(镜检呈葡萄状排列,无芽胞、荚膜,直径0.5~lμm,革兰氏染色阳性),并挑取单个可疑菌落移植于肉汤和斜面培养基,经37℃培养24~48h。
24h后没有长菌的平板,再用相应的增菌肉汤涂划一次,继续培养,24~48h后,再作检查,以防漏检。
将剩余的乳样存放于4℃冰箱内备用。
营养肉汤中呈浑浊生长,管底有少量灰白色沉淀;
4生化鉴定
触酶试验:
触酶阳性
糖发酵试验:
能分解甘露醇、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖
色素产生情况:
能产生金黄色色素
5毒力试验
将上述经过生化试验鉴定的细菌悬液用灭菌生理盐水作适当稀释,对随机分组的小鼠进行腹腔注射接种,接种量为0.5mL/只(家兔皮下接种1.0mL或者静脉接种0.1~0.5mL),能够致死动物或者内脏出现脓肿可以确定有毒力。
6病原菌的重分离试验
对接种后发病、死亡小鼠(家兔)的肝脏进行病原菌重分离。
进行菌落涂片、革兰氏染色、显微镜检查,观察所分离菌株是否为原接种菌。
如果是则进一步确定病原菌为金黄色葡萄球菌。
第一,金黄色葡萄球菌的检验
样品处理:
无菌取25g或25mL食品样品,放入225mL灭菌生理盐水中均质,制成10-1稀释液。
增菌培养:
将10-1稀释液接入7.5%NaCl肉汤或胰蛋白胨肉汤中,37°C培养24小时。
分离培养:
将上述稀释液或培养液分别划线血平板和Baird-Parker平板,置37°C培养24~48小时。
金黄色葡萄球菌在血平板上呈金黄或白色菌落,大而凸起,表面光滑,周围有溶血圈。
在Baird-Parker平板上菌落为圆形,直径2~3mm,颜色灰或黑色,周围有一浑浊带。
染色观察:
从平板上挑取可疑性菌落进行革兰氏染色,金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性,显微镜下呈葡萄状排列的芽孢、荚膜,直径0.5~1μm。
第二,金黄色葡萄球菌肠毒素检测
金黄色葡萄球菌肠毒素的检测主要有动物试验、血清学实验、免疫荧光试验及酶联免疫吸附等方法。
2.进度安排:
2012年07月09日
四、拟利用本实验室的名称及试剂需要:
实验室名称:
微生物实验室
试剂:
牛奶、结晶紫2g,95%酒精20mL,草酸铵0.8g,蒸馏水80mL、番红染液生理盐水琼脂
五、审批意见:
教师姓名
职称
年月日
学生签名
年月日
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