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大鼠弥漫性轴索损伤后炎症因子的表达及检测
大鼠弥漫性轴索损伤后炎症因子的表达及检测
杨小锋,王浩,温良,龚江标,王芳,李全成,苏琳,徐俊(310003杭州,浙江大学医学院附属第一医院王忠诚神经外科中心)
[摘要]目的检测大鼠弥漫性轴索损伤后炎症因子TNF-α、IL-1和IL-2在轴索损伤位点的表达和聚集及其与β淀粉样前体蛋白(β-amyloidprecursorprotein,β-APP)聚集的相关性。
方法30只雄性SD大鼠被随机分成对照组(n=5)和实验组(n=25)。
实验组大鼠采用Marmarou方法制作大鼠DAI模型,对照组大鼠只进行假手术操作。
分别于伤后3h、6h、12h、24h和48h各处死5只实验组大鼠,制备脑组织切片,经HE染色和Bielschowsky染色对新皮层、海马、胼胝体的轴索损伤进行形态学观察,应用免疫组织化学法染色检测各时间点大鼠脑上述区域内β-APP和TNF-α、IL-1和IL-2的表达。
对照组大鼠脑组织的处理过程与实验组相同。
结果大鼠伤后3h即可出现轴索排列紊乱、神经元变性损伤,伤后12h-24h,可见轴索回缩球形成,伤后48h可见多处轴索断裂和散在分布的轴索回缩球;与对照组相比,伤后3h~48h,大鼠新皮层、海马及胼胝体区域β-APP的整体光密度值在伤后3h即有显著增加,并在伤后48h内持续升高;在新皮层、海马及胼胝体区域TNF-α和IL-1的表达类似,其平均光密度值在伤后3h显著增加,并于伤后6~12h达到高峰,之后开始逐渐下降,但在伤后48h时其在新皮层、海马和胼胝体内的平均光密度值仍显著高于对照组;在上述区域内,IL-2的平均光密度值在伤后3h时有显著性升高,但在6~24h内逐渐下降,伤后48h又有显著升高。
伤后β-APP的整体光密度值与TNF-α和IL-1的平均光密度值均有显著相关性;而IL-2的平均光密度值与β-APP的整体光密度值却无显著的相关性。
结论大鼠DAI后伴随着轴索损伤的进展,β-APP的聚集在48h内逐渐加重。
大鼠DAI后脑内TNFα和IL-1的表达类似,早期快速增加,6-12h达到高峰,后逐渐开始下降。
TNFα和IL-1的表达与β-APP的聚集具有一定的相关性,可能参与到DAI后的继发性脑损伤。
DAI后早期IL-2的表达和聚集聚与β-APP的聚集的聚集物明显相关性。
[关键词]弥漫性轴索损伤;炎症反应;炎症因子
TheExpressionandDetectionofInflammatoryCytokinesinRatBrainwithDiffuseAxonalInjury
YangXiaofeng,WangHao,WenLiang,GongJiangbiao,WangFang,LiQuanchen,SuLin,XuJun.WangZhongchengNeurosurgeryCenter,FirstaffiliatedHospital,SchoolofMedicine,ZhejiangUniversity.Hangzhou310003,China.
[Abstract]ObjectiveToinvestigatetheexpressionandaccumulationoftumornecrosisfactoralpha(TNF-α),interleukin-1(IL-1)andinterleukin-2(IL-2)ininjuredlociofratsbrainafterdiffuseaxonalinjury(DAI)andthecorrelationswiththatofbeta-amyloidprecursorprotein(β-APP).Methods30adultmaleSprague-Dawleyratswererandomlydividedintocontrolgroup(n=5)andexperimentalgroup(n=25).5injuredratsweresacrificedrespectively3hours,6hours,12hours,24hoursand48hoursafterobjectedtodiffuseaxonalinjuryaccordingtoMarmarou’smethods.Inpreparedbraintissuessections,HEandBielschowskystainingwereperformedtoinvestigatethehistologicalchanges,whileimmunohistochemicalstainingtodeterminetheexpressionandaccumulationofβ-APP,TNF-α,IL-1andIL-2.Ratsincontrolgroupexperiencedshamoperationwithoutbraininjuryandthesametissuepreparationprocedure.ResultsAxonaldisorderandneurondegenerationinexperimentalratsbraintissuecouldbeobservedasearlyas3hafterDAIandaxonalretractionballcanbedetected12~24hafterinjury.Theintegralopticaldensity(IOD)ofβ-APPinneocortex,hippocampusandcorpuscallosumsignificantlyincreased3hafterinjuryandcontinuedwithin48hours.TheexpressionofTNF-αandIL-1inneocortex,hippocampusandcorpuscallosumaresimilar,whosemeanopticaldensityelevatedsignificantlyat3hafterDAIandpeaksat6~12h,andthengraduallydecreasedbutstillhigherthanthatincontrolgroupat48hafterinjury.ThemeanopticaldensityofIL-2intheaboveareaswasalsohighersignificantlythanthatincontrolgroupat3hafterinjury,butdecreasedduring6~24h.However,itincreasedagainat48h.Significantcorrelationwasfoundbetweenβ-APP’sIODandTNFαandIL-1’smeanopticaldensity,whichwasnotbetweenβ-APPandIL-2.ConclusionAfterDAI,β-APPgraduallyaccumulatedininjurylociwithin48hours.TheexpressionofTNF-αandIL-1allincreasedinneocortex,hippocampusandcorpuscallosumandpeaksat6~12hafterinjury.Therearesignificantcorrelationbetweenβ-APP’saccumulationandTNFαandIL-1’sexpression,suggestingthatbothcytokinesmaybeinvolvedinthesecondaryinjuryofDAI.Significantcorrelationwasnotfoundbetweenβ-APP’sIODandIL-2’smeanopticaldensity.
[Keywords]diffuseaxonalinjury;inflammation;cytokine
弥漫性轴索损伤(diffuseaxonalinjury,DAI)是大脑遭受旋转加速性打击时,因剪应力(shear)而造成的在轴索聚集区以轴索肿胀、断裂和轴索回缩球形成为特征,并伴有脑实质点状、灶状出血的颅脑创伤[1]。
它是创伤性颅脑损伤(traumaticbraininjury,TBI)的一种特殊形式,尤其在重型颅脑创伤中的发病率较高,临床上多表现为持久的意识障碍、植物状态和早期死亡。
DAI的损伤机理特别是继发性的损伤机制尚未完全明确,故目前临床上对DAI并无针对性的治疗手段,只能对患者进行对症和支持治疗,这也是目前DAI治疗效果差的重要原因之一[2]。
为此,DAI的继发性损伤机制也一直是颅脑创伤领域的研究热点之一。
最近的的一项研究表明,在DAI早期即能观察到炎症细胞在DAI损伤位点(如皮质下白质、海马、胼胝体等处)的聚集,并有轴索损伤处小胶质细胞的激活[3],这一反应一直持续到慢性期,与轴索的断裂可能有一定的关系。
在CNS中,炎症细胞的聚集和胶质细胞的激活往往伴随着炎症因子的合成和释放,而且这些炎症因子也参与到了其后续的继发性损伤,对患者的预后有重要影响;但炎症反应和炎症因子是否也参与了DAI的发生发展,目前的研究极少涉及。
在此,我们拟通过免疫组化技术初步检测大鼠DAI后炎症因子TNF-α、IL-1在轴索损伤位点的表达和聚集,并检测其与轴索损伤的相关性。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物:
雄性清洁级SD大鼠30只,购于浙江省医学院动物实验中心。
实验前将大鼠在温度22-25℃、湿度50-60%、昼夜各12h交替的环境中适应性饲养一周,自由进食和饮水。
1.1.2主要试剂:
山羊抗大鼠β-APP、TNFα、IL-1抗体,辣根过氧化物酶标记的驴抗山羊IgG抗体及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体,均购于美国SantaCruz公司;DAB显色剂,购于中国碧云天生物科技公司。
1.1.3主要器材:
Marmarou大鼠DAI模型制作装置,主要包括有:
(1)内径2.8cm,长2m的不锈钢管;
(2)直径2.5cm,重量450g的圆柱形铁锭;(3)直径2.5cm,厚3mm的圆形不锈钢垫;(4)海绵垫。
其它设备包括病理石蜡切片机、光学显微镜、电子分析天平、病理图像分析系统等,由浙江大学医学院附属第一医院传染病国家重点实验室提供。
1.2方法
1.2.1大鼠DAI模型制备:
按照Marmarou介绍的方法制作大鼠DAI模型。
实验组大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉后,俯卧于海绵垫上,颅骨表面置一铁盘,由重物坠击铁盘,在450g/2m(重量/高度)的负荷下,脑峰值加速度达900G;于脑矢状面平面上,脑受压幅度达0.28mm,脑内形成DAI。
对照组大鼠只进行上述手术操作而不打击。
1.2.2组织标本制备:
制作DAI模型后3h、6h、12h、24h和48h,每个时点各取5只实验大鼠,腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉,开胸、主动脉插管,剪开右心房;从插管内灌注生理盐水至右心房流出液清亮位置。
再灌注4%多聚甲醛溶液,即刻断头取脑,并通过冠状闭锁装置封闭包括了新皮质、海马上层部位的丘脑组织块。
标本按常规方法固定、染色、包埋后,在前联合尾部通过切片机制作连续的冠状位切片(n=60sectionsat40µm/section),每只大鼠最后选择6张切片,随机标号1-6。
对照组的5只大鼠予以假手术操作,不损伤大脑,其余操作与实验组相同。
1.2.3组织形态学检查:
各大鼠切片1按常规方法作HE染色,切片2作Bielschowsky染色,切片3-6分别做β-APP、TNFα、IL-1和IL-2免疫组化染色。
免疫组化流程:
石蜡切片脱蜡至水;PBS漂洗5min,共3次;切片侵入柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)中,放入微波炉内加热,保持水温90℃左右10min,自微波炉内取出冷却20min,以显露抗原;新鲜配置的3%H2O2室温孵育20min,以消除内源性过氧化物酶的活性;蒸馏水洗3次,PBS浸泡5min;PBS漂洗5min,共3次;滴加正常血清封闭液,37℃,30min,甩去多余液,不洗;滴加相应的一抗混合溶液,4℃过夜;PBS冲洗5min,共3次;加入辣根过氧化物酶标记二抗,37℃,1h;PBS冲洗5min,共3次;将切片移至Tris缓冲盐溶液平衡10min;
在新鲜配置的二胺基联苯胺(DAB)溶液中进行辣根过氧化物酶显色5min;用PBS冲洗5min,共3次;梯度酒精脱水;二甲苯透明,中性胶封片。
1.2.4观察:
显微镜下观察上述制备的切片,描述HE染色和Bielschowsky染色下脑组织的形态;对免疫组化双染色切片,用病理图像分析处理软件分析图像。
将玻片上实验编号覆盖,采用单盲法处理图像。
将切片置于连有计算机图像分析处理系统的光学显微镜下,放大400倍,随机选取3个视野进行观察,并采用ImagePro-Plus16.0软件处理图像,β-APP免疫组化染色且计算其整体光密度值(integralopticaldensity,IOD),TNFα、IL-1和IL-2免疫组化切片计算其平均光密度值。
1.2.5数据处理:
以上数据以
±s表示,用SPSS17.0统计学软件处理,用独立样本t检验,比较实验组各组数据与对照组数据间是否具有显著性差异,并检测β-APP表达与TNFα、IL-1和IL-2表达的相关性。
2.结果
2.1HE染色结果
在对照组,大鼠新皮层、海马CA1/齿状回中间区域和胼胝体内轴索排列规则整齐;伤后3h即有核周空泡变性,示伤后水肿的存在,至12h恢复正常;伤后3h即可出现轴索排列紊乱;并能观察到神经元变性损伤,神经细胞大小不等,失去正常结构,细胞核深染,核移位等;毛细血管肿胀、充血等;这些改变随时间增加而逐渐加重;到48h时海马区轴索略有恢复,而胼胝体干部轴索排列紊乱持续加重;切片中可及多处轴索断裂和轴索回缩球形成。
见图1。
A.
B.
A:
12h时在胼胝体干处观察到的轴索断裂;B:
48h时在海马CAI/齿状回中间区域观察到得轴索回缩球。
两图中都可看到核周空泡变性。
图1.HE染色(400×)。
2.2Bielschosky染色
伤后3-6h,在损伤大鼠新皮质、胼胝体和海马区域可见轴突阶段性粗细不均,髓鞘肿胀扩张,纵行神经轴索之间空虚增宽,有大量嗜银较强的呈棕黑色的粗大轴突,但未见明显的轴突断裂和轴索回缩球形成。
伤后12h-24h,在上述区域可见粗大肿胀的轴突,行走迂曲,局部呈串珠样扩大,纵行纤维可见多处中断,末端膨大成索性,大小不一,即轴索回缩球形成。
伤后48h,轴索肿胀更加明显,程度更重,并可见多处轴索断裂和散在分布的轴索回缩球,其数量和密度也明显增多。
见图2。
A.
B.
A:
24h时胼胝体内排列紊乱的轴索。
B:
24h时新皮层下方白质纤维状断裂、扭曲的轴突,伴有轴索回缩球形成。
图2.Bielschosky染色(400×)。
2.3免疫组化染色
2.3.1β淀粉样前体蛋白(β-amyloidprecursorprotein,β-APP)
在对照组中,β-APP的整体光密度值(IOD)较低;伤后3h,大鼠新皮层及海马区域β-APP的整体光密度值已有显著增加(分别为p<0.05和p<0.01),尤其是海马区域β-APP的整体光密度值的增加最为显著(p<0.01);至伤后6h,大鼠新皮层、海马及胼胝体区域β-APP的整体光密度值都有显著性增加(均为p<0.01),一致持续到伤后48h。
见表1,图3。
表1.各组大鼠β-APP整体光密度值
组别
新皮层
海马
胼胝体
对照组
17.28±13.03
44.34±15.34
40.45±27.88
3h
190.99±87.02a
428.80±94.90b
59.81±26.66
6h
284.18±68.87b
531.72±64.41b
138.43±36.94b
12h
403.79±88.71b
798.46±177.93b
559.09±88.44b
24h
595.97±176.11b
988.12±144.76b
626.07±131.36b
48h
687.05±111.68b
893.65±202.32b
686.05±145.32b
ap<0.05,与对照组比;bp<0.01,与对照组比
A.
B.
A:
24h时胼胝体中β-APP的聚集,显示轴索回缩球形成;B:
48h时大脑皮质中β-APP的聚集,多在神经元细胞内分布。
图3.β-APP免疫组化染色图像(DAB显色,400×)
2.3.2肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)
与对照组相比,DAI大鼠伤后3h时,新皮层、海马和胼胝体区域的TNF-α的平均光密度值(OD)已显著增加(分别为p<0.05,p<0.05和p<0.01)。
在新皮层和海马,TNF-α的平均光密度值在12h到达顶峰(p<0.01);在胼胝体中,TNF-α的平均光密度值在6h到达最高峰(p<0.01);之后TNF-α的平均光密度值开始有所下降;至伤后48h,除新皮层外,海马和胼胝体中TNF-α的平均光密度值仍显著高于对照组(分别为p<0.01和p<0.05)。
见图4。
A.
B.
C.
A:
TNF-α免疫组化染色在新皮层新皮层、海马及胼胝体处的平均光密度值;ap<0.05,bp<0.01,均为与对照组相比;B:
3h时海马CA1/齿状回中间白质区域TNF-α的表达,其多分布在胶质细胞核周附件;C:
48h时胼胝体处TNF-α的表达,同海马内一样,该处的TNF-α也多沿胶质细胞核周分布。
图4.TNFα的免疫组化染色(DAB显色,400×)及平均光密度值
2.3.3白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)
DAI大鼠伤后3h,仅有海马内IL-1的平均光密度值有轻度上升(p<0.05),至伤后6h,大鼠大脑新皮层、海马和胼胝体内IL-1的平均光密度均显著升高(p<0.01),且都在伤后12h达到高峰(p<0.01);之后这些区域内IL-1的平均光密度值开始下降,但到伤后48h,其平局光密度值仍显著高于对照组(p<0.01)。
见图5。
A.
B.
C.
D.
A:
IL-1免疫组化染色在新皮层新皮层、海马及胼胝体处的平均光密度值,ap<0.05,bp<0.01,均为与对照组比;B:
伤后6h时IL-1在大脑新皮层能的表达,多集中于星形胶质细胞;C:
伤后12h时IL-1在海马CA1/齿状回中间区域的表达,集中于星形胶质细胞中;D:
伤后24h时IL-1在胼胝体中的表达,同样集中于星形胶质细胞内。
图5.IL-1的免疫组化染色(DAB染色,400×)及平均光密度值
2.3.4白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)
DAI后脑内IL-2的变化幅度相对较小。
伤后3h时,新皮层、海马和胼胝体内IL-2的平均光密度值均有所升高(分别为p<0.01,p<0.01,p<0.05),而之后其平均光密度值却开始降低,至伤后24h,只有新皮层内IL-2的平均光密度值仍较对照组偏高(p<0.01),而海马、胼胝体内IL-2的平均光密度值与对照组相比均无显著性差异(p>0.05);而在伤后48h时,三个脑区中IL-2的平均光密度值又再次升高,且与对照组相比具有显著性差异(p<0.01)。
见图6。
A.
B.
C.
A:
IL-2免疫组化染色在新皮层、海马及胼胝体处的平均光密度值,ap<0.05,bp<0.01,均为与对照组比;B:
伤后3h时IL-2在新皮层处的表达,阳性区域散在分布,光密度值较高,且部分阳性区域沿毛细血管周围分布;C:
伤后48h时IL-2在胼胝体处的表达,其多沿胶质细胞核周分布。
图6.IL-2的免疫组化染色(DAB显色,400×)及平均光密度值
2.4β-APP与TNFα、IL-1和IL-2的相关性
相关分析表明,β-APP的整体光密度值与TNFα的平均光密度值的相关系数为0.369,具有高度显著相关性(p<0.01);与IL-1的平均光密度值的相关系数为0.401,具有高度显著相关性(p<0.01);与IL-2的平均光密度值的相关系数为0.112,不具有显著相关性(p>0.05)。
3.讨论
弥漫性轴索损伤属于原发性闭合性脑损伤,是外伤引起的脑白质广泛性轴索损伤,在闭合性脑损伤死亡病人中占40%~50%[2]。
其临床特点为病情危重,昏迷时间长,伤残率和死亡率高。
最常见于车祸伤和高处坠落伤病人。
目前认为弥漫性轴索损伤可能是导致颅脑损伤病人伤后植物生存状态或严重神经功能障碍的最主要原因,临床至今尚无治疗颅脑伤后弥漫性轴索损伤的有效药物及措施[1,2]。
因此对其的基础和临床研究一直是颅脑损伤领域的热点和难点。
β-APP是一种跨膜蛋白,广泛存在于中枢神经系统内,通过轴浆快速转运机制运输的一种神经元成分。
在正常情况下,β-APP通过快速轴浆运输的方式在轴索中转运;尽管正常情况下并不能通过免疫组化方法检测的到,但在轴索受到损伤后,β-APP可在轴索损伤处快速聚集,很快达到可检测水平。
据报道,在伤后存活1.75~2个小时的DAI患者大脑中即可用免疫组化的方式检测到由β-APP聚集所形成的轴索回缩球[4]。
尽管后来又有报道指出要在DAI患者脑组织中通过免疫组化检测到β-APP患者需至少存活2~3个小时[5],但学术界仍一致公认免疫组化检测到β-APP聚集形成的轴索回缩球是诊断DAI的金标准[1,4,5],且该方法目前已广泛的应用到DAI的法医学诊断和动物实验中。
在该研究中,我们发现在大鼠伤后3h即可检查到β-APP整体光密度值的显著升高,一直持续到伤后48h,并伴有轴索回缩球的形成,这说明轴索损伤后β-APP的聚集在不断加重。
结合HE染色和Bielschowsky染色所观察到的伤后出现轴索排列的紊乱和轴索的肿胀、断裂和轴索回缩球的出现,这些证据都证明我们所制备的大鼠DAI模型是成功的。
炎症反应是TBI继发性损伤的重要机制[6],同其它部位的炎症反应一样,这一机制在中枢神经系统(centralnervoussystem,CNS)中主要由炎症细胞其所分泌的相关细胞因子等所介导;而关于炎症反应在DAI的继发性损伤中的作用的研究却不多。
值得注意的是,最近报道的一项研究发现在DAI早期也能观察到炎症细胞在DAI损伤位点(如皮质下白质、海马、胼胝体等处)的聚集,并有轴索损伤处小胶质细胞的激活[3],这一反应一直持续到慢性期,与轴索的断裂可能有一定的关系。
这一现象也直接引发了我们去考虑在DAI损伤中是否存在炎症因子合成和释放的上调,是否参与其后的继发性脑损伤。
TNF-α是TBI后早期介导继发性脑损伤的炎症因子,其
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