桑叶中多糖的提取与分析方法的研究.docx
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桑叶中多糖的提取与分析方法的研究
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本科生毕业设计[论文]
(华文中宋小初号加粗居中)
(题目)(黑体2号加粗居中)
桑叶中多糖的提取与分析方法的研究
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年月日(华文中宋3号居中)
学位论文原创性声明
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本人郑重声明:
所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。
除了文中特别加以标注引用的内容外,本论文不包括任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。
本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。
(宋体小4号)
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(黑体小2号加粗居中)
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2、不保密囗。
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(宋体小4号)
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年月日
导师签名:
年月日
(注:
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摘要
由于科技技术的不断进步以及人们生活水平的不断改善,保健营养品越来越受到人们的关注,尤其体现在原材料是否采用天然材料方面,而天生就具有美誉的“神仙草”——桑叶,便逐渐走入了人们的视野中,随着其市场的兴起,不少科学家、研究人员对桑叶进行了多方面的研究。
研究表明:
桑叶作为一种天然保健营养品,其有效成分较多,如黄酮、多糖、DNJ等等。
本文将多角度、深层次的对桑叶中的多糖成分进行剖析。
笔者首先通过文献资料查阅,熟悉了国内外对桑叶中多糖的研究较为权威结果,通过对比笔者将选择用苯酚-硫酸法进行多糖含量的测定工作。
关于采取何种方面提取桑叶中的堆糖,通常使用的方法为热水浸提法,也是经常被提及的水提法。
根据之前查阅资料显示,水提法在桑叶提取多糖实验中出现的频率最多。
经过多出实验最终得到水提法的最佳条件,即提取温度为80℃,持续两小时,共提取两次,液固比为30:
1,在上述假定情况下,提取得到的粗糖约0.306g,占桑叶总重的6.12%;接下来开始实施超声提取法,优化组合超声波功率、持续时间以及液固比这三个指标,进而得到最佳的提取条件。
经过实验得到最优的组合为:
功率采用300W,持续时间一刻钟,液固比为20:
1,最后得到粗糖物质共0.446g,占桑叶总重8.92%;接着笔者将对基于最佳的实验条件下提取的粗糖进行去除杂质、提高纯度,首先在粗糖中加10%的三氯乙酸溶液用于去掉粗糖中的杂质-蛋白质,然后通过过滤、浓缩等工序,最后加入95%的酒精后静置一段时间,通过过滤、沉积、烘干最后得到多糖产物,紧接着再用活性炭对多糖产物进行去色,之后再使用醇沉法提纯,笔者通过多次使用各不相同浓度的乙醇进行沉淀,实验表明,当且仅当乙醇浓度为80%时,沉淀的效果最佳,且能获得质量最多的多糖精品,称重得32.19mg,得率为10.52%;最后一步,将多糖精品溶解在0.5L的蒸馏水中相同条件下、相同处理流程得到的葡萄糖溶液在490nm处的吸光度为0.6201,然后可以通过计算得到多糖物质重量为12.5mg,经过测定计算,其多糖含量为38.8%。
关键词:
桑叶,多糖,紫外分光光度计,超声提取
Abstract
Withtherapiddevelopmentofscienceandtechnologyandtheimprovementoflivingstandards,peoplearepayingmoreandmoreattentiontonaturalhealthnutritionproducts,andthe“FairyGrass”thathasanaturalreputation,mulberryleaves,graduallyenterspeople’sfieldofvision.Withtheriseofitsmarket,manyscientistsandresearchershaveconductedvariousresearchesonmulberryleaves.Studieshaveshownthat:
Asanaturalhealthnutritionproduct,mulberryleaveshavemanyactiveingredients,suchasflavonoids,polysaccharides,DNJ,andsoon.Thisarticlewillbemulti-angle,deep-levelanalysisofpolysaccharidesinmulberryleaves.
Theauthorfirstconsultedtheliteratureandwasfamiliarwiththeauthoritativeresultsoftheresearchonpolysaccharidesinmulberryleavesathomeandabroad.Bycomparison,theauthorselectedthephenol-sulfuricacidmethodtodetectthepolysaccharidecontent.Theextractionofpolysaccharidesinmulberryleavesisperformedbyhotwaterextraction,whichisoftenreferredtoaswaterextraction.Accordingtothepreviousreview,thewaterextractionmethodhasappearedmostfrequentlyinthemulberryleafpolysaccharideextractionexperiment.Theoptimumextractionconditionsforwaterextractionweredeterminedasfollows:
extractiontemperature80°C,extractiontime2h,extractiontimes2times,liquid-to-solidratio30:
1duringextraction,andcrudesugarextractedundertheaboveassumptions.About0.306g,accountingfor6.12%ofthetotalweightofmulberryleaves;aftertheultrasonicextractionexperiment,settheultrasonicextractionpower,ultrasonicextractiontimeandextractionliquidsolidratioofthesethreeunivariatevariablestodeterminethebestultrasonicextractionprocessconditionsTheultrasonicextractionpowerwas300W,theultrasonicextractiontimewas25min,andtheliquid-solidratiowas20:
1.Atthistime,thecrudesugarproductwas0.446g,accountingfor8.92%ofthetotalmulberryleafweight;Thecrudesugarextractedundertheexperimentalconditionsisusedtoremoveimpuritiesandincreasethepurity.First,10%trichloroaceticacidsolutionisaddedtothecrudesugartoremovetheproteinfromtheproduct,andthenisleftstandingtofilter,andisconcentratedunderreducedpressure.After95%ethanolisadded,itisallowedtostandandfiltered.Aftertheprecipitateisdried,thepolysaccharideproductisobtained,andthentheactivatedcharcoalisusedtodecolorizethepolysaccharideproduct,andthenthealcoholisusedtopurifythesolution.Theauthorusesmultipledifferentconcentrationsofethanoltoprecipitate,andexperimentsareperformed.Ming,ifandonlyiftheethanolconcentrationis80%,thebesteffectofprecipitation,andcangetthemostqualitypolysaccharideboutique,weighed32.19mg,theyieldwas10.52%;thelaststep,dissolvethepolysaccharideboutiquein0.5LInthedistilledwater,theabsorbanceat490nmwasdeterminedtobe0.6201inthesameprocedureasthestandardcurveofglucose,andthemassofthepolysaccharideinthefinepolysaccharidewascalculatedtobe12.5mg.Aftercalculation,thepolysaccharidecontentwas38.8%.
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KeyWords:
Mulberryleaf,polysaccharide,ultravioletspectrophotometer,ultrasonicextraction
摘要Ⅰ
AbstractⅡ
1、绪论
1.1研究背景与意义
1.1研究的背景和意义
由于现在人们的生活水平不断得到改善,人们越来越注重自己的身体健康问题。
这就使得当下一些古老的医疗保健用品渐渐不能达到人们的要求,另外,一些医疗保健品的加工过程繁琐工艺复杂,往往被认为在生产过程中杂质过多,人们通常不会考虑购买。
在一定程度上,人们越来越偏爱采用天然材料的生产的医疗保健品,此时,自然界的动物以及植物作为医疗保健品的原材料越发得到人们的关注,越来越多的科研人员开始重视并且开展了许多研究分析工作。
通过翻阅相关的科学技术文献以及相关的研究报告,可以发现:
在动物以及植物中蕴含了相当多的生物活性物质,比如:
一些生物碱、多糖类物质、酶类等物质,这些物质起到维持个体的正常的生命活动,使得个体饱含生命活力,因此上述的物质被人们视为人体必需的健康因子,在保持人体健康方面起到相当大的作用。
在上述的生物活性物质中,人体最为需要以及最重要的就是多糖类物质。
对于多糖而言,其本质上是一种由生物产生的高分子化合物,其能够起到相当多的生物活性作用并且还能够起到一起保健作用。
因此,对于当前市面上在售的大部分药物以及保健品而言,多糖基本上是它们的主要组成物质,可见其功能作用较多并且地位相当高。
除了起到预防和治疗某些疾病的作用,还可以在治疗癌症方面发挥一定的效果。
对此,不少科研机构加大对多糖的研究并做了相应的实验,多糖以其市场潜力以及价值越发吸引人们的注意力,研究以及留意该物质的人士日益增多。
另外,生物利用糖类生成组织等身体机构,同时也为日常的生命活动供能,是主要的供能原料。
糖类物质的生物学功能说明在生物的正常生命过程中糖类起到相当重要的作用,可以说是生物不可或缺的生命基础。
在自然界,多糖的载体相当丰富,怎样选择检测标本进而有利于检测是一个值得研究以及商榷的事情。
笔者在翻阅相关文献资料的基础上,了解到桑叶中多糖物质的有待深入的研究分析。
中国种植桑树的历史相当悠久,桑树的种植持续了上千年,到今天也得到了广泛的种植。
可以说桑叶的获取相当容易,来源十分丰富,种类也是相当多。
研究产量丰富、材料易得的桑叶是一个比较好的课题,经过对其细胞中的多糖类物质的研究,并经过提取提纯处理后展开相关的实验,接下来一步一步确定该物质最有效的提取条件,这种提取工艺具有相当高的价值。
所以,对桑叶细胞中的多糖物质进行相关的研究并进行提取处理具有相当大的价值。
多糖拥有的具体生物活性有以下五点明显作用:
1、提高免疫力;世界各国都有相关的权威研究证实,多糖能在一定程度上提高机体的免疫能力,因为多糖的结构会很大程度决定多糖的功能,所以,架构不一样的多糖存在很多不一样的免疫作用。
在香菇多糖辅助淋巴T细胞之下,如若机体收到刺激,将更快的参与生理反应。
尤其是癌细胞产生或者入侵时,其还有能力帮助机体更快的修复免疫功能。
2、降低血糖、血脂:
当代人类的三大疾病之一——糖尿病,其本质是因为内分泌物造成的。
借助细致的分析后能知道,多糖是借助增强小鼠体内胰岛的分泌能水平,是的胰岛素产生的数量增加,从而提高或者减小有关酶的活性从而达到降低血糖的功能;遗憾的是,当前使用多糖进行降血糖还只是在临床试验阶段,且部分工艺还有待提高,还未能达到能正式使用的阶段。
3、抵抗肿瘤活性:
有许多多糖物质都具有一定的抗肿瘤活性,当前,人们已经可以通过细菌、真菌等提取得到这类多糖,而且还有不少数具有高抗肿瘤活性的多糖已经进入了临床试用阶段,我们有理由相信,多糖在抗肿瘤活性方面的研究将迎来新的春天。
4、抗辐射:
部分多糖能或多或少的提升抗辐射水平。
曾经有人做过实验,设置两组小白鼠,A组不作要求,B组输入茶叶多糖,将两组放在相同实验条件下进行辐射剂量大小一致的照射,结果表明B组的小白鼠成活率比A组高33%。
5、其他作用:
由于对多糖的了解还有待深入,所以当前人们也没有对其知根知底的了解,在其他作用方面,有比较显著的效果有:
海带多糖能起到减肥作用;九里香多糖能对生物体的损伤进行修复;等等。
总的来说,多糖目前的研究已经给人们带来了诸多便利,这也是为什么越来越多的人加入到多糖的研究中,同时多糖也是人体维持正常生命活动的必要物质,而且其对于一些顽疾也有着特殊医疗效果,无论从药品角度,还是从保健品角度,多糖的使用还有很大的发展空间。
1.2多糖的研究进展
1.2多糖的研究进展
多糖(polysaccharides),即多聚糖。
从其微观组织上来看,是由十个以上单糖连接而成,其中起到连接作用的主要是苷键。
不过通常情况下,多糖所包含的单糖基均在百个乃至千个以上、多糖虽然由单糖组成,但是与单糖相比,多糖的性质有着极大的改变,而这种改变中最明显的两点便是单糖本身所含有的甜味以及强还原性比较小。
多糖有多种不同的分类方法,结合本文的研究,笔者从多糖在生物体内的功能出发,对多糖进行分类,主要分为不可溶于水以及储存养料两种。
其中不溶于水的主要是动物的支持组织,从结构上来看,这种支持组织以直链型居多,而主要用于储存养料的多糖多是可溶于水的,尤其是在热水之中,其能够迅速的溶于其中,并且发生反应之后呈现出胶体溶液之态,在其呈该种状态之下,通过酶催化,能够产生出淀粉等,这种多糖分析接够可以促进植物的生长。
均多糖(homosaccharide),是多糖的一种,也可以将其看成由单一一种单糖所组成的,如果是由多种类型的单糖所组成的,那么这种类型的多糖便被称为是杂聚唐。
多糖存在的范围极广,并且存在的地方不一,在动物体内,多糖多存在于体细胞膜之内,而在植物体内则多糖存在于细胞壁之中。
另外,因为构成多糖的结构不一,所以种类极多,单从自然界不同动植物中提取的多糖就有数百种,如鲨鱼软骨多糖、仙人掌多糖等。
多糖出现在所有动植物和微生物细胞壁中。
一个多世纪前,德国化学家E.Fischer研究出糖类以及其复合分子在生物功能上是独特性,为后来人们探索糖类应用奠定了重要基础。
在20世纪 50年代,通过相关相关学者的探讨,人们发现了真菌多糖拥有令人惊喜的抗癌活性,能够起到一定程度的抗癌效果,从此人们对多糖化学特性领域的研究更加关注。
紧接着,诸多表明糖类物质的重要构成——多糖类物质具有与众不同的生物活性功能的研究纷纷见诸于世。
截止目前,在多糖化学特性研究领域已经取得了很多成果。
Glombitza KW等学者在探究中得出结论:
分离酸枣仁丁醇提取物所得到的 Christinin A能够借助其所含有的皂甙糖,使糖尿病鼠模型的糖水平与肝磷酸化酶活性降低、令清胰岛素含量和肝糖原量有所提高。
Tomoda M等学者的研究证明植物粘液具有降血糖的功能。
Isiguld K.以18名糖尿病患者作为实验对象,安排其在饭后饮用含茶多糖的饮料,经过4周的试验期,对其糖基化血红蛋白值和血糖含量进行二次检测,得出糖基化血红蛋白值和血糖含量检测有显著降低。
Konnoc等学者则在大量研究基础上从人参中分离出人参多糖,多达21中,并在对其进行作用测试后发现,人参多糖能够在很大程度上减少患有四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖含量。
随着新世纪的到来,科技和生产力的发展促使了细胞学和生物学的发展,加上仪器的精密度提高和分析技术的更为地科学,我们对于糖类的研究也更为深入,也逐步建立了关于糖类的研究学科,对于多糖功能的了解也更为全面具体。
故而可以说,我们已进入了“多糖生命科学”的时代。
1.3多糖的化学组成及结构
我们常说的糖类实际上主要是碳水化合物组成的,碳水化合物是碳原子上附带了很多的多羟基醛或者多羟基酮,其也可以称为利用水解生成多羟基酮(或醛)的类化合物。
以糖类的组成结构和性质能够将其分类,主要有以下几类:
第一类是单糖,第二类是二糖,第三类是寡聚糖,最后一类是多糖。
对糖分子加以分析,我们不难发现,一个糖分子当中还含有若干个原子,这些原子的特点是非对称,这也是导致大多数的糖分子具有旋光性特点的原因。
如图1-1和1-2所示,其为单糖D一葡萄糖以及D—葡萄糖醛酸的结构示意图。
图1-3则是多糖纤维素的结构示意图。
可见,多糖纤维素的链接是有众多直链葡萄糖作为媒介进而形成的。
因此,关于多糖我们可以得出这样的结论:
由多个单糖彼此之间依靠苷键连接起来相互组成了多糖。
而这些单糖连接的方式是不一样的,不同的连接方式会导致形成的多糖也不一样,多糖根据单糖的连接方式可以分为三类,主要的类型有:
直链多糖、叉链多糖以及环状多糖。
图1-1D-葡萄糖图1-2D-葡萄糖醛酸图1-3纤维素
多糖的不同类型还取决于构成其单糖的种类、单糖的比例,而一个糖分子上面所含有的原子的基团与数量位置等也会影响最后形成的多糖的种类。
当然也会因为其所含苷键类型、比例以及其支链大小而异,多糖在结构上比蛋白质的结构更为复杂多样,究其原因主要是能够组成多糖的那些单糖具有很多的种类,哪拍是只有一种单糖,不同的连接方式也可能会致使其产生分支,当然,蛋白质是没有分支的。
正因为以上原有,多糖有很多种结构,对这些结构进行归类划分的话,可以划分出四种,分别是:
首先是第一种类型,一级结构:
对于糖基而言,它一般是构建在一级结构上面的,当处于一级结构的时候,糖基的排列顺序是由特定序列的,判断是否为一级结构的时候要观察相邻的糖基之间连接的方式特点,如果连接方式有分枝的话,分枝在什么位置以及该分支的长短特点是什么。
如果拿蛋白质与其比较的话,蛋白质的结构相对来说都算是简单的。
可见糖的一级结构是多么的复杂。
接着是第二种类型,二级结构:
多糖的二级结构实际上是一种聚合体,主要是由多糖的骨架彼此连接而成,这种连接是通过氢键的方式连接起来的。
与一级结构的连接方式不同,二级结构的主要是多糖分子中主链的构象,与侧练无关,因为侧链没有参与到二级结构的空间排布中。
而在结构排列中。
一级结构是二级结构的基础。
其次是第三种,三级结构:
三级结构也可以理解为非共同价作用的产物,这种共同价是因为一级结构中唐单位的羧基、氨基或硫酸基相互作用产生的。
因此导致了原本有序的二级结构出现了有规则而粗大的改变所形成的构象。
最后是第四种,四级结构:
四级结构也是为供价作用形成的,而这种是多种聚集体的集合,是由于多个多聚链通过非共价产生的。
这种多糖链并不是只存在于相同的分子之间,不同的分子之间也可可能会形成聚集作用。
单糖残基如果是按照单一的个体来观察的话,可以发现在空间上面主要呈现多糖的结构形态特点。
进一步研究观察这些空间等位置特点,对于研究多糖生物是有着重要的意义的。
1.4研究内容
1.4.1多糖的提取方法研究
多糖的提取方法众多,也各有特点,最具代表性和实操性的有以下五种:
1)热水浸提法:
上个世纪多用此类方法提取多糖,是一种传统方法。
其原理是:
可提取物质易溶于水,通过过滤或离心将其与不溶物分离。
优点:
设备易获得,易操作,环保可靠。
缺点:
热水浸取法的过程需要数吨水,而且也要大量的使用乙醇进行醇沉淀,最后由于时间和温度也会对多糖产物的结构有或多或少的影响。
2)超声波提取法:
对于超声波而言,它在对多糖进行提取的时候,一般是按照是空化效应来得到的。
如果液体里有特别小的核心,那么就会因为超声波的刺激而不断地被激活,从而导致收缩等现象,由此造成液体里出现高压等情况。
按照“先扭曲,再中断,最后释放”包裹物的顺序来减少提取时间。
优点:
操作实验过程段,效率很高。
缺点:
此法只能在实验室中实现,大量的工业生产不可行。
3)微波提取法:
顾名思义,此法需要微波辐射来完成,微波能够对溶剂产生作用,它能够通过细胞壁从而渗透到细胞内部。
细胞液以及溶剂会能量进行有效的吸收,而且如果当压力大于了细胞壁容积能力的时候,细胞壁就会撑破,会形成诸多小孔,而活性物质就会通过小孔释放出来。
4)酶解提取法:
此法是通过酶具有专一性、高效性来实现的。
酶解提取法可以无视细胞壁对多糖的阻挡,从而能够得到快速的释放,如此可以将成分提取出来。
在所有的反应过程里,它都存在特别温和的条件,能够最大程度地对生物活性进行保障,具备特别大的潜力。
按照提取阶段里酶的使用情况能够知道,一般都包含了下列两类不同的方法:
单酶提取法以及复合酶提取法。
随着生物工程和技术的快速
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