基因枪法将Bhlea2基因导入玉米的初步研究.docx

基因枪法将Bhlea2基因导入玉米的初步研究.docx

《基因枪法将Bhlea2基因导入玉米的初步研究.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因枪法将Bhlea2基因导入玉米的初步研究.docx（4页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

基因枪法将Bhlea2基因导入玉米的初步研究

基因枪法将Bhlea2基因导入玉米的初步研究

摘要：

构建了牛耳草（ｂｏｅａｈｙｇｒｏｍｅｔｒｉｃａ）胚胎发育晚期丰富蛋白基因（ｂｈｌｅａ２）的植物表达载体ｐｙｌ１，以玉米（ｚｅａｍａｙｓｌ．）自交系５０１的愈伤组织为受体，利用基因枪法将ｂｈｌｅａ２基因导入，获得５１株抗性植株，经ｐｃｒ检测有１０株阳性植株，阳性率为１９．６％，初步证明外源基因已整合到玉米基因组中。

关键词：

玉米（ｚｅａｍａｙｓ）；愈伤组织；ｂｈｌｅａ２基因；基因枪法ｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｂｈｌｅａ２ｇｅｎｅｉｎｔｏｍａｉｚｅｂｙｐａｒｔｉｃｌｅｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔｚｏｕｌｕ－ｌｉｎ１，２，ｗｅｉｊｉａｎ－ｈｕａ２，ｚｈａｎｇｓｈａｏ－ｂｉｎ１，ｗａｎｇｈｏｎｇ－ｚｈｉ２（１．ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｃｉｅｎｃｅａｎｄｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｃｏｌｌｅｇｅ，ｓｈｅｎｙａｎｇａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｓｈｅｎｙａｎｇ１１０８６６，ｃｈｉｎａ；２．ｂｅｉｊｉｎｇａｇｒｏ－ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｒｅｓｅａｒｃｈｃｅｎｔｅｒ，ｂｅｉｊｉｎｇａｃａｄｅｍｙｏｆａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄｆｏｒｅｓｔｒｙｓｃｉｅｎｃｅ，ｂｅｉｊｉｎｇ１０００９７，ｃｈｉｎａ）ａｂｓｔｒａｃｔ：

ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐｙｌ１ｏｆｂｈｌｅａ２ｇｅｎｅｆｒｏｍｂｏｅａｈｙｇｒｏｍｅｔｒｉｃａｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．ｔｈｅｂｈｌｅａ２ｇｅｎｅｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｌｕｓｏｆｍａｉｚｅ（ｚｅａｍａｙｓ）ｉｎｂｒｅｄｌｉｎｅ５０１ｂｙｐａｒｔｉｃｌｅｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ．５１ｐｌａｎｔｓｗｉｔｈｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄａｎｄ１０ｏｆｔｈｅｍｗｅｒｅｃｏｎｆｉｒｍｅｄｐｏｓｉｔｉｖｅｂｙｐｃｒａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ｔｈｅｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆｐｏｓｉｔｉｖｉｔｙｗａｓ１９．６％，ｉｔｗａｓｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙｐｒｏｖｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｔｒａｎｅｏｕｓｇｅｎｅｈａdｂｅｅｎｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｉｎｔｏｍａｉｚｅｇｅｎｏｍｅ．ｋｅｙｗｏｒｄｓ：

ｍａｉｚｅ（ｚｅａｍａｙｓ）；ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｌｕｓ；ｂｈｌｅａ２ｇｅｎｅ；ｐａｒｔｉｃｌｅｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ玉米（ｚｅａｍａｙｓｌ．）是全球最重要的粮、经、饲三元作物，我国玉米的总产量仅次于水稻，占世界总产量的２０％左右，同时，我国也是玉米的第一消费大国［１］。

然而，由于气候、地理以及玉米自身的水分生理状况等原因，干旱已成为限制玉米高产稳产的主要非生物胁迫因素之一［２－８］。

目前，通过转基因手段培育耐旱品种，改良玉米干旱胁迫耐受性是最为有效的途径之一［９，１０］。

胚胎发育晚期丰富蛋白（ｌｅａ蛋白）是一类高度亲水的小分子蛋白质，在植物和动物中广泛分布，大多与细胞脱水过程密切相关。

很多ｌｅａ蛋白在成熟的种子中积累，在种子萌发后迅速消失。

ｂｈｌｅａ２基因是复苏植物苦苣苔科旋蒴苣苔属植物牛耳草（ｂｏｅａｈｙｇｒｏｍｅｔｒｉｃａ（ｂｕｎｇｅ）ｒｂｒ．）中ｌｅａ蛋白的编码基因，在烟草中过量表达可显著提高转基因烟草的耐旱性［１１－１６］。

目前，基因枪介导的转基因方法较为完善［１７］，本研究利用基因枪法将耐旱基因ｂｈｌｅａ２导入玉米的愈伤组织，为提高玉米耐旱性的研究奠定基础。

１材料与方法１．１材料与试剂供试品种为玉米自交系５０１（京玉７号－５０１／京２４的亲本之一），供试原始质粒载体为ｐｂｉｎ１９－ｂｈｌｅａ２、ｐｕｂｉ－ｂａｒ和ｐｂｐｃ２６，由北京农业生物技术研究中心保存。

限制性内切酶、ｔａｑｄｎａ聚合酶、ｉｐｔｇ、ｘ－ｇａｌ等购自大连宝生物工程有限公司（ｔａｋａｒａ）；高保真ｔａｑ酶和ｋｏｄ酶购自东洋纺（上海）生物科技有限公司；ｐｇｅｍｒ－ｔｅａｓｙｖｅｃｔｏｒ、ｔ４ｄｎａ连接酶购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司；质粒提取试剂盒、ｄｎａ凝胶回收试剂盒、基因组ｄｎａ提取试剂盒及ｄｎａ电泳ｍａｒｋｅｒ购自天根生化科技（北京）有限公司和北京全式金生物技术有限公司；氨苄青霉素购自北京奥赛博科技发展有限公司。

诱导、继代培养基：

ｎ６基本培养基＋１００ｍｇ／ｌ肌醇＋２ｍｇ／ｌ２，４－ｄ＋１０ｍｇ／ｌａｇｎｏ３＋３０ｇ／ｌ蔗糖＋４ｇ／ｌｐｈｙｔａｇｅｌ；筛选培养基：

诱导培养基＋２ｍｇ／ｌｂａｒ；分化培养基：

ｎ６基本培养基＋１００ｍｇ／ｌ肌醇＋０．５ｍｇ／ｌａｇｎｏ３＋１．５ｍｇ／ｌｋｔ＋３０ｇ／ｌ蔗糖＋４ｇ／ｌｐｈｙｔａｇｅｌ＋１ｍｇ／ｌｂａｒ；生根、壮苗培养基：

１／２ｍs基本培养基＋１００ｍｇ／ｌ肌醇＋３０ｇ／ｌ蔗糖＋４ｇ／ｌｐｈｙｔａｇｅｌ＋０．５ｍｇ／ｌｎａａ＋２ｍｇ／ｌ多效唑。

１．２方法１．２．１ｂｈｌｅａ２基因表达载体的构建利用ｐｃｒ方法，以ｐｂｉｎ１９－ｂｈｌｅａ２质粒为模板克隆ｂｈｌｅａ２基因。

根据已知的ｂｈｌｅａ２基因序列（ｇｅｎｂａｎｋ序列号ｅｕ６６９１８４）设计引物：

上游引物５’－ｇｇａｔｃｃａｔｇｃａｇａｃｔｇｃｇａａｇｃ－３’，下游引物５’－ｇｇｔａｃｃｃｔａｃｔｇａｇｔｃｇｇａｇｃｔ－３’（划线序列分别是ｂａｍｈⅰ和ｋｐｎⅰ酶切位点）。

依ｋｏｄ扩增系统说明书扩增ｂｈｌｅａ２基因，反应条件为：

９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，５３℃退火３０ｓ，６８℃延伸３０ｓ，３０个循环；６８℃延伸１０ｍｉｎ。

目的片段长度为４０２ｂｐ，经测序和酶切验证后，构建表达载体ｐｙｌ１，如图１所示，该表达载体目的基因ｂｈｌｅａ２由uｂｉｑｕｉｔｉｎ启动子驱动，同时以uｂｉｑｕｉｔｉｎ驱动的ｂａｒ基因作为选择标记基因。

１．２．２玉米基因枪转化取授粉后８～１４ｄ的玉米果穗，剥去苞叶，用７５％乙醇消毒５ｍｉｎ，灭菌水冲洗３次后，挑出幼胚（１～２ｍｍ），盾片朝上接种于诱导培养基中，２５℃暗培养，直到诱导出胚性愈伤组织，将胚性较好的愈伤组织直接接到继代培养基上。

制备微弹ｄｎａ，调整ｄｎａ浓度为１ｇ／ｌ，按ｂｉｏｒａｄｐｄｓ－１０００／／ｈｅ型气动式基因枪说明轰击愈伤组织。

将轰击后的愈伤组织接于新的继代培养基上恢复５ｄ左右，转接于筛选培养基上暗处筛选培养，连续筛选３次，每次２～３周。

然后选取抗性愈伤组织转入分化培养基，２６℃光照培养。

待苗长到３～４ｃｍ时，移至生根壮苗培养基中。

１．２．３再生植株的移栽将无菌苗置于温室中，向培养基中倒入少许自来水，炼苗３ｄ，用自来水冲掉培养基，移入经高温灭菌的土壤（蛭石、田间土、草炭土、河沙的体积比为３∶１∶１∶１）中，待植株成活后移入田间。

１．２．４转基因玉米植株的ｐｃｒ检测提取转化植株的基因组ｄｎａ，以非转基因植株为阴性对照，ｐｙｌ１质粒为阳性对照，水为空白对照，用目的基因的引物进行ｐｃｒ扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

２结果与分析２．１植物表达载体的构建琼脂糖凝胶电泳检测显示ｐｃｒ扩增的目的片段长度约为４００ｂｐ（图２）。

将得到的片段回收后克隆到ｐｇｅｍｒ－ｔｅａｓｙ载体上，委托上海英骏生物技术有限公司测序。

将该片段插入经ｂａｍｈⅰ和ｋｐｎⅰ酶切后回收的ｐｕｂｉ－ｂａｒ载体，经ｈｉｎｄⅲ酶切回收ｕｂｉ－ｌｅａ－ｎｏｓ，连入经ｈｉｎｄⅲ酶切后回收的ｐｂｐｃ２６载体中，获得ｐｙｌ１载体，经ｈｉｎｄⅲ酶切验证正确（图３）。

２．２转基因玉米的获得用基因枪系统对优良玉米自交系的胚性愈伤组织进行转化，经筛选、分化后共获得５１株抗性植株，经分子检测后转入温室中培养（图４）。

２．３转基因植株的ｐｃｒ检测提取转化植株叶片的基因组ｄｎａ进行ｐｃｒ扩增检测（部分结果见图５），其中１０株幼苗呈阳性反应，阳性率达１９．６％，初步证明外源基因已整合到玉米基因组中。

３小结与讨论寻找高效的植物抗旱基因资源是目前提高农作物抗旱性、实现农业可持续发展的重要举措。

生长在干旱环境中的复苏植物具有耐极端干旱的特性，是宝贵的耐旱基因资源。

与大多数植物采取吸水、保水、用水的策略不同，复苏植物在干旱时会快速失水以达到一种类似休眠的状态，在水分适宜时又迅速恢复生活状态，继续其生活史。

很多研究发现ｌｅａ蛋白编码基因在种子成熟期特异表达，而已有的研究显示复苏植物牛耳草中的ｌｅａ蛋白编码基因ｂｈｌｅａ２既在种子脱水成熟期表达，又在营养组织中参与胁迫诱导表达，并且已证明过量表达ｂｈｌｅａ２基因可显著提高转基因烟草的耐旱性［１２，１３］。

本研究通过基因枪法将该基因转入玉米，以获得耐旱性较好的转基因玉米株系，目前通过ｐｃｒ检测初步鉴定外源基因已整合到玉米基因组中，后期的表型鉴定工作还在进行中。

参考文献：

［１］杨东歌，杨凤萍，陈绪清，等．外源脱水应答转录因子ｃｂｆ４基因转化玉米的获得［ｊ］．作物学报，２００９，３５（１０）：

１７５９－１７６３．［２］胡瑞法，ｍｅｎｇｅｃｈ，张世煌，等．采用参与式方法评估中国玉米研究的优先序［ｊ］．中国农业科学，２００４，３７（６）：

７８１－７８７．［３］陈梅．以玉米幼胚为受体转化海藻糖合成酶基因［ｄ］．成都：

四川农业大学，２００８．［４］梁涛，刘景利．水分胁迫对玉米生长发育和产量的影响［ｊ］．安徽农业科学，２００９，３７（３５）：

１７４３６－１７４３７．［５］张梅，刘炜，毕玉平．植物中ｄｒｅｂｓ类转录因子及其在非生物胁迫中的应用［ｊ］，遗传，２００９，３１（３）：

２３６－２４４．［６］ｎｅｕｍａｎｎｐｍ．ｃｏｐｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｆｏｒｃｒｏｐｐｌａｎｔｓｉｎｄｒｏｕｇｈｔ－ｐｒｏｎｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ［ｊ］．ａｎｎａｌｓｏｆｂｏｔａｎｙ，２００８，１０１（７）：

９０１－９０７．［７］ｔｏｌｄｉｏ，ｔｕｂａｚ，ｓｃｏｔｔｐ．ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅｄｅｓｉｃｃａｔｉｏｎｔｏｌｅｒａｎｃｅ：

ｉｓｉｔａｇｏｌｄｍｉｎｅｆｏｒｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｃｒｏｐｓ？

［ｊ］．ｐｌａｎｔｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，１７６（２）：

１８７－１９９．［８］ｍｏｏｒｅｊｐ，ｌｅｎｔ，ｂｒａｎｄｔｗｆ，ｅｔａｌ．ｔｏｗａｒｄｓａｓｙｓｔｅｍｓ－ｂａｓｅｄｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｏｆｐｌａｎｔｄｅｓｉｃｃａｔｉｏｎｔｏｌｅｒａｎｃｅ［ｊ］．ｔｒｅｎｄｓｉｎｐｌａｎｔｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，１４（２）：

１１０－１１７．［９］李楠．抗旱基因ｈｖａ１在烟草及玉米中遗传转化的研究［ｄ］．北京：

首都师范大学，２００７．［１０］孙传波，曲文利，姜志磊，等．农杆菌介导向玉米茎尖导入ｈａｌ１基因的初步研究［ｊ］．玉米科学，２００９，１７（６）：

３２－３４．［１１］吴仁花，王丽丽，王智，等．复苏植物牛耳草引导蛋白基因的克隆与表达［ｊ］．自然科学进展，２００８，１８（１０）：

１１１１－１１１８．［１２］ｌｉｕｘ，ｗａｎｇｚ，ｗａｎｇｌ，ｅｔａｌ．ｌｅａ４ｇｒｏｕｐｇｅｎｅｓｆｒｏｍｔｈｅｒｅｓｕｒｒｅｃｔｉｏｎｐｌａｎｔｂｏｅａｈｙｇｒｏｍｅｔｒｉｃａｃｏｎｆｅｒｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏ［ｊ］．ｐｌａｎｔｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，１７６（１）：

９０－９８．［１３］刘霞，邓馨．复苏植物牛耳草ｂｈｌｅａ２基因启动子的分离和基因表达模式研究［ｊ］．自然科学进展，２００９，１９（１）：

３９－４４．［１４］ｊｉａｎｇｇｑ，ｗａｎ