微机模拟蛋白质纯化实验.docx
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微机模拟蛋白质纯化实验
微机模拟蛋白质纯化实验
一、实验目的:
1.了解模拟生化干实验的方法和意义,掌握用protein软件提纯蛋白质的方法。
2.进一步熟悉层析、热变性、盐析等常用生化分离方法的原理和应用。
二、实验原理:
“Protein”软件有36个任务,即36组待分离纯化的蛋白。
任务要求利用软件提供的几种实验技术,提纯每一个目的蛋白,最终达到单向电泳一条带,双向电泳一个点,而且使用的人时和经费(根据提取步骤计算得到)不得超过一个特定值。
在每个任务开始时,软件给出目的蛋白的一些性质,如热稳定的温度范围和pH稳定范围等,利用这些信息,可以使实验少走弯路。
“Protein”提供的分离纯化方法有七种:
①热变性;②硫铵沉淀;③排阻层析(凝胶色谱);④离子交换层析;⑤吸附层析;⑥聚焦层析;⑦制备电泳。
在“Protein”所提供的各种分离纯化方法中,热变性法和盐析法是比较好的粗提方法,在提纯的早期使用效果较好。
层析是各种方法中最强有力的方法,制备电泳虽然纯化倍数高,但是回收率低。
在各种层析方法中,又以离子交换层析最为有效和易于使用,并且耗费的人时和经费也较少。
排阻层析和聚焦层析耗费较大,但在某些特定情况下,这两种方法是不可替代的。
“Protein”提供了四种电泳方法:
即,SDS-PAGE、PAGE、等电聚焦电泳和双向电泳。
这些电泳方法不但可以用以检测样品的纯度,而且也给出了样品的一些信息,如分子量、等电点等,这些信息对于后续提纯有重要的参考价值,等电聚焦电泳和PAGE还可以用于制备。
本实验要求完成实验软件中三种酶的分离纯化。
三、实验步骤:
实验中为了比较在样品性质不同情况下,如何有效分离,以及各种方法的优劣,拟分离如下三种样品:
1.pH稳定范围较大的蛋白(Windows1号酶)
2.酸性条件下稳定的蛋白(Windows3号酶)
3.碱性条件下稳定的蛋白(Windows36号酶)
1.pH稳定范围较大的蛋白(Windows1号酶)
1号酶在50度下稳定,稳定范围2-11(稳定范围较大)
(1)分离纯化步骤:
先通过DI-DEM看一下样品的情况:
pH3~10,分离胶浓度10%(体积分数),浓缩胶浓度3%(体积分数)
由图片可以看出,杂蛋白含量比较少,各种蛋白的Mr和pI相差较大。
A.硫铵沉淀法初始百分饱和度0,终末饱和度50%,收集沉淀
B.离子交换层析:
填料:
DEAE-SephadexA-50,柱长=10CM,柱内径=2CM;
缓冲体系:
乙酸-乙酸钠(pH3.6-5.8),pH4.4,流速0.3ml/min;
离子强度梯度洗脱:
0.01mol/L-0.15mol/L,洗脱体积:
300ml。
(如下图)
洗脱曲线如下图:
由洗脱曲线可以看出,目的酶和杂蛋白有一定的重合,可以通过收集来避免一些杂蛋白的干扰,收集70-95ml的组分,做如下检验。
(2)检测纯化结果:
A.二维电泳:
pH3-10,分离胶浓度10%(体积分数),浓缩胶浓度3%(体积分数)
已达一个点的要求。
B.PAGE缓冲体系:
乙酸-乙酸钠(3.6-5.8),pH=5
结果显示一条带,证明纯化效果不错。
再用SDS-PAGE对比一下。
C.SDS-PAGE:
分离胶浓度10%(体积分数),浓缩胶浓度3%(体积分数)
经检验,发现有两条很近的带,故目的蛋白提纯不够彻底,应对收集到的70-95ml的组分继续用离子交换层析。
(3)第二次离子交换层析:
填料DEAE-SephadexA-50,柱长:
10cm,柱内径:
2.0cm,
缓冲体系:
磷酸氢二钠-Citrate(2.2-8.0),pH4.3,流速:
0.3ml/min,
离子强度梯度洗脱:
0.01mol/L-0.15mol/L,洗脱体积:
300ml。
(如下图)
洗脱曲线如下:
收集10-40ml组分后进行蛋白质纯化检测
(4)第二次检测纯化结果:
A.二维电泳,pH3~10,分离胶浓度10%(体积分数),浓缩胶浓度3%(体积分数)
已达到一个点的要求。
B.PAGE缓冲体系:
乙酸-乙酸钠(3.6-5.8),pH=5
用PAGE检验,已达到一条带的要求,作为对比再用SDS-PAGE检验。
C.SDS-PAGE:
分离胶浓度10%(体积分数),浓缩胶浓度3%(体积分数)
SDS-PAGE检验结果显示,有一条带。
此次分离效果很好,整体的分离效果比较好,花费较少。
(5)实验结果分析:
1号目的酶的Mr约为29000,PI=4.4。
稳定pH2~11,稳定温度<50℃。
2.酸性条件下稳定的蛋白(Windows3号酶)
3号酶在62℃以下稳定,稳定pH范围3.8~5.8(酸性条件)
(1)分离纯化步骤:
先通过DI-DEM看一下样品的情况:
pH3~10,分离胶浓度10%(体积分数),浓缩胶浓度3%(体积分数)
由图片可以看出,杂蛋白含量比较少,各种蛋白的Mr和pI相差较大。
我们可以利用热变性或者是硫铵沉淀的办法进行初提纯处理。
A.热变性:
水浴温度61℃,水浴时间60min,可以得到22.162g,99%的酶活力初提取效果很好。
B.硫铵沉淀:
初始百分饱和度40%,终末百分饱和度80%(质量分数),收集沉淀组分。
C.吸附层析:
填料Bio-GelHTP,柱长:
35cm,柱内径:
2.0cm,
缓冲体系:
乙酸-乙酸钠(3.6-5.8),pH5.0,流速:
0.3ml/min,
离子强度梯度洗脱:
0.02mol/L-0.30mol/L,洗脱体积:
300ml
洗脱曲线如下:
由洗脱曲线可以看出,目的酶和杂蛋白有一定的重合,可以通过收集来避免一些杂蛋白的干扰,收集72-96ml的组分,做如下检验。
(2)检测纯化结果:
二维电泳:
pH3-10,分离胶浓度10%(体积分数),浓缩胶浓度3%(体积分数)
出现两个点,不符合要求,进行凝胶层析分析。
(3)凝胶层析:
填料SephadexG-75,柱长:
100cm,柱内径:
2.0cm,
缓冲体系:
磷酸氢二钠-Citrate(2.2-8.0)pH5.6,浓度0.02mol/L,流速:
0.3ml/min,
洗脱曲线如下
收集290-340ml的组分,做如下检验。
(4)第二次进行蛋白纯化检验:
A.二维电泳:
pH3-10,分离胶浓度10%(体积分数),浓缩胶浓度3%(体积分数)
已达到一个点的要求。
B.PAGE缓冲体系:
分离胶浓度10%(体积分数),浓缩胶浓度3%(体积分数),缓冲体系:
磷酸二氢钾-NaOH,pH8.0
用PAGE检验,已达到一条带的要求,作为对比再用SDS-PAGE检验。
C.SDS-PAGE:
分离胶浓度20%(体积分数),浓缩胶浓度3%(体积分数)
已达到一条带的要求,此次分离效果很好,整体的分离效果比较好,花费较少。
(5)结果分析:
3号蛋白Mr约为6800,pI=6.0,稳定pH3.8~5.8,稳定温度<62℃。
3.碱性条件下稳定的蛋白(Windows36号酶)
36号酶在31度下稳定,稳定pH范围7.7-10
(1)分离纯化步骤:
先通过DI-DEM看一下样品的情况:
pH3~10,分离胶浓度10%(体积分数),浓缩胶浓度3%(体积分数)
由图片得知,蛋白比较杂,在pH7.2-10这个范围内,蛋白质的分子量差异较大,比较分散。
目的酶的温度比较低,故不用热变性法,在用硫铵沉淀法后发现对杂蛋白的分离效果不大,所以直接用细分离。
A.吸附色谱
填料:
氧化铝,柱长=35CM,直径=2CM;
缓冲体系:
Gly-NaOH(pH8.6-10.6),pH8.6。
洗脱曲线如下:
由洗脱曲线可以看出,目的酶和杂蛋白有一定的重合,可以通过收集来避免一些杂蛋白的干扰,收集210-280ml的组分,做如下检验。
(2)蛋白纯化检验:
发现各种蛋白的Mr和pH差异比较大,用凝胶过滤层析和离子交换层析都可以。
(3)第二次分离纯化:
离子交换层析:
填料:
DEAE-SephadexA-50,柱长=10CM,柱内径=2CM;
缓冲体系:
Gly-NaOH(pH8.6-10.6),pH=8.6,流速0.3ml/min;
离子强度梯度洗脱:
0.01mol/L-0.15mol/L,洗脱体积:
300ml。
(如下图)
洗脱曲线如下:
由洗脱曲线可以看出,目的酶和杂蛋白有一定的重合,可以通过收集来避免一些杂蛋白的干扰,收集70-100ml的组分,做如下检验。
(4)第二次蛋白纯化检验:
A.二维电泳:
pH3-10,分离胶浓度10%(体积分数),浓缩胶浓度3%(体积分数)
已达到一个点的要求。
B.PAGE缓冲体系:
Gly-NaOH(pH8.6-10.6),pH8.6。
由图可以看出,除了目的蛋白的条带外,在它上面还有一条浅浅的带,杂蛋白未除尽。
由杂蛋白和目的蛋白条带的接近程度可大致得出,杂蛋白和目的蛋白的PI接近。
作为对比再用SDS-PAGE检测一下。
C.SDS-PAGE:
分离胶浓度10%(体积分数),浓缩胶浓度3%(体积分数)
结果显示,只有一条清晰的带。
二维电泳一条带,PAGE虽两条带,不过杂蛋白的量很少,条带不明显。
如果接下来的实验对蛋白纯度要求不是特别高,达到上述纯度即可。
(5)实验结果分析:
36号目的酶的Mr约为30800,PI=8.4。
稳定pH7.7~10,稳定温度<31℃。
实验小结:
这次实验的情况让我了解了各种蛋白质的相关性质的测定方法,同时也了解到了相关的方法的一些具体的操作过程,学到了很多书本上没有的知识。
实验的结果整体比较令人满意,用的相关步骤也是比较简单省钱的,所以效果比较好!
不过还是有些遗憾就是第三个在等点检测和PAGE检测的时候是出现了两条带,说明自己还有很多的不足需要进一步的学习!
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