小麦对高盐胁迫的耐受性研究徐海沙.docx

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小麦对高盐胁迫的耐受性研究徐海沙

中央民族大学生命与环境科学学院

植物生理学综合性设计实验报告

小麦对高盐胁迫的耐受性研究

Researchofthereactionofwheatinhighsaltstress

姓名：

徐海沙

学号：

1044009

年级：

2010级

专业：

生物科学

小组成员：

徐海沙、孟冬冬、高小丽、刘仁鹏

指导教师：

孙洪波

2012年5月29日

小麦对高盐胁迫的耐受性研究

徐海沙

摘要：

目的　了解逆境对植物的伤害作用;了解植物适应逆境的生理调节;掌握逆境对植物伤定程度的测定方法;掌握植物适应逆境的一些生理指标的测定方法。

方法　烘干法：

根据相对含水量测植物水份含量；相对电导率：

根据植物外渗液电导率推测细胞膜通透性；脯氨酸含量的测定：

通过测定脯氨酸含量来检测植物的渗透调节。

结果植物水分饱和亏与受到的胁迫程度成线性关系；相对电导率数据弥散分布；脯氨酸含量与胁迫程度成对数关系。

结论植物失水程度与受到的胁迫程度成正相关；相对电导率与胁迫程度没有关系；脯氨酸含量的增加量随胁迫程度增强而减小。

关键词：

高盐胁迫、含水量、电导率、脯氨酸、植物生理

Researchofthereactionofwheatinhighsaltstress

XuHaisha

Abstract:

ObjectiveUnderstandtheroleofplantadversitydamage;Understandtheplantstomeetadversityphysiologicalregulation;Masterdegreeofplantwillhurtadversitydeterminationmethodof;Masterplanttomeetadversitysomephysiologicalindexesofthemeasurementmethodofthe.MethodsDryingmethod:

accordingtotherelativewatercontentofplantwatercontent;Relativeelectricconductivity:

accordingtotheplantcellmembranepermeabilitythatdrainageconductivity;Prolinecontentdeterminationof:

throughthedeterminationofprolinecontenttodetectplantosmoticregulation.ResultsPlantwatersaturationandthedeficitbystresslevelofalinearrelationshipbetween;Relativeelectricconductivitydispersiondistributiondata;Prolinecontentanddegreeofstressinseveralrelations.ConclusionPlantwaterlossbythedegreeofstresswithapositivecorrelationdegree;Relativeelectricconductivityandstresslevelnorelationship;Prolinecontentincreaseanddecreasewiththestresslevelenhancement.

Keywords:

Saltstress,Watercontent,conductivity,proline,Plantphysiology

前言

【研究背景】

高盐是限制农作物生长的主要胁迫环境。

据统计，全世界约有10x10shm的农业土地发生了盐演化，次生盐渍化也日趋严重，对农业的威胁成为一个全球性的问题。

研究植物的抗盐性、筛选耐盐农作物、改良土壤盐渍化是世界性的研究热点。

盐胁迫改变植物一系列的生理生化过程，破坏植物组织和细胞的结构功能，抑制植物的生长发育，如干扰植物组织和细胞的离子平衡、减少叶绿素质量分数、抑制植物光合作用等。

盐胁迫也可使植物体内活性氧积累，启动膜脂过氧化，导致细胞膜结构和蛋白的损伤。

一些农作物有很强的耐盐性，能在高盐环境中保持高产。

研究这些农作物对盐胁迫的适应性，揭示植物的抗逆机理，将对解决世界范围的高盐问题具有重要意义。

【研究原理】

在不良条件下,由于植物细胞质膜的损伤引起透性增大,使细胞对内含物失去控制，电解质大量外渗，外渗液的电导值增大，所以电导法测定细胞质膜透性已作为抗逆指标，目前在作物抗旱研究方面已被广泛应用。

盐胁迫情况下，植物为缓解体内水分亏缺，维持细胞的正常生理代谢，细胞通过渗透调节，以降低胞内水势，从而保证正常的水分供应．细胞一方面从外界吸收无机离子以降低细胞的渗透势，另一方面还合成许多有机物质作为渗透调节剂，进一步降低细胞水势，使细胞质浓度增加，渗透式降低，便于植物吸收水分，从而保证了植物生理活动的需要。

盐胁迫下，植物细胞中常积累一些小分子有机物质，如脯氨酸，甜菜碱，糖醇等和多种无机盐离子，以维持较高的细胞质渗透势，从而保证植物在高浓度盐胁迫下吸水，维持细胞正常的生理功能．这些物质不仅可以维持细胞的膨压，而且还能稳定细胞质中酶分子的活性结构，保护其不受盐离子的直接伤害。

脯氨酸既是细胞质的渗透调节物质，又是酶和细胞结构的保护剂及自由基清除剂，在植物的抗性生理中起到重要作用．盐胁迫下脯氨酸积累的积极作用为：

一方面，作为渗透调节剂减轻盐胁迫对植物的渗透胁迫；另一方面，脯氨酸合成需消耗大量ＮＡＤＰＨ，ＮＡＤＰ＋再生，从而减轻活性氧损。

在植物的组织、器官和全株实验中证明脯氨酸积累与抗渗透胁迫呈显著的正相关。

【研究目的】

了解逆境对植物的伤害作用；了解植物适应逆境的生理调节；掌握逆境对植物伤定程度的测定方法；掌握植物适应逆境的一些生理指标的测定方法。

1.材料和方法

1.1实验试剂、器皿及仪器

试剂：

NaCl溶液（梯度为0、0.05、0,1、0,2、0.4、0.8mol/L）脯氨酸标准母液；茚三酮试剂；80%乙醇；石英砂；人造沸石；活性碳；冰醋酸

器皿：

剪刀、试管及试管架、试管、吸水管

仪器：

电导率仪、电子天平、分光光度计、电炉、铝锅、20mL刻度试管、刻度吸管、记号笔、吸水纸适量

1.2实验材料

播种若干天的小麦苗18盆

1.3试验步骤

1.3.1逆境类型：

高盐（NaCl溶液浇灌）的制备

1.3.2盐处理浓度NaCl浓度为0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8mol/L，每种浓度三盆作为三个平行，实验前一周开始进行盐胁迫处理，每日浇灌一次，连续一周。

1.3.3测定指标

①水分含量：

烘干法

实验方法：

将处理的每组10棵小麦苗用蒸馏水洗干净，再用吸水纸将水分吸干，剪成适量大小，称量其约1g鲜重Wf，再将该材料浸入蒸馏水并于4℃冰箱中数小时至恒重（12h以上），将材料从水中取出，迅速的吸去材料表面的水分，称其饱和鲜重Wfs，而后将上述材料一信封中105℃杀青1h，在于60℃烘干至恒重（在其过程中，每隔30min测量一次，直至质量不再变化为止）称量其干重Wd。

数据处理：

衡量实验水分含量的指标自然含水量（WC）=（Wf-Wd）/Wf×100%

相对含水量（RWC）=（Wf-Wd）/（Wfs-Wd）×100%

水分饱和亏（WSD）=1-RWC

逆境对植物的伤害：

相对电导率

实验方法：

取植物根系，自来水洗净，蒸馏水冲洗干净，吸干表面水分。

秤取1g，剪成长约1cm小段。

将材料装到30ml指形管内，加入去离子水15ml，每隔几分钟震荡一次，室温放置90min。

测电导率R1。

将指形管沸水浴20min（注意加盖防止水分蒸发），以充分杀死植物组织，取出放入自来水中冷却至室温，测电导率R2。

数据处理：

相对电导率=R1÷R2×100%

脯氨酸含量的测定

（1）脯氨酸标准曲线制作：

用100μg/ml脯氨酸配制成0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μg/ml的标准溶液。

取标准溶液各2ml，加2ml3%磺基水杨酸、2ml冰醋酸和4ml2.5%酸性茚三酮试剂于具塞试管中，置沸水浴中显色1h，冷却后加入4ml甲苯，盖好盖子于漩涡仪上震荡0.5min，期间间歇开盖放气。

静置分层，吸取上层红色甲苯相，于波长520nm处测定OD值，以OD值为纵坐标，脯氨酸质量浓度（μg/ml）为横坐标绘制标准曲线。

（2）测定样品的脯氨酸含量

提取脯氨酸：

分别称取叶子，每种处理各取三份，每份0.5g。

剪碎，用3%磺基水杨酸研磨提取，磺基水杨酸最终体积为5ml，匀浆液转入离心管中沸水浴10min，冷却后，3000r/min离心10min，上清液待测。

除去干扰的氨基酸：

向提取液中加入约0.4g的人造沸石和0.2g活性碳，强烈振荡5分钟，过滤，滤液备用。

脯氨酸含量的测定：

分别吸取上述提取液2mL于刻度试管中，加入2ml水，再加入冰乙酸2ml，和4ml2.5%酸性茚三酮，沸水浴中显色1h，加入4ml甲苯，震荡30秒，静置片刻，冷却后在分光光度计测520nm处各样品的光密度，从标准曲线上查出每毫升被测样品液中脯氨酸的含量。

样品中脯氨酸含量的计算:

脯氨酸含量（μg/g）=（cxv/a）/w或

脯氨酸含量（%）=[（c*v）/a]/w*106×100

其中，C：

由标准曲线上查得的脯氨酸微克数；v：

提取液总体积（mL）

a：

测定液体积（mL）w：

样品重（g）

2.结果

2.1水分含量测量结果

不同盐浓度处理的小麦苗测得水分饱和亏结果如图1所示：

图1不同盐浓度处理下的小麦苗水分饱和亏

对所得数据进行单因素方差分析，在置信度99.95%下，NaCl浓度六个水平间有显著性差异。

对0至0.1mmol/L三个水平进行相同处理，统计结果无显著性差异。

植物含水量与胁迫浓度的关系如图2所示：

图2水分饱和亏与胁迫浓度的线性回归统计

对0.1mol/L至0.8mol/L四组数据进行线性回归统计处理，得到R²=0.986的线性回归方程，说明植物失水程度与受到的胁迫程度成正相关。

2.2相对电导率测定结果

对所得原始数据进行单因素方差分析，置信度仅为99.5%下，结果仍显示该组数据间无显著性差异。

对每个浓度水平三组平行数据进行组内误差统计，计算得MSE=5.789，相对较小；对其进行组间误差分析，计算得MSA=1101.0378。

说明偶然误差较小，而系统误差较大。

本组实验由此得出结论：

植物渗透液电导率不受到高盐胁迫的影响。

对0至0.05mol/L两组组数据同理将其忽略，经计算得0.1mol/L组数据为离群值舍去。

对0.2mol/L至0.8mol/L三组数据的R1进行线性回归统计处理，得到R²=0.985的线性回归方程。

见图3。

图30.2mol/L至0.8mol/L电导率R1绝对值回归统计

由此推断，将植物彻底致死步骤中出现问题的可能性极大。

2.3脯氨酸含量测定

2.3.1脯氨酸标准曲线的绘制

表1脯氨酸标准曲线数据

Table1Prolinestandardcurvedata

图4脯氨酸标准曲线

得到脯氨酸浓度计算公式c=（OD-1.155）/0.114-1ug/mL

2.3.2样品中的脯氨酸含量

表2脯氨酸含量数据

对所得数据进行单因素方差分析，在置信度99.95%下，NaCl浓度六个水平间有显著性差异。

对0至0.1mol/L三个水平进行相同处理，统计结果无显著性差异。

各盐浓度脯氨酸含量见图5：

图5脯氨酸含量

2.3.3脯氨酸含量与胁迫浓度的关系：

图6脯氨酸含量与胁迫浓度的关系

对0.1mol/L至0.8mol/L四组数据进行回归统计处理，得到R²=0.942的对数回归方程，说明植物脯氨酸含量与受到的胁迫程度成对数关系的正相关。

随着盐浓度的梯度增高，植物脯氨酸含量增加，并且增加量逐渐减小。

3.讨论

3.1关于实验设计

设计的浓度梯度较少，得到的实验结论精确度较低；

分组平行的意义不大；

没有重复实验。

3.2关于实验操作

实验使用的仪器和试剂均不统一，没有植入单一变量的思想，造成较大的系统误差。

各项操作分别由各位组员单独同步进行，更有效地控制了偶然误差；

没有明显的操作失误或错误。

3.3关于实验结果

在测定各项指标前，可大致直观看出小麦苗的长势碎盐浓度梯度的变化，脯氨酸显色反映也可从宏观上清晰分辨出显色程度的理想差异；

测得植物高盐逆境响应的各项生理指标大体与理论相符；

总体来说，实验成功。

3.4实验反思

3.4.1对于本实验的反思

①实验过程涉及很多溶液的配制，为使实验过程所用的溶液浓度准确，且不相互污染，在使用移液管、胶头滴管、试管等之前都得清洗。

②培养小麦苗期间，需定时浇灌适量相应的盐溶液，并保证每个实验组浇灌的水量一致。

浇灌时，应将盆拿起，使其远离其它盆，加水至盆低开始渗出盐溶液，且要等滴干后再放回原位。

测定相关指标应注意的事项

（1）.测定小麦含水量：

称小麦叶片自然鲜重和饱和鲜重时，一定要用吸水纸吸干叶片表面的水分方能进行称量。

（2）.测定相对电导率：

指形管沸水浴时，一定要保证指形管加盖，防止烧杯里的水进入指形管，以及指形管里的水分蒸发掉，而改变溶液的浓度，进而影响电导率的准确度。

3.4.2对于以往实验的总结

包括植物生理学实验在内的各科实验，目前为止大大小小同学们都已做了不少。

由于操作不慎或理论不精也导致过各种各样的失误，以至于结果有时也五花八门。

上次生化大实验，有同学失败了，我亲眼看到她哭了，哭得很伤心。

而我却想说，同学们实验的意义，在于试验，而不在于结果。

成功只是偶然的，结果与理论本身具有不对应性，正确的操作不一定导致良好的结果，完美的结果也不意味着天衣无缝的过程。

有些情况，是我们所无法解释的，也是人类无法解释的。

实验，只要认真做了，就是收获，且因个人造化不同而获得每个人自身应得的。

所以，自欺欺人和无病呻吟的解释，是不必要的。

我们虽然学习的是一门自然科学的专业，但目前为止我们所做的一切，在某种意义上，其实是人文情怀的成分居多。

对待实验的定位，应该带有宏观的思维，以平常心态来面对实验。

3.结论

①植物失水程度与受到的胁迫程度成正相关；

②植物渗透液电导率不受到高盐胁迫的影响；

③植物脯氨酸含量与受到的胁迫程度成对数关系的正相关，随着盐浓度的梯度增高，植物脯氨酸含量增加，并且增加量逐渐减小。

致谢：

衷心感谢孙洪波老师为我们提供充分的理论课基础和对我们实验的全程指导，感谢沈光涛老师不辞辛苦的为我们准备各种所需物品，感谢学院为我们提供条件良好的实验设施。

对本组同甘共苦的成员：

孟冬冬、高小丽、刘仁鹏同学表示诚挚的敬意和衷心的感谢！

大家携手并进，精益求精，让实验课真正实现了价值！

参考文献:

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