《免疫学实验技术》实验讲义修订版.docx
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亲们:
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1.下周一实验1点开始,切记时间不要迟到哟。
2.作业:
第一次(今天)的实验报告,还有“大吞噬”和"小吞噬"的图。
3.漂亮___们要把头发扎好,为自己的健康着想哟。
实验一小鼠腹腔巨噬细胞吞噬实验【原理】吞噬细胞具有对异物(细菌、绵羊红细胞、鸡红细胞等)吞噬和消化的功能,在机体固有免疫中发挥重要作用。
【目的】1.通过对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞活动的观察,加深理解细胞吞噬作用的过程及其意义。
2.掌握小鼠腹腔注射给药和摘眼球放血及脊椎脱臼处死的方法。
【材料】小鼠、2%鸡RBC(CRBC)、尖吸管、玻片、瑞氏染液、眼科剪、弯头眼科镊、1mL注射器【方法】10%的硫乙醇酸钠溶液腹腔注射1ml(诱导腹腔巨噬细胞大量渗出)(4d)2%CRBC腹腔注射1ml(45min)摘眼球放血,处死小鼠轻揉腹部1min,剪开表皮,暴露腹膜,剪一小口,取腹腔液(用尖吸管)滴于玻片一端推片(自然干燥)瑞氏染色(10min)冲洗,印干,镜检【注意事项】⒈腹腔注射时勿注入皮下;⒉染色时玻片勿互相碰触;⒊观察时注意玻片正反面。
结果:
吞噬百分率=吞有SRBC的吞噬细胞/100个吞噬细胞×100%吞噬指数=所吞SRBC数/100个吞噬细胞
附:
⒈2%CRBC悬液的制备:
吸取在阿氏液中保存的CRBC沉淀0.3mL,置于玻璃试管内,加入2mL生理盐水,混匀,2000rpm,5min离心,此为洗涤红细胞。
离心毕,观察上清,如无溶血现象,即可弃上清,取红细胞沉淀(即为压积红细胞)0.2mL,移入15mL离心管中,以10mL注射器吸取生理盐水10mL加入,混匀,即为2%CRBC悬液。
若洗一次后仍可见溶血现象,则重复第一步,直至无溶血发生,方可配制实验用红细胞悬液。
⒉摘取胸腺,脾脏。
均为重要的免疫器官,做动物实验获取免疫细胞的重要示教片:
大吞噬实验:
即本实验结果;小吞噬实验:
外周血嗜中性粒细胞吞噬葡萄球菌(标本片示教)实验二二淋巴细胞转化实验(MTT法)一、原理:
四甲基偶氯唑盐(MTT)可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。
当有活细胞存在时,线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲臢,将结晶的甲臢溶解释放后,可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性,从而推知待测样品的水平。
二、材料:
小鼠、鼠板、眼科剪、眼科镊、75%乙醇湿棉球、小平皿、200目筛网、研棒(注射器针芯)、细胞计数板、盖玻片、加样器(1mL、200uL、20uL)及枪头、96孔血凝板、15mL离心管、4mLEP管、96孔板、白细胞计数液、MTT、ConA、无菌PBS、Tris-NH4Cl、完全1640(含10%FBS、1%双抗)、0.01NHCl-10%SDS、无菌针头过滤器、10mL注射器、废物(液)缸、冰浴、无菌操作台、CO2培养箱,显微镜、酶标仪,冰箱、低温离心机。
试剂的准备:
1.MTT:
称取50mg的MTT,溶于10mlPBS后,终浓度为5mg/ml,过滤除菌,无菌EP管分装,1mL/管,-20℃避光保存。
2.ConA:
25mg/瓶,Sig___出品。
取25mg,溶于25mLPBS中,终浓度为1mg/mL,过滤除菌,无菌EP管分装,1mL/管,-20℃保存。
用时取1mL,以无菌PBS稀释为100ug/mL(即稀释10倍)。
3.PBS:
取市售配好的PBS粉末一袋,加1000mL蒸馏水,混匀,高压或过滤除菌,4℃保存。
4.0.01NHCl--10%SDS:
设市售浓HCl为10N(实际约为11N),取0.1mL加99.9mL蒸馏水稀释为0.01NHCl100mL;称取10gSDS,置于100mL量筒内,以上述HCl溶解,使终体积为100mL,即得0.01NHCl-10%SDS。
5.完全1640:
取市售RPMI1640___mL,加1mL100×双抗、10mLFBS,即得含10%FBS的完全1640.
6.Tris--NH4Cl(红细胞裂解液):
称取3.735g氯化铵、Tris(三羟甲基氨基甲烷)1.3g加水溶解并稀释至500ml。
0.22μm滤膜过滤除菌,4℃保存。
无菌器械的准备:
1.200目筛网、研棒、平皿:
提前1d高压灭菌,烘干备用。
2.手术器械:
临用前酒精擦拭或浸泡、酒精灯火焰灭菌。
3.冰浴:
将碎冰置于一白色浅盘(或小塑料泡沫盒)内,备用。
(三)实验方法:
1、脾细胞制备:
(1)小鼠摘眼球放血、脱颈椎处死,75%乙醇湿棉球擦拭腹部,置于鼠板上固定;
(2)在小鼠腹部中间部位剪开小口,撕开皮肤,暴露腹壁,可见红色长条状脾脏;(3)在脾脏下侧提起腹膜,剪开后上翻,暴露脾脏,用镊子提起脾脏,另一镊子分离脾脏下面的结缔___,取出脾脏。
放入盛有5ml无菌PBS液的培养皿中;(4)制备脾细胞悬液:
无菌取脾,将脾脏放置不锈钢网(200目)上,置于盛有适量无菌PBS的小平皿中,用注射器针芯轻轻研压脾脏,制成单细胞悬液;经200目筛网过滤,用PBS洗3次,每次离心2000r/min5min。
取出10μl,稀释后在细胞计数板上进行细胞计数,调整细胞浓度为5×106/ml。
细胞计数的方法:
①稀释脾细胞:
在96孔血凝板内分别加白细胞计数液90μL/孔,根据细胞数量加2-3个孔;取脾细胞悬液10μL,依次10倍稀释。
②取最后1孔的细胞悬液10μL置于白细胞记数板槽内,待细胞不再___,100倍镜下进行细胞计数。
1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=0.1×10-3ml=10-4ml细胞浓度:
细胞数/ml=5个中格的细胞数x5x104(RBC计数法)细胞数/ml=4个大格的细胞总数/4x104(WBC计数法)W1mm③根据细胞计数结果,取适量细胞以完全1640稀释为5×106/mL2、淋巴细胞增殖反应:
将5×106/ml脾细胞悬液加入到96孔培养板中,100ul/孔,加6个孔,再加培养液100μL/孔;前3个孔加ConA10μL/孔(终浓度5μg/mL),另3个孔不加ConA作为对照。
置5%CO2,37℃培养72h。
3.在培养结束前4-6小时,先将各孔中培养液小心吸出100μL/孔,注意加样器枪头勿碰触细胞;于培养板各孔内加入5mg/mlMTT液,10μl/孔。
37℃培养。
4.4-6小时后,各孔内加入0.01NHCl-10%SDS100μl,振荡摇匀,37℃过夜。
5.用酶标测定仪测OD值,测定波长570___。
抄录数据。
(四)实验结果取实验组和对照组三个复孔的平均OD值。
转化值=实验组的平均OD值-对照组的平均OD值。
注意事项
(1)由于本实验需要培养3天,才能观察结果。
因此,在操作时应注意无菌操作,避免细菌污染,导致实验的失败。
(2)细胞操作要轻柔、迅速,以免细胞损伤影响实验结果。
(3)为保持细胞活性,所有步骤(除破坏红细胞时)均需在低温或冰浴中进行。
实验三--11凝集实验原理:
是颗粒性抗原与相应抗体结合所发生的凝集反应(agglutination)。
细菌和红细胞等颗粒性抗原,当与相应抗体特异结合后,在适量电解质存在的条件下,两者特异性结合且进一步聚集,出现肉眼可见的凝集现象称为凝集反应。
反应中的抗原称为凝集原(agglutinogen),抗体称为凝集素(agglutinin)。
分类:
直接凝集试验、间接凝集试验、间接凝集抑制试验等血球凝集试验:
属直接凝集试验材料:
1%SRBC、1:
20溶血素、生理盐水(NS)、24孔凹孔板、0.2mL加样器及枪头、37℃恒温箱方法与步骤:
对倍稀释法(第12孔为阴性对照,37℃,2h,4℃静置过夜12345。
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1112生理盐水(ml)0.20.20.2溶血素(ml)0.20.20.2弃去1:
401:
801:
1601%SRBC(ml)0.20.20.2结果判定:
++++全部凝集,血细胞明显凝集,甚至成片卷曲,上清清亮+++两者之间,血细胞凝集成片,上清发红,略不清亮++一半凝集,一半沉淀,血细胞均半数凝集,周围散在颗粒,上清呈混悬+两者之间,血细胞在孔底形成一圆点,周围可见少量凝集,上清更加浑浊-一点儿也不凝集,血细胞在孔底形成边缘整齐,光滑的点状,上清澄清效价:
即滴度,是出现明显凝集现象(++)的抗体的最大稀释度。
实验三三-2抗体形成细胞检测法――溶血分光光度计法QHS实验原理:
定量溶血分光光度法(quantitativehemolysisspectrophotometry,QHS)该法又称B细胞介导的红细胞定量溶血分光光度法,是根据溶血空斑试验的原理衍化而来,可用以测定由B细胞产生和分泌的抗体裂解红细胞所释放的血红蛋白(以吸光值表示),从而反映机体的体液免疫功能。
试验时,将免疫的脾细胞与SRBC及新鲜豚鼠血清等体积混合,于37℃水浴1小时,离心后测上清吸光值,其与产生抗体的量成正比。
实验材料:
5%SRBC、SRBC(以生理盐水稀释成1.5×108/ml)、补体(三只豚鼠血清混合,以SRBC4℃吸收30min,3000rpm离心15min,上清1:
10稀释备用)2×107/ml小鼠脾细胞、RPMI1640培养液、白细胞计数液、Tris-NH4Cl溶液、酒精棉球200目铜网、针芯(研棒)、冰浴(置于中号白托盘中)、眼科剪、弯头眼科镊2把、平皿(小号)、小滤器、10mL注射器、PBS、低温离心机、15mL离心管、1.5mL离心管若干、96孔血凝板(稀释细胞用)、96孔酶标板、各规格(1mL、200uL、10uL)加样器及枪头、显微镜、血球记数板、盖玻片、废物(液)缸、37℃孵箱、酶标仪实验方法:
1.脾细胞的制备①5%SRBC免疫小鼠,1mL/只,4天后拉颈处死,取脾②200目铜网上研磨脾脏,收集脾细胞悬液,2000rpm离心5min,弃上清③Tris-NH4Cl室温作用10min,2000rpm离心5min,弃上清④洗细胞2遍:
加5mlPBS液,混匀,2000rpm离心5min,弃上清⑤加1mlPBS液计数,调整细胞浓度为2×107/ml按下表分别向各管中加入所需材料实验管对照管脾细胞0.2ml0.2mlPBS液SRBC0.2ml0.2mlComplement0.2ml0.2ml?
混匀,37℃孵育1h?
3000rpm离心5min,取上清,加入96孔板,0.1mL/孔,实验组和对照组各设3个复孔?
酶标仪测定413___处OD值(Hb量)
实验四四
实验五五免疫细胞化学实验原理:
应用免疫学基本原理——抗原抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定___细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究,称为免疫___化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
免疫酶标记法:
以酶作为标记物与外加底物作用后产生不溶性色素,沉积于抗原和抗体反应的部位;·酶降解底物的量与色泽浓度成正比。
可反映被测定的抗原或抗体的量。
1、常用的标记酶及其显色底物·辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)及底物·碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,AP)及底物
(1)辣根过氧化物酶(HRP)及底物·HRP是应用最广的一种酶,植物辣根,由无色的酶蛋白和深棕色的铁叶琳结合而成,分子量约40kDa,稳定性好;·底物为过氧化物和供氢体(DH2)–过氧化物:
常用过氧化氢和过氧化氢尿素。
–供氢体:
多用无色的还原型染料,通过反应生成有色的氧化型染料,最常用的供氢体是DAB。
DAB(二氨基联苯胺)·DAB本身无色,反应后呈棕色,不溶于水,不易褪色,电子密度高,最为常用。
·目前已经有商品化的试剂盒,使用起来非常方便。
(2)碱性磷酸酶(AP)及底物·AP为磷酸酯的水解酶,可通过两种反应显色:
-偶氮偶联反应,底物为?
-萘酚磷酸盐,经水解后得?
-萘酚,与重氮化合物如坚牢蓝(fastblue)或坚牢红(fastred)形成不溶性沉淀,分别呈兰色或红色。
–靛蓝-四唑反应:
底物为溴氯羟吲哚磷酸盐(5-bromo-4-chloro-3-indodylphosphate,BCIP),经酶水解并氧化形成靛蓝,而氮蓝四唑(NBT)在此氧化过程中被还原成不溶性紫兰色沉淀。
酶标抗体法·通过共价键将酶结合在抗体上,制成酶标抗体,与标本进行反应后,再用酶组化法将酶显色,使之生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒,以供光镜和电镜观察。
–优点:
切片能___保存、反复观察,适于镜下半定量分析。
–缺点:
酶与抗体形成的共价键,可损害抗体和酶的活性;易产生非特异染色。
(1)直接法·将酶直接标记在一抗上,然后直接与相应抗原特异地结合。
形成抗原-抗体-酶复合物,最后用底物显色剂显色。
(2)间接法·将酶标记在二抗上,先将一抗与相应的抗原结合,形成抗原抗体复合物,再用二抗(酶标抗体)与复合物中的特异抗体结合,形成抗原-抗体-酶标抗体复合物,最后用底物显色剂显色。
实验材料:
1×107/ml小鼠脾细胞、单抗(兔抗鼠CD3)、兔Streptavidin-HRP试剂盒(带DAB显色液)、小牛血清、淋巴细胞分层液(适用于小鼠___)、白细胞计数液、酒精棉球、
200目铜网、针芯(研棒)、冰浴(置于中号白托盘中)、眼科剪、弯头眼科镊2把、平皿(小号)、PBS、低温离心机、15mL离心管、96孔血凝板(稀释细胞用)、各规格(1mL、200uL、10uL)加样器及枪头、显微镜、血球记数板、盖玻片、废物(液)缸、37℃孵箱、湿盒实验方法:
1.单个脾细胞的制备①取健康ICR小鼠,18-22g,摘眼球放血、脱颈椎处死,取脾②200目铜网上研磨脾脏,收集脾细胞悬液,2000rpm离心5min,弃上清③用PBS洗3次,每次以500rpm短时低速离心除去细胞碎片,以200目不锈钢滤网过滤去除细胞团块。
作细胞计数并调整细胞浓度为(2~5)×107/ml。
常温下放置,分离前用小牛血清悬起细胞浓度为l×107/ml的单细胞悬液备用。
2.分离单个核细胞①取上述单细胞悬液1ml,小心加于2ml的细胞分离液之液面上②以2000转/分离心(半径15cm水平转子)15分钟,此时离心管中由上至下细胞分四层。
第一层;为胎牛血清液层。
第二层;为环状乳白色淋巴细胞。
第三层;为透明分离液层。
第四层;为红细胞层。
③收集第二层细胞放入含PBS4-5毫升的试管中,充分混匀后,以2000转/分离心5分钟。
沉淀经反复洗2次即得所需细胞。
附:
1.有关淋巴细胞分层液的注意事项:
1)启封后应置4℃保存避免微生物的污染。
2)细胞分离液从冰箱取出后,不可立即使用,需待溶液温度升至室温时,摇匀后使用。
3)整个分离过程中,温度应控制在18-28℃且在无菌环境下,避免微生物的污染,否则会影响分离质量。
2.细胞计数要点:
1)进行细胞计数时,要求悬液中细胞数目不低于l04个/ml,如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中;显微镜下计数时,遇到2个以上细胞组成的细胞团,应按单个细胞计算。
如果细胞团>10%,说明细胞分散不充分;或细胞数500个/10mm2时,说明稀释不当,需重新制备细胞悬液。
2)要求细胞悬液中的细胞分散良好,否则影响计数准确性。
3)取样计数前,应充分混匀细胞悬液,尤其是多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀,以求计数准确;
4)数细胞的原则是只数完整的细胞,若细胞聚集成团时,只按照一个细胞计算。
如果细胞压在格线上时,则只计上线,不计下线,只计左线,不计右线。
5)操作时,注意盖玻片下不能有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中,否则要重新计数。
3.免疫细胞化学染色1)试剂盒组成:
2)染色方法:
①固定细胞:
取上述分离好的淋巴细胞50μL,滴于载玻片正中,以细菌接种环均匀涂于载玻片上,自然干燥后,以纯甲醇室温固定5min,再用0.01MPBS漂洗,5min×3;②滴加适量试剂1(内源性过氧化物酶封闭液),室温孵育10分钟,PBS充分淋洗。
③滴加适量试剂2(封闭用正常羊血清工作液),室温孵育10分钟,甩干。
④滴加适量—抗工作液(PBS1:
50稀释),37℃孵育1h,然后PBS充分淋洗。
⑤滴加适量试剂3(生物素标记羊抗兔二抗工作液),室温孵育10分钟,PBS充分淋洗。
⑥滴加适量试剂4(HRP标记的链霉亲和素),室温孵育10分钟,PBS充分淋洗。
⑦DAB显色工作液配制:
根据需要量,将试剂A和试剂B以1:
19的体积比混匀后即为DAB显色工作液。
也可选择每毫升试剂B中滴加1滴(约50μ1)试剂A,混匀即可。
⑧显色:
加适量的DAB显色工作液于需要显色的___切片或细胞爬片上即可显色,显色时间—般为1~5分钟。
显微镜下观察控制显色时间,当达到最佳显色效果后,自来水冲洗终止显色。
显色后的切片经复染、脱水透明,封片后可___保存。
实验六六细胞凋亡检测(Annexin-V-FITCPI双双染法)(AssayofCellApoptosis)一、实验原理细胞凋亡或称程序性细胞死亡(ProgrammedCellDeath,PCD)是细胞的生命现象之一,它在机体的胚胎发育、___修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。
细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。
如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关,自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。
细胞凋亡有别于细胞坏死,它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变,包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。
在正常的活细胞,磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine,PS)位于细胞膜的内侧,但在凋亡的细胞,PS从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。
Annexin-Ⅴ(膜联蛋白-V)是一种分子量为35-36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力结合。
因此将Annexin-Ⅴ进行荧光素(如FITC、PE)或生物素(Biotin)标记,以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
碘化丙啶(PropidiumIodine,PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但对凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。
因此将Annexin-Ⅴ就PI匹配使用,就可将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
二、实验仪器和材料AnnexinV-FITC(膜联蛋白-V-FITC)标记缓冲液(BindingBuffe)10mlPBS(1×)20μl,200μl,and1000μl移液器和吸头微量离心管可调速离心机载玻片(用于荧光显微镜观察)盖玻片(用于荧光显微镜观察)去离子水
冰块荧光显微镜三、实验方法1.凋亡细胞的制备:
小鼠腹腔注射___25mg/kg体重,10h后解剖取胸腺,分离胸腺细胞。
用PBS洗两遍,调整待测细胞的浓度为2×106/ml,备用。
2.将细胞重悬于200μl标记缓冲液(bindingbuffer)。
3.加入10μlAnnexinV-FITC,轻轻混匀,再加入5μlPI,混匀。
4.避光室温反应15分钟。
5.滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上,并用盖玻片盖上细胞。
6.请在1h内,进行荧光显微镜的观察。
AnnexinV-FITC荧光___呈绿色,PI荧光___呈红色。
四、实验结果用荧光显微镜观察,凋亡细胞细胞膜上可见黄绿色光环。
PS转移到细胞膜外不是凋亡所特有的,也可发生在细胞坏死中。
以FITC标记的AnnexinV,可以同时结合使用PI(碘化丙啶)拒染法,用流式细胞仪分析可检测凋亡细胞的百分率。
五、注意事项1.整个操作过程动作要尽量轻柔,切勿用力吹打细胞,尽量在4℃下操作。
3.反应完毕后要尽快检测,因为细胞凋亡是一个动态的过程,反应一小时后荧光强度就开始衰变。
4.AnnexinV-FITC是光敏物质,在操作时要注意避光。
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