去铁胺激活半胱天冬酶3诱导HL.docx
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去铁胺激活半胱天冬酶3诱导HL
去铁胺激活半胱天冬酶3诱导HL
【摘要】为了研究铁螯合剂—去铁胺诱导人白血病细胞株HL-60凋亡时半胱天冬酶-3活性的变化并探讨DFO诱导凋亡的可能机制。
HL-60细胞经HE染色,在光学显微镜下观察其形态结构变化,用TUNEL法和流式细胞术检测细胞凋亡,免疫组织化学法检测caspase-3活性,原位杂交法检测凋亡基因bax的转录水平。
结果表明,HL-60经去铁胺处理后,典型的细胞形态改变、DNA末端原位标记和FCM检测均证实DFO可诱导细胞凋亡,凋亡率与药物剂量和作用时间呈依赖性。
在DFO诱导HL-60凋亡过程中,caspase-3活性明显升高,凋亡基因bax的转录水平均较对照组增高。
caspase广谱抑制剂Z-AVD可明显降低DFO诱导的细胞凋亡率。
结论:
DFO通过激活caspase-3和增强bax活性而诱导HL-60凋亡。
【关键词】细胞凋亡
DeferoxamineInducesApoptosisofHL-60CellsbyActivatingCaspase-3
AbstractThisstudywaspurposedtoobservethechangesofcaspase-3activityduringapoptosisofHL-60cellsinducedbyanironchelator,DFO(deferoxamine),andtoexplorethemechanismunderlyingapoptosisinHL-60cells.TheHL-60cellstreatedwithDFOwereexaminedbylightmicroscopy,flowcytometry(FCM)andDNAagarosegelelectrophoresis;theactivityofcaspase-3wasdeterminedbycellularimmunohistochemistry;thetranscriptionoftheapoptoticgeneofbaxwasdetectedbyhybridizationinsitu.Theresultsshowedthatthetypicalmorphologicalcharacterofapoptosiscells,DNAladderandFCMassayconfirmedthatDFOcouldinducetheapoptosisinHL-60cells.Theapoptoticrateincreasedindose-andtime-dependentmanner.Whencellshadbeencultivatedwith100μmolDFOfor12hours,afewcaspase-3positivecellswerefound.Intheprocessoftime,therateofcaspase-3positivecellswasprogressivelyhigherthanthatincontrol(),whilethelevelofbaxtranscriptionwasalsohigherthanthatinthecontrol.Itisconcludedtheactivationofcaspase-3andgenebaxmaybeinvolvedintheapoptosisofHL-60cellsinducedbyDFO.
Keywordsdeferoxamine;HL-60cell;apoptosis;caspase-3
去铁胺是以铁螯合物的形式从多毛链霉菌中分离、经化学方法处理后得到的不含金属的配体,它对铁的亲和力极高,常用于治疗铁中毒和一些输血性铁质沉着病。
近年来研究发现,铁螯合剂可抑制多种肿瘤细胞增殖并诱导凋亡,有望成为一种新的抗肿瘤因子[1,2]。
但有关DFO诱导白血病细胞凋亡的机理研究的报道,国内外较少见。
Caspase是哺乳动物细胞中普遍存在的半胱氨酸-门冬氨酸特异蛋白酶,其在凋亡过程中起着关键性作用[3]。
本研究拟观察半胱天冬酶-3(caspase-3)的活性在DFO诱导HL-60细胞凋亡过程中的变化,以探讨DFO诱导白血病细胞凋亡的可能机制。
材料和方法
材料
HL-60细胞由北京协和基础医学研究所细胞中心提供;去铁胺为瑞士Giba公司产品;RPMI1640培养液为美国Gibco公司产品;精制小牛血清为美国Hyclon公司产品;噻唑兰为美国Sigma公司产品;原位细胞凋亡检测试剂盒为德国BoehringerMannheim公司产品;膜联蛋白Ⅴ检测试剂盒为深圳晶美公司产品;Bax原位杂交试剂盒为北京中山生物技术有限公司产品;
流式细胞仪购自美国BectenDickinson公司。
细胞培养及分组
HL-60细胞接种于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中常规传代培养。
收集对数生长期细胞进行实验,试验组分别加入10、50、100μmol/LDFO共培养,对照组加生理盐水。
细胞形态观察
收集经药物作用后的细胞,涂片凉干,HE染色,油镜下观察。
流式细胞术检测
收集1×106个细胞,PBS洗3次,重悬于500μl缓冲液,加入5μlAnnexinV-FITC及5μlPI,混匀,室温避光15分钟,PBS洗后,流式细胞仪检测。
DNA琼脂糖凝胶电泳
经0、50、100μmol/LDFO作用48小时后,每样品收集1×106个细胞,酚-氯仿常规抽提DNA,取样加入%琼脂糖凝胶电泳1-2小时,μg/ml溴乙啶溶液染色后,紫外灯下观察结果并拍照。
细胞免疫组织化学法检测胞内半胱天冬酶3活性
收集细胞涂片、固定,滴加1∶150稀释的一抗,洗涤3次,滴加二抗和辣根过氧化物酶标记链霉卵白素,DAB-底物显色,以胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性。
随机记数300个细胞,计算阳性率,阳性率=阳性细胞数/300×100%。
原位杂交法检测baxRNA
收集细胞涂片、固定,3%H2O2/甲醇孵育30分钟,滴加预杂交液恒温40℃孵育3小时,滴加含寡核苷酸探针原位杂交液恒温38℃孵育过夜,滴加生物素化鼠抗地高辛,DAB显色。
细胞阳性率计算方法同上。
统计学处理
实验数据均以均数±标准差表示,采用t检验。
结果
细胞形态学改变
收集细胞涂片、凉干,HE染色后光镜下可见细胞胞膜皱缩,染色质凝集、边缘化,胞质起泡,甚至有凋亡小体形成。
而对照组细胞大小均匀,形态正常。
DFO浓度和作用时间与细胞凋亡的关系
10、50和100μmol/LDFO分别作用于HL-60细胞24、48和72小时,随着作用时间的延长,凋亡率也随之增加,表明DFO呈剂量和时间依赖性地诱导细胞凋亡。
各组与对照组相比均有显着性差异。
Table.EffectsoftheactingtimeandconcentrationofDFOontheapoptoticrateofHL-60cell
DNA降解
HL-60细胞经50μmol/LDFO作用48小时,100μmol/LDFO作用24小时后,对提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳,结果均出现特征性梯形条带,而对照组缺如。
半胱天冬酶-3的激活
HL-60细胞经100μmolDFO作用12小时,半胱天冬酶-3活性亚单位P17免疫活性即开始上升,阳性细胞率为(±)%,对照组阳性细胞率为(±)%,随作用时间的延长阳性细胞率逐渐升高,至72小时达峰值,而后下降。
同一时间点上与对照组相比均有显着性差异。
半胱天冬酶抑制剂对凋亡的阻抑作用
将半胱天冬酶广谱抑制剂Z-AVD与细胞预孵育,使终浓度为10μg/ml,半小时后加入100μmol的DFO,作用24小时和48小时,经AnnexinV-FITC染色,上流式细胞仪检测。
结果表明,凋亡率分别由原来的%、%下降到%、%,(t1=,;t2=,)。
促凋亡基因bax转录的变化
经100μmolDFO作用24小时和48小时后,用原位杂交法检测细胞内baxRNA,阳性细胞率分别为%和%,与对照组的%和%相比具有显着性差异。
讨论
大量的体外实验和临床研究表明,去铁胺可通过螯合细胞内的铁而抑制肿瘤细胞的生长,具有明确的抗肿瘤细胞增殖效应。
研究发现DFO能直接诱导HL-60细胞株凋亡[4],但其诱导细胞凋亡的机制尚不明了。
本研究结果显示,经DFO处理的HL-60细胞呈现典型的凋亡形态学特征,并出现DNA梯状条带,进一步用流式细胞术可检测到AnnexinV-FITC阳性标记的凋亡细胞,提示去铁胺可诱导细胞凋亡,且凋亡率与药物的剂量和作用时间呈依赖性。
因此诱导凋亡是DFO抗肿瘤的重要机制。
在此基础上,我们对DFO诱导HL-60细胞凋亡的可能机制作了进一步的探讨。
Caspase是哺乳动物细胞中普遍存在的半胱氨酸-天冬氨酸特异蛋白酶,其在凋亡过程中起着关键性作用[3]。
Caspase分为两大类:
一类为启动酶,另一类为效应酶。
Caspase-3是caspase效应酶之一,通常以酶原形式存在,通过蛋白水解其内部保守的天冬氨酸残基,形成一有活性的17kD亚单位[5],即半胱天冬酶-3亚单位—P17。
活化的caspase-3直接或通过激活下游的caspase-6、-7等裂解细胞骨架蛋白,降解DNA,执行凋亡。
本研究发现,100μmolDFO作用HL-60细胞12小时后,通过抗P17抗体可检测到细胞内P17免疫活性的升高,caspase-3阳性细胞率为%±%,对照组阳性细胞率为%±%,二者相比有显着性差异。
随作用时间的延长,阳性细胞率逐渐升高,至72小时达峰值,而后下降,这表明caspase-3在这一凋亡过程中被激活。
实验还发现,半胱天冬酶抑制剂Z-AVD可使DFO处理过的细胞凋亡率明显下降,说明caspase-3活性受抑制可降低细胞凋亡率,进一步证实了caspase-3在DFO诱导细胞凋亡过程中的重要作用。
我们从RNA的分子水平又发现,DFO作用HL-60细胞后,凋亡基因bax转录水平明显增高,与对照组相比具有显着性差异,这提示DFO可促进凋亡基因bax的转录,这与Jiang等[6]的研究结果相符。
本研究结果提示,caspase的活化及bax活性的增强可能是DFO诱导HL-60细胞凋亡的重要机制。
但有关DFO诱导HL-60细胞凋亡的分子机理尚有待于进一步研究。
【参考文献】
1LeNT,RichardsonDR.Theroleofironincellcycleprogressionandtheproliferationofneoplasticcells.BiochimBiophysActa,2002;1603:
31-46
2SimonartT,BoelaertJR,MosselmansR,etal.Antiproliferativeandapoptoticeffectsofironchelatorsonhumancervicalcarcinomacells.GynecolOncol,2002;85:
95-102
3CreaghEM,ConroyH,MartinSJ.Caspase-activationpathwaysinapoptosisandimmunity.ImmunolRev,2003;193:
10-21
4HiletiD,PanayiotiodisP,HoffbrandAV.Ironchelatorsinduceapoptosisinproliferatingcells.BrJHaematol,1995;89:
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5KhanSM,DauffenbachLM,YetJ.Mitochondriaandcaspasesininducedapoptosisinhumanluteinizedgranulosacells.BiochemBiophysResCommun,2000;269:
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6JiangXP,WangF,YangDC,etal.InductionofapoptosisbyirondepletioninthehumanbreastcancerMCF-7celllineandthe13762NFratmammaryadenocarcinomainvivo.AnticancerRes,2002;22:
2685-2692
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