核酸电泳相关试剂缓冲液及配制方法.docx

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核酸电泳相关试剂缓冲液及配制方法

三、核酸电泳相关试剂、缓冲液的配制方法

50×TAEBuffer（pH8.5）

组份浓度2MTris-醋酸，100mMEDTA

配制量1L

配制方法1.称量下列试剂，置于1L烧杯中。

Tris

242g

Na2EDTA·2H2O

37.2g

2.向烧杯中加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。

3.加入57.1ml的乙酸，充分搅拌。

4.加去离子水将溶液定容至lL后，室温保存。

10×TBEBuffer（pH8.3）

组份浓度890mMTris-硼酸，20mMEDTA

配制量1L

配制方法l.称量下列试剂，置于lL烧杯中。

Tris

108g

Na2EDTA·2H2O

7.44g

硼酸

55g

2.向烧杯中加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。

3.加去离子水将溶液定容至lL后，室温保存。

10×MOPS（3-吗啉基丙磺酸）Buffer

组份浓度200rnMMOPS，20mMNaOAc，10mMEDTA

配制量1L

41.8gMOPS，置于1L烧杯中。

2.加约700mlDEPC处理水，搅拌溶解。

3.使用2NNaOH调节pH值至7.0。

4.再向溶液中加入下列试剂。

1MNaOAc（DEPC处理）

20ml

0.5MEDTA（pH8.0）（DEPC处理）

20ml

1L。

0.45m滤膜过滤除去杂质。

7.室温避光保存。

注：

溶液见光或高温灭菌后会变黄。

变黄时也可使用，但变黑时不要使用。

溴乙锭（10mg/ml）

组份浓度10mg/ml溴乙锭

配制量100ml

1g溴乙锭，加入到100ml容器中。

2.加入去离子水100ml，充分搅拌数h完全溶解溴乙锭。

3.将溶液转移至棕色瓶中，室温避光保存。

0.5g/ml。

注意：

溴乙锭是一种致癌物质，必须小心操作。

Agarose凝胶

×TBE或1×TAE）。

2.根椐制胶量及凝胶浓度，准确称量琼脂糖粉，加入适当的锥形瓶中。

3.加入一定量的电泳缓冲液（总液体量不宜超过锥形瓶的50%容量）。

注：

用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须统一。

4.在锥形瓶的瓶封上保鲜膜，并在膜上扎些小孔，然后在微波炉中加热熔化琼脂糖。

加热过程中，当溶液沸腾后，请戴上防热手套。

小心摇动锥形瓶。

使琼脂糖充分均匀熔化。

此操作重复数次，直至琼脂糖完全熔化。

必须注意，在微波炉中加热时间不宜过长，每次当溶液起泡沸腾时停止加热，否那么会引起溶液过热暴沸，造成琼脂糖凝胶浓度不准，也会损坏微波炉。

熔化琼脂糖时，必须保证琼脂糖充分完全熔化，否那么，会造成电泳图像模糊不清。

60℃左右，如需要可在此时加入溴乙锭溶液（终浓度0.5µg/ml）。

并充分混匀。

注：

溴乙锭是一种致癌物质。

使用含有溴乙锭的溶液时，请戴好手套。

6.将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子。

凝胶厚度一般在3~5min之间。

7.在室温下使胶凝固（大约30min~1h），然后放置于电泳槽中进行电泳。

注：

凝胶不立即使用时，请用保鲜膜将凝胶包好后在4℃下保存，一般可保存2~5天。

琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨X围

琼脂糖浓度

最佳线形DNA分辨X围（bp）

0.5%

0.7%

1.0%

1.2%

1.5%

2.0%

1,000~30,000

800~12,000

500~10,000

400~7,000

200~3,000

50~2,000

6×LoadingBuffer（DNA电泳用）

组份浓度

30mM

EDTA

36%（V/V）

Glycerol

0.05%（W/V）

XyleneCyanolFF

0.05%（W/V）

BromophenolBlue

配制量500ml

配制方法1.称量下列试剂，置于500ml烧杯中。

EDTA

BromophenolBlue

250mg

XyleneCyanolFF

250mg

2.向烧杯中加入约200ml的去离子水后，加热搅拌充分溶解。

3.加入180ml的甘油（Glycerol）后，使用2NNaOH调节pH值至7.0。

4.用去离子水定容至500ml后，室温保存。

10×LoadlngBuffer（RNA电泳用）

组份浓度

10mM

EDTA

50%（V/V）

Glycerol

0.25%（W/V）

XyleneCyanolFF

0.25%（W/V）

BromophenolBlue

配制置10ml

配制方法1.称量下列试剂，置于10ml离心管中。

0.5MEDTA（pH8.0）

200µl

BromophenolBlue

25mg

XyleneCyanolFF

25mg

2.向离心管中加入约4ml的DEPC处理水后，充分搅拌溶解。

3.加入5ml的甘油（Glycerol）后，充分混匀。

10ml后，室温保存。

四、核酸、蛋白质杂交用相关试剂、缓冲液的配制方法

20×SSC

组份浓度3.0MNaCl，0.3MNa3citrate·2H2O（柠檬酸钠）

配制量1L

配制方法1.称量下列试剂，置于lL烧杯中。

NaCl

175.3g

Na3citrate·2H2O

88.2g

2.向烧杯中加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。

3滴加14NHCl，调节pH值至7.0后，加去离子水将溶液定容至1L。

4.高温高压灭菌后，室温保存。

20×SSPEBuffer

组份浓度3.0MNaCl，0.2MNaH2PO4，0.02MEDTA

配制方法1.称量下列试剂，置于lL烧杯中。

NaCl

NaH2PO4·H2O

Na2EDTA·2H2O

2.向烧杯中加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。

3.加NaOH调节pH值至7.4（约6.5ml的10NNaOH）。

4.加去离子水将溶液定容至lL。

5.高温高压灭菌后，室温保存。

50XDenhardt’S溶液

1%（W/V）

Ficoll400（菲可400/水溶性聚蔗糖400）

1%（W/V）

Polyvinylpyrrolidone

（聚维酮/聚乙烯吡咯烷酮）

1%（W/V）

BSA

组份浓度

配制量500ml

配制方法1.称量下列试剂，置于500ml烧杯中。

Flcoll400

5g

PoLyvlnylpyrrolldone

5g

BSA

5g

2.加去离子水约400ml，充分搅拌溶解

3.加去离子水将溶液定容至500ml。

4.用0.45µm滤膜过滤后，分装成每份25ml。

5.-20℃保存。

0.5M磷酸盐Buffer

组份浓度0.5MNa2HPO4。

配制量lL

134gNa2HPO4·7H2O置于lL烧杯中。

2.加入约800ml的去离子水充分搅拌溶解。

3.加入85%的H3PO4（浓磷酸）调节溶液pH值至7.2。

1L。

5.高温高压灭菌后，室温保存。

SalmonDNA（鲑鱼精DNA）

组份浓度10mg/mlSalmonDNA

配制量约100ml

配制方法1.称取鲑鱼精DNA2g置于500ml烧杯中，加入约200ml的TEBuffer。

2用磁力搅拌器室温搅拌2~4h，溶解后加入4ml的5MNaCl，使其终浓度为0.1M。

3.用苯酚和苯酚/氯仿各抽提1次。

4.回收水相溶液后，使用17号皮下注射针头快速吸打溶液约20次，以切断DNA。

5.加入2倍体积的预冷乙醇进行乙醇沉淀。

6.离心回收DNA后，溶解于100ml的去离子水中。

测定溶液的OD260值。

7.计算溶液的DNA浓度后，稀释DNA溶液至10mg/ml。

min后，分装成小份（1ml/份）。

-20℃保存。

min后，迅速冰浴冷却。

DNA变性缓冲液

组份浓度1.5MNaCl，0.5MNaOH

配制量1L

配制方法1.称量下列试剂，置于lL烧杯中。

NaCl

87.7g

NaOH

20g

2.向烧杯中加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。

3.加去离子水将溶液定容至lL后，室温保存。

预杂交液/杂交液（DNA杂交用）

6×

SSC（或SSPE）

5×

Denhardt’s

0.5%（W/V）

SDS

100µg/ml

SalmonDNA

组份浓度

配制置100ml

配制方法1.称量下列试剂，置于200ml烧杯中。

20×SSC（或SSPE）

30ml

50×Denhardt’s

10ml

10%SDS

5ml

10mg/mlSalmonDNA

1ml

dH2O

54ml

2.充分混匀后，使用0.45µm滤膜滤去杂质后使用。

预杂交液/杂交液（RNA杂交用）

6×

SSC（或SSPE）

5×

Denhardt‘s

0.5%（W/V）

SDS

100g/ml

SalmonDNA

50%（V/V）

Formamlde

组份浓度

配制量100mL

配制方法1.称量下列试剂，置于200ml烧杯中。

20×SSC（或SSPE）

30ml

50×Denhardt’s

10ml

10%SDS

5ml

10mg/mlSalmonDNA

1ml

Formamide（甲酰胺）

50ml

dH2O

4ml

2.充分混匀后，使用0.45µm滤膜滤去杂质后使用。

膜转移缓冲液（Western杂交用）

组份浓度39mMGlycine，48mMTris，0.037%（W/V）SDS，20%（V/V）甲醇

配制量1L

配制方法1.称量下列试剂，置于lL烧杯中。

Glycine

2.9g

Tris

5.8g

SDS

0.37g

2.向烧杯中加入约600ml的去离子水，充分搅拌溶解。

3.加去离子水将溶液定溶至800ml后，加入200ml的甲醇。

4.室温保存。

TBSTBuffer（Western杂交膜清洗液）

组份浓度20mMTris-HCl，150mMNaCl，0.05%（V/V）Tween20

配制量1L

配制方法1.称量下列试剂，置于lL烧杯中。

NaCl

8.8g

1MTris-HCl（pH8.0）

20ml

2.向烧杯中加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。

.5mlTween20后充分混匀。

4.加去离子水将溶液定容至lL后，4℃保存。

封闭缓冲液（Western杂交用）

组份浓度5%（W/V）脱脂奶粉/TBSTBuffer

配制量100ml

5g脱脂奶粉加入到100mlTBSTBuffer中，充分搅拌溶解。

2.4℃保存待用（本封闭液应该现配现用）。

五、实验室常用培养基的配制方法

Ampicillin（氨卡青霉素）（100mg/ml）

组份浓度100mg/mlAmpicillin

配制量50ml

5gAmpicillin置于50ml离心管中。

2.加入40ml灭菌水，充分混合溶解后，定容至50ml。

3.用0.22µm过滤膜过滤除菌。

4.小份分装（1ml/份）后，-20℃保存。

IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）（24mg/ml）

组份浓度24mg/mLIPTG

配制量50mL

1.2gIPTG置于50ml离心管中。

2.加入40ml灭菌水，充分混合溶解后，定容至50ml。

3.用022µm过滤膜过滤除菌。

4小份分装（1ml，份）后，-20℃保存。

X-Gal（20mg/ml）

组份浓度20mg/mlX-Gal

配制量50ml

配制方法1.称量lgX-Gal置于50ml离心管中。

2.加入40mlDMF（二甲基甲酰胺），充分混合溶解后，定容至50ml。

3.小份分装（1ml/份）后，-20℃避光保存。

LB培养基

组份浓度1%（W/V）Tryptone（胰蛋白胨），0.5%（W/V）YeastExtract（酵母提取物），1%（W/V）NaCl

配制量1L

配制方法1.称取下列试剂，置于lL烧杯中。

Tryptone

10g

YeastExtract

5g

NaCl

10g

2.加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。

3.滴加5NNaOH（约0.2m1），调节pH值至7.0。

1L。

5高温高压灭菌后，4。

C保存。

LB/Amp培养基

组份浓度

1%（W/V）

Tryptone

0.5%（W/V）

YeastExtract

1%（W/V）

NaCl

0.1mg/ml

Ampicillin

配制量1L

配制方法1.称取下列试剂，置于lL烧杯中。

Tryptone

10g

YeastExtract

5g

NaCl

10g

2.加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。

3.滴加5NNaOH（约0.2mL）。

调节pH值至7.0。

1L。

5.高温高压灭菌后，冷却至室温。

6.加入1mlAmpicillin（100mg/ml）后均匀混合。

7.4℃保存。

1.2%（W/V）

Tryptone

2.4%（W/V）

YeastExtract

0.4%（V/V）

Glycerol

17mM

KH2PO4

72mM

K2HPOa

TB培养基

组份浓度

配制方法1.配制磷酸盐缓；中液（0.17MKH2PO4，0.72MK2HPO4）100ml。

溶解2.31gKH2PO4和l2.54gK2HPO4于90ml的去离子水中，搅拌溶解后，加去离子水定容至100ml，高温高压灭菌。

2.称取下列试剂，置于lL烧杯中。

Tryptone

12g

YeastExtract

24g

Glycerol

4m

3.加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。

1L后，高温高压灭菌。

60℃以下时，；加入100ml的上述灭菌磷酸盐缓冲液。

6.4℃保存。

TB/Amp培养基

组份浓度

1.2%（W/V）

Tryptone

2.4%（W/V）

YeastExtract

0.4%（V/V）

Glycerol

17mM

KH2PO4

72mM

K2HPO4

0.1mg/ml

Ampicillin

配制量1L

配制方法1.配制磷酸盐缓冲液（0.17MKH2PO4，0.72MK2HPO4）100ml。

溶解2.31gKH2PO4,和K2HPO4于90ml的去离子水中，搅拌溶解后，加去离子水定容至100ml，高温高压灭菌。

2.称取下列试剂，置于lL烧杯中。

Tryptone

12g

YeastExtract

24g

Glycerol

4ml

3.加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。

4.加去离子水将培养基定容至lL后，高温高压灭菌。

60℃以下时，加入100ml的上述灭菌磷酸盐缓冲液。

4℃保存。

SOB培养基

组份浓度

2%（W/V）

Tryptone

0.5%（W/V）

YeastExtract

0.05%（W/V）

NaCl

KCl

10mM

MgCl2

配制量1L

250mMKCl溶液。

在90ml的去离子水中溶解l.86gKCl后，定容至100ml。

2MMgCl2溶液。

在90ml去离子水中溶解19gMgCl2后，定容至100ml，高温高压灭菌。

3.称取下列试剂，置于lL烧杯中。

Tryptone

20g

YeastExtract

5g

NaCl

0.5g

4.加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。

10m1250mMKCl溶液，加入到烧杯中。

6.滴加5NNaOH溶液（约0.2m1），调节pH值至7.0。

7.加入去离子水将培养基定容至lL。

8.高温高压灭菌后，4℃保存。

9.使用前加入5ml灭菌的2MMgCl2溶液。

SOC培养基

组份浓度

2%（W/V）

Tryptone

0.5%（W/V）

YeastExtract

0.05%（W/V）

NaCl

2.5mM

KCl

10mM

MgCl2

20mM

Glucose

配制量100mL

配制方法1.配制lMGlucose溶液。

将18gGlucose溶于90ml去离子水中，充分溶解后定容至100ml。

用0.22µm滤膜过滤除菌。

2.向l00mlSOB培养基中加入除菌的1MGlucose溶液2ml，均匀混合。

3.4℃保存。

2×YT培养基

组份浓度1.6%（WV）Tryptone，1%（W/V）YeastExtract，0.5%（W/V）NaCl

配制量1L

配制方法1.称取下列试剂，置于lL烧杯中。

Tryptone

16g

YeastExtract

10g

NaCl

5g

2.加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。

3.滴加5NNaOH，调节pH值至7.0。

1L。

5.高温高压灭菌后，4℃保存。

Фb×broth

组份浓度2%（W/V）Tryptone，0.5%（W/V）YeastExtract，o5%（W/V）MgSO4·7H2O

配制量1L

配制方法1.称取下列试剂，置于lL烧杯中。

Tryptone

20g

YeastExtract

5g

MgSO4·7H2O

5g

2.加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。

3.滴加1NKOH。

调节pH值至7.5。

1L。

5.高温高压灭菌后，4℃保存。

NZCYM培养基

组份浓度

0.5%（WV）

YeastExtract

0.1%（WV）

CasaminoAcid（酪蛋白氨基酸）

1%（WV）

NZ胺

0.5%（WV）

NaCl

0.2%（WV）

MgSO4·7HO

配制量1L

配制方法1.称取下列试剂。

置于lL烧杯中。

YeastExtract

5g

CasaminoAcid

1g

NZ胺

10g

NaCl

5g

MgSO4·7HO

2g

2.加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。

3.滴加5NNaOH（约0.2m1），调节pH值至7.0。

1L。

5.高温高压灭菌后，4℃保存。

NZYM培养基

组份浓度

0.5%（WV）

YeastExtract

1%（WV）

NZ胺

0.1%（WV）

NaCl

0.2%（WV）

MgSO4·7HO

配制方法NZYM培养基除不含CasaminoAcid外，其他成份与NZCYM培养基相同。

NZM培养基

组份浓度

1%（WV）

NZ胺

0.1%（WV）

NaCl

0.2%（WV）

MgSO4·7HO

配制方法NZM培养基除不含YeastExtract（酵母提取物）外，其他成份与NZYM培养基相同。

一般固体培养基的配制

配制方法1.按照液体培养基配方准备好液体培养基，在高温高压灭菌前，加入下列试剂中的一种。

Agar（琼脂；铺制平板用）

15g/L

Agar（琼脂；配制顶层琼脂用）

7g/L

Agarose（琼脂糖；铺制平板用）

15g/L

Agarose（琼脂糖；配制顶层琼脂用）

7g/L

2.高温高压灭菌后，戴上手套取出培养基，摇动容器使琼脂或琼脂糖充分混匀（此时培养基温度很高，小心烫伤）。

3.待培养基冷却至50~60℃时，加入热不稳定物质（如抗生素等），摇动容器充分混匀。

4.铺制平板（30~35ml培养基/90mm培养皿）。

LB/Amp/X-Gal/LPTG平板培养基

组份浓度

1%（W/V）

Tryptone

0.5%（W/V）

YeastExtract

1%（W/V）

NaCl

0.1mg/ml

Ampicillin

0.024mg/ml

IPTG

0.04mg/ml

X-GaL

1.5%（W/V）

Agar

配制量1L

配制方法1.称取下列试剂，置于lL烧杯中。

Tryptone

10g

YeastExtract

5g

NaCl

10g

2.加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。

3.滴加5NNaOH（约0.2mL），调节pH值至7.0。

1L后，加入15gAgar。

5.高温高压灭菌后，冷却至60℃左右。

6.加入1mlAmpicillin（100mg/ml）、1mlIPTG（24mg/ml）、2mlX-Gal（20mg/mL）后均匀混合。

7.铺制平板（30~35ml培养基/90mm培养皿）。

8.4℃避光保存。

TB/Amp/X-Gal/LPTG平板培养基

组份浓度

1.2%（W/V）

Tryptone

2.4%（W/V）

YeastExtract

0.4%（V/V）

Glycerol

17mM

KH2PO4

72mM

K2HPO4

0.1mg/ml

Ampicillin

0.024mg/ml

IPTG

X-GaL

1.5%（W/V）

Agar

配制量1L

配制方法1.配制磷酸盐缓冲液（0.17MKH2PO4，0.72MK2HPO4）100ml。

溶解2.31gKH2PO4和K2HPO4于90ml的去离子水中，搅拌溶解后，加去离子水定容至100ml，高温高压灭菌。

2.称取下列试剂，置于lL烧杯中。

Tryptone

12g

YeastExtract

24g

Glycerol

4ml

3.加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。