分子生物学试验技术.docx

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分子生物学试验技术

第五章分子生物学实验技术

实验21大鼠肝组织DNA的提取及其含量测定

【原理】DNA以核蛋白形式存在于细胞中，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。

DNA的提取方法较多，根据实验用途可简可繁。

这里介绍一种经济简便不用蛋白酶K提取真核细胞DNA的方法。

在DNA抽提缓冲液中，加入SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离；加入EDTA可抑制DNase活性，减少DNA降解。

分离出来的DNA用酚/氯仿抽提除去蛋白质，接着用氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染，最后用无水乙醇沉淀DNA。

260nm处DNA有最大吸收峰，利用该原理测DNA的A260，可计算其浓度。

【试剂】

1．生理盐水。

2．TE缓冲液（pH8.0）含10mmol/LTris-HCl（pH8.0），1mmol/LEDTA-Na2（pH8.0），以103.4Kpa高压蒸汽灭菌，4℃贮存。

3．10%SDS固体SDS10g，加双蒸水70ml于42℃水浴溶解，用双蒸水定容至100ml。

4．Tris-HCl饱和重蒸酚（pH8.0）将市售的苯酚置于65℃水浴中溶解，用空气冷凝管进行重蒸馏，当温度升高至183℃时开始收集于数个棕色瓶中（每瓶约200ml），贮存于－20℃可保存数年。

使用前取一瓶重蒸酚于室温放置一段时间后，移至65℃水浴融化（冰箱取出后勿立即放入65℃水浴中，以防玻璃炸裂）。

融化后加8-羟基喹啉至终浓度为0.1%（w/v），溶解混匀，此时溶液呈黄色，小心将酚倒入分液漏斗中。

加入等体积的1mmol/LTris-HCl（pH8.0），立即加盖，剧烈振荡并加入固体Tris摇匀（一般加1g固体Tris/100ml酚）。

静置分层后从分液漏斗中放出下层黄色酚相，弃上层。

将酚重新加至分液漏斗中，加入等体积的含0.2%β-巯基乙醇的0.1mol/LTris-HCl（pH8.0），剧烈振荡，直至酚相pH＞7.8，将酚装入棕色试剂瓶中，加入0.1倍酚体积的含0.2%β-巯基乙醇的0.1mol/LTris-HCl（pH8.0）覆盖酚相，置4℃贮存备用。

由于酚重蒸和平衡费时，操作有一定危险，因此也可直接从试剂公司购买Tris-HCl饱和重蒸酚。

5．氯仿/异戊醇（24:

1，v:

v）均为分析纯。

6．10mol/L醋酸铵。

7．无水乙醇（AR）。

8．10mg/mlRNaseA称取RNaseA10mg溶于10mmol/LTris-HCl（pH7.5）、15mmol/LNaCl中，于100℃加热煮沸15min灭活DNase，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于－20℃。

如为Sigma公司产品，一般则不需加热煮沸。

【操作步骤】

1．迅速处死大鼠，立即取出肝脏约1g，用冷生理盐水洗去附着的血液，滤纸吸干后放入玻璃匀浆器，加入5ml冷TE缓冲液制备匀浆。

2．取1ml匀浆液倒入小试管中，加入10%SDS溶液0.1ml，颠倒混匀后，室温10min，溶液变粘稠。

3．取饱和酚0.5ml，氯仿：

异戊醇（24：

1）0.5ml，混合后加入上述溶液中，充分混匀，室温放置10min，其间不断摇动保持溶液呈乳状，3000r/min离心10min。

4．小心取出上层水相至小试管中，加入等体积氯仿：

异戊醇（24：

1），混匀，3000r/min，离心5min。

5．小心取出上层水相转移到新试管，加入0.3倍水相体积的10mol/L醋酸铵，2.5倍水相体积的无水乙醇充分混匀，纤维状DNA即从溶液中析出。

6．用吸管小心取出纤维状DNA，转移到1.5ml离心管，3000r/min，离心5min，小心倒去溶液，用滤纸吸干。

7．加1ml蒸馏水和5μl浓度为10mg/ml的RNaseA溶解DNA沉淀，室温放置20min。

如DNA难于溶解，可置于56℃水浴20～30min，并不断摇动，直至溶解。

8．DNA的含量测定：

取0.5mlDNA样品和蒸馏水3.5ml至石英杯中，用蒸馏水调零，在752紫外分光光度计上测A260值和A280值。

【计算】

1．DNA浓度（μg/ml）＝A260nm×50×4÷0.5

2．A260nm/A280nm比值

【注意事项】

1．剧烈振荡可使DNA断裂，因此操作中不能用电动振荡器混匀。

2．如要得到高纯度DNA，可加入蛋白酶K降解蛋白质。

3．根据DNA在260nm处有一吸收峰，而蛋白质在280nm处有一吸收峰的原理，可测定A260nm/A280nm比值检测DNA的纯度，该比值接近1.8～2.0表示蛋白质污染极少。

4．制备重蒸酚和平衡酚过程中应戴手套，防止灼烧皮肤。

附：

外周血细胞DNA的快速提取

【原理】从全血制备白细胞DNA可用非离子去污剂NP40和低盐缓冲液直接破裂血中红细胞和白细胞的细胞膜，释出血红蛋白及细胞核，通过离心获得白细胞的细胞核，向核悬液中加入SDS破裂核膜，并使DNA从核蛋白中解离，溶解在一定浓度的NaCl中，经乙醇沉淀即可得到DNA。

缓冲液中Mg2+的浓度对于获得完整的高分子量DNA十分重要，本实验低盐缓冲液中Mg2+浓度是4mmol/L，如超过10mmol/L可导致DNA的降解。

缓冲液中的EDTA可抑制DNA的降解。

【操作步骤】

1．取0.5ml外周血置于1.5mlEppendorf（EP）管中，EDTA-Na2抗凝（每管预先加入0.3mol/LEDTA-Na230μl），3000r/min离心5min，弃血浆，得沉淀部分。

2．加0.5ml低盐缓冲液（10mmol/LTris-HCl，pH7.6，10mmol/LKCl，4mmol/LMgCl2，2mmol/LEDTA），12.5μl的20%NP40，振荡破碎红细胞，5000r/min离心5min，弃上清。

3．用低盐缓冲液洗白细胞2次（每次5000r/min离心5min），弃上清。

4．加入250μl低盐缓冲液，20μl的10%SDS，混匀，50℃水浴温育10min。

5．加入100μl饱和NaCl（称取4g氯化钠，溶于10ml蒸馏水中即成），剧烈振荡2min，4℃，12000r/min离心10min。

6．吸上清于另一干净EP管中，加入1ml预冷的无水乙醇沉淀DNA，12000r/min离心2min，弃上清。

7．加1ml预冷的70%乙醇洗涤DNA2次，12000r/min离心2min，弃上清，将EP管倒置于滤纸上，室温干燥。

8．加250μlTE缓冲液溶解DNA，紫外定量，4℃冰箱保存备用。

【评价】本实验可在不到1h内快速提取高质量未降解的全血DNA。

实验提取的全血DNA贮存在室温或37℃温育24h与冻存在－70℃的DNA质量一样，但DNA反复冻融4次以上可导致部分降解。

本实验可用于提取少至10μl全血样品（可获得340ng左右DNA）或干燥的血液样品，因此本实验适用范围较广。

实验22碱裂解法从大肠杆菌中制备质粒DNA

从大肠杆菌细胞中分离质粒DNA的方法众多，其分离的依据可根据分子大小不同、碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的特点进行。

目前常用的有碱裂解法（又称碱变性抽提法）、羟基磷灰石柱层析法、质粒DNA释放法、酸酚法、两相法以及溴化乙锭-氯化铯密度梯度离心法。

以上方法各有利弊。

但总结多数实验室的实践经验，认为碱裂解法效果良好，经济且收率较高，是一种使用最广泛的制备质粒DNA的方法，也是当今分子生物学研究中的常规方法。

制备的质粒DNA可用于酶切、连接、转化以及PCR等。

【原理】碱裂解分离质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。

当细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性，加入醋酸钾中和液，进行离心后，它们随细胞碎片沉淀下来，而变性的质粒DNA又恢复到原来的构型留在上清中，再经酚/氯仿抽提乙醇沉淀等步骤获得质粒DNA。

质粒DNA的存在形式有3种：

①共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；②开环DNA，此种质粒DNA两条链中有一条发生一处或多处断裂；③线性DNA，因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成。

在电泳时同一质粒DNA的3种形式泳动速度：

超螺旋＞线性＞开环。

【试剂】

1．菌种含pBR322或其他质粒DNA的大肠杆菌工程菌如HB101，DH5α，JM109等，如实验后需直接酶切制备的质粒DNA，可选用科研工作中用EcoRⅠ非定向克隆构建的重组质粒DNA转化的大肠杆菌。

2．LB液体培养基称取胰蛋白胨3.0g，酵母提取物1.5g，NaCl3.0g，加双蒸水200ml溶解，用5mol/LNaOH调至pH7.4，定容至300ml，转移至三角烧瓶中，以103.4Kpa高压灭菌20min。

3．10mg/ml氨苄青霉素（Amp）溶液在无菌条件下配制，－20℃贮存备用。

4．含Amp的LB固体培养基每100mlLB培养液在临高压灭菌前加入1.5g琼脂，以103.4KPa高压灭菌20min，溶液尚未完全冷却时，即应取出培养基，并轻轻摇动以使琼脂均匀分布于整个培养基中。

必须小心，此时培养基溶液可能过热，旋动液体会发生暴沸。

应使培养基降温至50℃（用手背碰一下瓶壁不致烫手），方可加入Amp，按每100ml培养基加10mg/mlAmp溶液1ml，使其终浓度为100μg/ml，然后在超净台上铺平板，90mm直径的培养皿约需25ml培养基。

5．Tris-HCl饱和酚（pH8.0）与TE缓冲液同实验21。

6．溶液Ⅰ含50mmol/L葡萄糖，10mmol/EDTA-Na2，25mmol/LTris-HCl（pH8.0），临用前加溶菌酶至2mg/ml。

7．溶液Ⅱ含200mmol/LNaOH，10g/LSDS，临用前用两种溶液的贮存液配制。

8．溶液Ⅲ5mol/L醋酸钾溶液60ml（称取29.4g醋酸钾定容至60ml），冰醋酸11.5ml和双蒸水28.5ml混合而成。

9．10mg/mlRNaseA同实验21。

10．50×TAE电泳缓冲液取Tris24.2g，冰醋酸5.7ml，0.25mol/LEDTA（pH8.0）20ml，加蒸馏水至100ml。

1×TAE为配制琼脂糖凝胶及其电泳的应用缓冲液。

11．溴酚蓝指示剂溶液（6×上样缓冲液）称取溴酚蓝100mg，加双蒸水5ml，在室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖25g，加双蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀后定容至50ml，加入NaOH1滴，调至蓝色。

12．1mg/ml溴化乙锭（EB）戴手套谨慎称取EB20mg于棕色试剂瓶中，加20ml双蒸水，溶解后贮于4℃备用，配制琼脂糖凝胶时每100ml凝胶加50μlEB。

13．DNA分子量标准根据需要购买，一般浓度为0.5μg/μl。

13．其他试剂氯仿、异丙醇、无水乙醇、琼脂糖、异戊醇。

【操作步骤】

1．用接种环挑取1环冷冻保存的含质粒DNA大肠杆菌工程菌，划线接种于含有Amp的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养约12h（过夜）。

2．用接种针或消毒牙签挑取单菌落于盛有2mlLB液体培养基（含100μg/mlAmp）的试管中，37℃摇荡培养过夜。

3．将菌液收集在1.5ml的EP管中，10000r/min离心2min，弃上清，将离心管倒置于一纸巾上，以使所有液体流出。

4．在沉淀中加入溶液Ⅰ100μl，涡旋混匀，静置5min。

5．加入新鲜配制的溶液Ⅱ200μl，颠倒数次，轻轻混匀，冰浴5～10min（溶液变透明，粘稠）。

6．加入溶液Ⅲ150μl，颠倒混匀，冰浴5～10min（溶液出现白色沉淀）。

7．12000r/min离心2min，将上清转移至另一EP管中。

8．加等体积酚抽提1次，12000r/min离心2min，取上层水相转移至另一EP管。

9．加等体积氯仿/异戊醇（24：

1，v/v）抽提1次，12000r/min离心2min，取上层水相转移至另一EP管。

10．加入2倍体积无水乙醇振荡混匀，于室温放置2min沉淀DNA。

12000r/min，离心5min，弃乙醇。

11．用70%乙醇洗涤沉淀，12000r/min，离心5min，弃乙醇，室温下静置使乙醇挥发或真空干燥。

12．用50μl含RNaseA的TE缓冲液溶解DNA沉淀，振荡，室温放置20min。

13．制备琼脂糖凝胶按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量，见表5-1。

表5-1琼脂糖凝胶浓度与分辨DNA大小范围的关系

凝胶中的琼脂糖含量[%（w/v）]线性DNA分子的有效分离范围（kb）

0.35～60

0.61～20

0.70.8～10

0.90.5～7

1.20.4～6

1.50.2～3

2.00.1～2

称取0.8g琼脂糖倒入三角瓶中，加入1×TAE缓冲液100ml，置微波炉或水浴加热至完全熔化，取出摇匀，稍冷却后加50μlEB染色液，摇匀。

14．灌胶

（1）取洁净的电泳内槽（又称托盘），用橡皮膏或透明胶带将内槽的两端边缘封好（一定要封严，不能留缝隙）。

（2）将内槽放置于一水平台面，并插好所需齿数和厚度的样品梳子。

（3）将冷却至60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓慢倒入内槽，直至所需厚度，注意不要形成气泡，特别是梳子下，如有气泡可用牙签挑破。

（4）待胶凝固后，小心取出梳子，撕去橡皮膏或透明胶带，将带凝胶的内槽放入电泳槽中，注意凝胶点样端要靠近负极。

（5）加入1×TAE缓冲液至电泳槽，缓冲液刚没过凝胶表面即可。

15．加样剪取适当大小的蜡膜（Parafilm膜），取6×上样缓冲液1μl点于膜上数点，取5μl质粒DNA和2μlDNA分子标准（约1μg）分别与上样缓冲液混匀，将其分别加入凝胶的点样孔（记录点样顺序及点样量）。

16．电泳接通电源槽与电泳仪的电源（检查正负极，DNA片段是从负极向正极移动）。

DNA的迁移率与电压成正比，电压不超过5V/cm凝胶长度。

当溴酚蓝染料移动至凝胶前沿1～2cm处，切断电源，停止电泳。

17．观察结果取出内槽，在紫外分析仪的玻璃平板上小心推出凝胶，通过防护屏或戴防护眼镜观察紫外灯透射的结果，DNA存在处应显出桔红色荧光条带，一般可观察到2种或3种质粒形式。

【注意事项】

1．应先在实验前2天划线接种细菌，实验前1天晚上进行单菌落液体培养，并注意无菌操作。

2．加入溶液Ⅰ时可用力振荡，而加入溶液Ⅱ5min后，如溶液不变粘稠（用移液嘴沾吸没有丝状物出现），则应终止实验。

检查使用的试剂是否正确，加量是否正确。

3．溶液Ⅰ中的溶菌酶宜临用前加入。

溶液Ⅱ也应临用前用母液配制。

4．琼脂糖凝胶的配制可安排在真空干燥和RNaseA处理的实验间隙，为便于电泳后直接可观察结果，EB可在琼脂糖加热熔化至灌胶前加入。

因此整个电泳过程均应戴手套操作。

5．EB是DNA的诱变剂，亦是极强的致癌物，配制和使用过程中要小心，操作时一定要戴手套，用过的手套要及时把手套顺手翻过来，让污染有EB的面朝里，有EB的废液和器皿要分别处理好。

附：

一步法提取质粒DNA

小规模快速制备质粒DNA是筛选大批重组质粒的阳性克隆的一个不可缺少的步骤，常规经典的方法是碱裂解法。

通过该方法制备出来的质粒DNA既可进行琼脂糖凝胶电泳，也可进行限制性酶切分析。

但该方法在一次筛选数十个克隆时就显得操作步骤烦琐，费时较多。

这里介绍一种经本人改良的简便快速的质粒DNA制备方法[见：

刘新光，刘文，梁念慈.一种快速可靠的小量制备质粒DNA的方法.基础医学与临床，1998，18（5）：

396]，可作为今后科研中大量筛选时使用。

本方法较经典的碱裂解法省去了碱裂解和乙醇沉淀与洗涤步骤，直接用酚/氯仿一步抽提，十分简单实用。

【操作步骤】

1．收获1.5ml过夜培养菌液于1.5mlEP管中，在12000r/min离心10s。

2．弃去培养液并尽量吸干（使用微量台式真空泵较方便），加入50μlTE缓冲液（pH8.0），用涡旋混合器振荡以悬浮细胞。

3．用1ml玻璃刻量吸量管吸取酚/氯仿（1:

1）混合液1ml，每个EP管加入50μl，在涡旋混合器上振荡10s后，以12000r/min离心5min。

4．小心取出40μl上清至另一个1.5mlEP管中，加入RNaseA至终浓度50μg/ml，室温放置5min。

5．取5μl质粒溶液（与1μl6×上样缓冲液混合）进行0.6%～1%琼脂糖凝胶电泳，并以空载体DNA作对照，根据电泳结果即可判断有无外源DNA插入。

6．取适当量可能含重组载体的质粒溶液进行限制性酶切分析。

实验23PCR扩增目的DNA

【原理】聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）类似于DNA的天然复制过程，是一种体外扩增特异性DNA的技术。

PCR是在模板DNA、两条寡核苷酸引物和4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）存在的条件下，耐热的TaqDNA聚合酶催化的酶促反应。

PCR反应的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。

反应分3步：

①变性：

通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA。

②退火：

当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少。

③延伸：

TaqDNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应，以上3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段可大量复制，数量可达2×106～7拷贝。

本实验不设计特定引物，各实验室可充分利用科研用不完的引物开展本实验。

一旦一对引物序列确定，PCR扩增长度也就确定。

【试剂】

1．TaqDNA聚合酶国产或进口酶，浓度为5U/μl，均配有相应的缓冲液和MgCl2。

2．10×扩增缓冲液含500mmol/LKCl，100mmol/LTris-HCl（pH9.0于室温），1%TritonX-100。

3．25mmol/LMgCl2此为应用液浓度的10倍，配套供应。

4．dNTP为4种脱氧核苷三磷酸的混合液，有商品出售，一般浓度为各2.5或10mmol/L。

5．上游引物或下游引物引物的正确设计是PCR反应成功扩增的一个关键条件，必须遵循一定的原则，最好在引物设计时有计算机辅助分析。

设计好后国内有关公司可代理合成，按要求用灭菌三蒸水或去离子水溶解配制成25μmol/L，分装，－20℃冻存备用。

6．DNA模板实验21提取的大鼠组织DNA或人白细胞基因组DNA（配成约1μg/μl浓度）；或纯化的重组质粒DNA（配成2ng/μl）。

7．灭菌轻矿物油或石蜡油：

视PCR仪器的型号决定是否需要。

8．琼脂糖凝胶电泳所需试剂（琼脂糖、电泳缓冲液和上样缓冲液）：

见实验22。

9．DNA分子量标准：

国产或进口产品，可根据扩增带的大小选择。

【操作步骤】

1．按以下顺序，用微量移液器将各成分分别加入在0.2ml或0.5ml灭菌薄壁离心管中。

试剂

加样量

最终浓度

10×扩增缓冲液

5μl

1×扩增缓冲液

25mmol/LMgCl2

5μl

2.5mmol/L

2.5或10mmol/LdNTP

4或1μl

0.2mmol/LdNTP

25μmol/L上游引物

1μl

25pmol（0.5μmol/L）

25μmol/L下游引物

1μl

25pmol（0.5μmol/L）

基因组DNA或质粒DNA

5μl

5μg或10ng

TaqDNA聚合酶

0.2μl

1U

灭菌三蒸水

29μl或32μl

反应总体积

50μl

加盖，用手指轻弹离心管底部，使溶液混匀，在台式离心机中离心2秒以集中溶液于管底，加灭菌轻矿物油或石蜡油50μl封住溶液表面，防止溶液的蒸发（如是2400，9600或9700型PCR仪则不需加）。

2．视预实验的条件，按以下参数在PCR仪上进行扩增25～35个循环。

一般PCR反应的参数为：

94℃变性1min;55℃退火1min;72℃延伸1min;其中第1个循环94℃变性5min℃，最后一个循环72℃延伸10min。

3．取5μlPCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察有否有预定大小的DNA片段。

【注意事项】由于PCR具有超敏感性的特点，极微量的污染便可导致假阳性结果。

污染可能来自样品污染、扩增试剂仪器污染和扩增产物交叉污染等。

其主要预防措施有：

1．工作区隔离分样品处理区和PCR扩增分析区。

2．试剂取样及分装要用绝对安全无污染的器皿；对于大包装的试剂用前应分成小包装。

3．注意实验操作①操作时要戴手套，如有污染要及时更换；②离心管每次开盖前要离心片刻，开盖要小心，防止液体溅出；③常用预混试剂应先加试剂，后加DNA模板；④吸每种试剂均要换移液嘴（tip），在临床检测实验室中吸试剂用的移液器还要与吸DNA模板的移液器要分开。

4．在临床检测时每次PCR均同时设阳性对照、阴性对照和弱阳性对照。

5．污染处理①稀酸处理法：

常用稀酸处理含有扩增产物的离心管，琼脂糖凝胶和电泳槽及电泳托盘等；②紫外线照射PCR工作室，特别是电泳槽、电泳托盘、离心机、冰盒、移液器等。

实验24DNA限制性图谱的绘制

-------DNA的限制性内切酶酶切分析

【原理】限制性内切酶（restrictionendonuclease，RE）是由细菌自己产生的能识别双链DNA分子中的特定碱基顺序，并以内切方式水解核酸中的磷酸二酯键的核酸水解酶。

它可分为三种类型：

Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，Ⅱ型酶就是通常所指的RE，能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行切割。

它是基因工程中剪切DNA分子的常用工具酶，被誉为分子生物学家的手术刀。

临床上某些遗传病是由于基因的缺失或插入或突变所致，可造成RE酶切位点的改变，故当用一定的RE切割时，其切开的片段（分子量）大小与正常人发生差异，即DNA限制性图谱发生改变，据此可达到基因诊断的目的。

本实验选用价格低廉、酶切效果好的EcoRⅠ（识别位点G↓AATTC）对λDNA进行酶切，观察RE的特定切割作用及其限制性图谱，理论上可产生分子量分别为21226bp，7421bp，5804bp，5604bp，4878bp和3530bp片段。

或选用实验22制备的EcoRⅠ非定向克隆构建的重组质粒DNA作为EcoRⅠ酶切底物，产生载体与插入片段2个片段。

【试剂】

1．λDNA、实验21制备的基因组DNA或实验22制备的EcoRⅠ非定向克隆构建的重组质粒DNA。

2．DNA分子量标准。

3．限制性内切酶EcoRⅠ及其缓冲液（只需购买国内试剂公司的产品即可，每种RE均配有2种缓冲液，在配套的缓冲液中该RE均可获得100%酶切活性）。

4．电泳缓冲液、琼脂糖、溴酚蓝指示剂及EB同实验22。

【操作步骤】

1．将下列试剂缓冲液2μl，λDNA（5μg）或基因组DNA（5μg）或质粒DNA样品（1μg），EcoRⅠ5～10U加至0.5mlEP管中，加双蒸水至20μl，加盖，混匀后稍离心，37℃水浴反应1h。

2．取5μl酶切后的样品，0.5～1μg未酶切λDNA或基因组DNA或质粒DNA，DNA分子量标准（均要与上样缓冲液混合）进行0.8%的琼脂糖凝胶电泳（EB已预先加入琼脂糖凝胶中），在紫外检测仪上观察结果。

3．在镜头前加一块红色滤光片，使用100º黑白胶卷，利用透射紫外光作光源，光圈2.8，曝光0.5～2s，调准焦距，可拍摄质量较好的凝胶照片。

有条件则使用DNA一次成像仪。

【注意事