CRISPRCas9基因编辑操作步骤及详细说明.docx
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CRISPRCas9基因编辑操作步骤及详细说明
CRISPRCas9基因编辑操作步骤及详细说明
实验材料与方法
一、细胞培养
人宫颈癌细胞HeLa,常规培养使用含10%FBS的DMEM培养基(含1.5mg/L-Glutamine,100U/mLPenicillin,100μg/mL
Streptomycin)中,37ºC5%CO2饱和湿度培养箱中培养。
二、基因信息及双gRNA设计
基因信息及分析
1.hsa-mir-152基因信息:
pubmed
2.hsa-mir-152基因位于蛋白编码基因COPZ2内含子内,敲除hsa-mir-152基因不会影响该蛋白编码
3.hsa-mir-152precursor序列(87bp):
TGTCCCCCCCGGCCCAGGTTCTGTGATACACTCCGACTCGGGCTCTGGAGCAGTCAGTGCATGACAGAACTTGGGCCCGGAAGGACC
双gRNA设计
使用在线gRNA设计软件
在hsa-mir-152precursor基因组序列两侧设计双gRNA
编号
序列
靶点方向
理论缺失
dgRNA1
AGCGCAGGTCCAGCCCGGCCAGG
上游+
132bp
GAAGGACCTTCTGCACCCAACGG
下游+
dgRNA2
TCAGCTGGAAGAAGGAGGCTCGG
上游+
102bp
CTGTGCCCGTTGGGTGCAGAAGG
下游-
dgRNA3
GTGTATCACAGAACCTGGGCCGG
上游-
54bp
AGTCAGTGCATGACAGAACTTGG
下游+
注:
dgRNA即为双gRNA.
三、慢病毒侵染
实验材料及试剂
DMEM培养基+10%FBS
D-Hank’sSolutionTrypsin-EDTASolution
96孔板
24孔板
Lentivirus-病毒液(GenePharma)
步骤
靶细胞侵染实验
1.靶细胞铺板:
24-well,加入2.5×105cells/well(根据细胞种类调整),0.5mL完全培养基,37℃,5%CO2过夜;
2.稀释病毒:
稀释液(靶细胞维持液培养基)400μL+终浓度5μg/mLPolybrene,将慢病毒原液按1:
9加入到稀释液中;
3.移去Step1中细胞培养液,加入Step2稀释后的病毒液,同时建立对照(blank、negative),37℃,5%CO2过夜;
4.12~24小时移去细胞侵染后的病毒液,加入0.5mL完全培养基,37℃,5%CO2过夜;
5.根据细胞状态和类型,如果必要分出1/3~1/5,加入
0.5mL完全培养基,继续培养24~48小时,荧光倒置显微镜下观察结果。
四、鉴定引物及突变检测
鉴定引物
PCR引物
序列
WT
MT
hMIR152-dg-F
AGTTCTGGGTCCGTTTGGAGTGG
461bp
461bp-理论缺失
hMIR152-dg-R
GGCCCTAGGATACATCCTCAGGC
试剂和仪器
GenomicDNAExtractionkit
PCR基因扩增仪电泳仪
基因组DNA的提取
1.将收到的细胞6000rpm,离心2分钟,去上清;
2.加入10μL的ddH2O,重悬细胞,加入9μL的GBbuffer、1μL的ProK、0.5μL的RNaseA,充分混匀后,将EP管安插在泡沫板上,放至56℃水浴锅里温浴10分钟;
3.将裂解液转移至新的0.5mL的EP管中,放至PCR仪上,95℃处理10分钟,以失活其中的蛋白酶(ProK);
4.得到细胞的基因组用于PCR检测。
PCR检测
1.PCR反应体系
组分
终浓度
用量
2×Maxbuffer
1×
25μL
dNTPMix(10mM)
0.2mM
1μL
hMIR152-dg-F(10μM)
0.4μM
2μL
hMIR152-dg-R(10μM)
0.4μM
2μL
基因组DNA模板
—
2μL
MaxDNA聚合酶(2.5U/μL)
1U/μL
1μL
ddH2O
—
17μL
2.PCR反应程序
循环步骤温度
时间
循环数
预变性95℃
3分钟
1
变性95℃
15秒
退火60℃
15秒
42
延伸72℃
25秒
终延伸72℃
5分钟
1
保存16℃
1分钟
1
3.PCR产物的测序鉴定
使用hMIR152-dg-F和hMIR152-dg-R引物进行PCR及测序。
五、最小致死浓度摸索及稳筛株筛选
实验材料及试剂
DMEM培养基+10%FBS
D-Hank’sSolutionTrypsin-EDTASolutionPuromycin
24孔板
步骤
1.细胞在6cmdish中培养至80~90%融合时,弃去培养液,用3mLD-Hank’ssolution洗涤细胞两次;
2.加1mLTrypsin-EDTASolution,混匀后,小心吸去胰酶溶液,37ºC放置1~3分钟;
3.在加入2mL完全培养基,吹打使细胞形成单细胞悬液;
4.血球计数板计数,将细胞稀释至3×105cells/mL;
5.按1.5×105细胞/孔的浓度接种24孔板,混匀后于37ºC,5%
CO2培养24小时;
6.完全培养基稀释Puromycin至4μg/mL,两倍倍比稀释,最小浓度为0.25μg/mL,换入24孔板中,同时设置Blank孔,一周后观察结果。
7.用观察到的细胞全部死亡孔中的最小浓度作为稳筛株的筛选浓度。
六、细胞有限稀释和单克隆筛选鉴定
实验材料及试剂
DMEM培养基+10%FBS
D-Hank’sSolutionTrypsin-EDTASolution
96孔板
24孔板
步骤
1.在96孔细胞培养板中分别加入90μL的完全培养基;
2.将待稀释细胞消化成细胞悬液,计数,用完全培养基稀释至104/mL;
3.取10μL细胞悬液到96孔板的第一排孔,混匀后,从中取10μL稀释的细胞悬液至第二排孔,此排孔内细胞浓度为101/100μL;
4.重复上述步骤,第三排孔内细胞数为1/孔,置37℃,5%CO2培养箱,4天后取出观察,并在板盖上打上标记;
5.继续培养时,在第4~5天更换1/2培养基,选择单克隆生长孔,生长良好,转移到24孔板再扩大培养。
6.
单克隆筛选PCR检测结果
注:
WT-WildTpye;MT-MutationType
7.单克隆测序结果
hsa-mir-152基因敲除3号单克隆细胞株测序序列与野生型序列比对结果
8.qRT-PCR检测结果
野生型Hela细胞及hsa-mir-152基因敲除3号单克隆细胞株hsa-mir-152基因及U6(内参)的相对表达了柱状图
以上案例仅供参考,根据客户实验目的与平台条件,请进一步优化调整。
5
基因编辑质粒载体和甘油菌为常温运输,甘油菌-70℃以下保存12个月,质粒在-15℃以下保存1个月,-70℃以下保存6个月。
应尽量避免反复冻融(小于3次)。
病毒及体外转录RNA(溶解在无RNase水中)采用全程干冰运输,病毒及体外转录RNA在-70℃以下保存6个月以上。
应尽量避免反复冻融(小于3次)。
化学合成guideRNA(干粉)常温运输,-70℃以下保存6个月。
Cas9蛋白及Cpf1蛋白,采用全程冰盒/干冰运输,-15℃以下保存12个月。
应尽量避免反复冻融(小于3次)。
■Q:
T7E1突变检测时,出现条带弥散的现象,应该如何解决?
A:
由于T7E1本身具有弱的非特异切割DNA链的能力,所以遇到这种情况,可以增加DNA用量,降低酶的用量,减少酶切时间来降低非特异切割现象。
7.1
质粒载体图谱
7.2
CRISPR基因编辑慢病毒(LV)载体
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