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开题报告
淮阴工学院
毕业设计(论文)开题报告
学生姓名:
糜长云
学号:
1081608113
专业:
食品科学与工程
设计(论文)题目:
紫薯片脱水工艺的研究
指导教师:
李松林
2012
年
2
月
29
日
毕业设计(论文)开题报告
1.结合毕业设计(论文)课题情况,根据所查阅的文献资料,每人撰写
2000字左右的文献综述
文献综述
1 引言
1.1紫薯的特性
血管紧张素转换酶又称肽酰二肽酶,是一种含锌的蛋白酶。
它可将多肽血管紧张素的羧基端水解下二肽,而变成具有强烈缩血管作用的血管紧张素,使血压升高。
该酶多分布于肺、肾、小肠、胎盘、脑等组织的血管内皮细胞或上皮细胞膜上,尤以肺组织中含量最高,而血液中的血管紧张素的浓度主要受肺组织的调节[1]。
另外,还能将具有降压作用的舒缓激肽的羧基端水解下二肽,使之失去降压作用。
近些年来,人们通过对性质的了解,不断地寻找和研制出一系列新的抑制药,如巯甲丙脯酸、苯酯丙脯酸、赖诺普利等。
这些药物经临床应用都有较好的降压效果。
但这些合成药物长期应用,都会表现出一定的毒副反应,如干咳、性欲减退等。
目前,值得注意的是国内外已有人从动植物中提取抑制剂,为研究天然降压药物提供条件[2]。
1.2ACE酶的加工利用现状
近几年来,利用酶技术从各种食品蛋白质中分离的降血压肽相继出现,已成为新型高血压药物开发的热点和焦点[3]。
大量研究表明,从天然蛋白质中可获得的各种功能活性肽,如免疫调节肽、激素肽、酶抑制肽等,其中具有降血压活性的血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽研究最为详细[4]。
目前已从牛奶蛋白、鱼类蛋白、大豆蛋白等食物资源中分离出具有ACE抑制活性的多肽-即ACE抑制肽,目前微生物发酵或蛋白酶水解是生产ACE抑制肽的最常用方法。
来源于食物蛋白的ACE抑制肽无毒、无副作用,显示出良好的应用前景。
天然的ACE抑制肽最早是Ferriera在1965年从美洲茅头蝮蛇毒中发现的[6]。
随后众多关于ACE抑制肽的研究迅速的开展起来,并从多种不同的天然食物蛋白中发现了短链的ACE抑制肽。
日本是研究ACE抑制肽最多的国家,主要从乳源蛋白质中提取,其次是鱼蛋白,其中已有一部分实现工业化生产[8]。
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1.3ACE酶利用的发展趋势
高血压是对人类健康危害极大的一种疾病,是威胁成年人健康的一个主要因素,当成人血压超过2113P1217Kpa便认为患有高血压症。
高血压会引起患者心、脑、肾等器官损坏,危及生命。
因此,抗高血压药物的研究越来越引起国内外学者的重视。
全世界每年因高血压而死亡1200万人。
在我国,高血压的发病率随着经济的增长也逐年增高。
目前,全国高血压患者近1亿人,每年死于心血管病的人数达200万,已高居死亡原因的首位,高血压为其主要的危险因素[10]。
调查显示,高血压患者中,大多数使用合成ACE抑制剂控制血压的升高,合成ACE抑制剂具有药效快而强的特点,但对肾功能有一定的副作用[12]。
从天然食物中分离的ACE抑制肽,虽然降压效果没有合成药物明显,但其对正常血压无影响、没有毒副作用等特点吸引了众多的研究者。
1.4ACE酶提取存在的问题与不足
目前用于降血压的药物,原理上主要是抑制ACE的活性。
面对高血压人不断增长,越来越多的工作者致力于血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)的开发研究,而在此过程中实现抑制剂降压效果体外检测的重要途径就是测试其对ACE活性的抑制作用。
因此,对ACE的需求量也越来越大,而从国外定购ACE价格十分昂贵。
我国在这方面的研究尚属起步阶段,目前仅有少量报道[13]。
我国具有丰富廉价的动植物蛋白资源,如何合理利用好现有的资源加工制备高活ACE抑制肽是今后研究方向之一。
在制备技术,生产成本和生理效果等方面也应做出更大的突破,这些研究的进展将促进具有良好的市场前景和社会效益的ACE抑制肽的开发应用[15]。
而且现有的研究成果少,专利少,转化的经济效益和社会效益不明显。
1.5本课题研究的内容与意义
1.5.1研究内容
本课题以猪肺为实验材料,实验确定猪肺中血管紧张素转换酶ACE的提取工艺,并通过测定其活力的大小来确定制备ACE的最佳方案。
先通过单因素实验,比较不同匀浆时间,缓冲液批pH值,离心速度,离心时间四个加工工艺参数对ACE酶活力的影响,
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然后采用正交试验方法进行实验,利用从试验的全部水平组合中,挑选部分有代表性的水平组合进行试验,通过对这部分试验结果的分析了解全面试验的情况,找出最优的水平组合,即制备ACE酶最佳的参数组合。
1.5.2研究意义
猪肺是一种廉价的资源,然而从猪肺中提取ACE酶有较大的经济价值,对猪肺中ACE酶的提取也是在为制取降压肽的过程提供新途径,达到猪肺廉价材料的最佳利用,使变废为宝。
目前,用猪肺来制备ACE酶还尚未形成规模,处于起步阶段,提取制备方法、加工工艺还不成熟,因此加大对猪肺的提取工艺研究,完善制备工艺,降低生产成本,加快降压肽系列产品的开发和生产,以成为研究者关注的焦点。
同时,本课题在总结前人工作的基础上,希望找出一种更有效的制备ACE的方法,为血管紧张素转换酶抑制肽的提取纯化及特性研究提供重要的物质基础,以满足降血压药物—ACE抑制剂的开发研究工作的需要。
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参考文献
1孙凤祥,任维栋,李桂芝,等.猪肺血管紧张素转换酶的提纯[J].医学研究生学报,2001,14(5):
428~431
2吴为一,吴琼英,马乐海,等.猪肺血管紧张素转化酶的提取纯化及其性质研究.食品科学,2004,25(9):
71~73
3曲梅花,孙凤祥,任维栋,等.猪肺血管紧张素转换酶的制备[J].中国生化药物杂志,2002,23(3):
122~123
4任维栋,李耀辉,耿秀芳,等.猪骨胶原蛋白酶解物中血管紧张素转换酶抑制剂的提纯[J].生物化学杂志,1996,12(6):
693~697
5王赋敏,化冰,芦妙如,等.马尿酰甘氨酰甘氨酸合成及血管紧张素Ⅰ转换酶测定[J].中华医学检验杂志,1983,6(3):
145~151
6刘宏,陈兰英.亲和色谱法分离纯化猪肺血管紧张素转换酶[J].生物化学与生物物理进展,2000,27(5):
544~547
7孙凤祥,曲梅花,高佩林,等.猪肺血管紧张素转换酶的制备[J].中国生化药物杂志,2002,23(3):
122~123
8刘宏,陈兰英.血管紧张素转换酶纯化与性质研究[J].中国生物化学与分子生物学报,2000,16(6):
788~792
9刘宏,陈兰英.亲和层析法分离纯化猪肺血管紧张素转换酶[J].生物化学与生物物理进展,2000,27(5):
544~54
10赵永芳.生物化学技术原理及应用(第二版)[M].武汉:
武汉大学出版社,2001:
287~326
11沈同,王镜岩.生物化学(第二版)[M].北京:
高等教育出版社,1990:
241~265
12 陈兰英,田敏,杜建生.血管紧张素转换酶胍变性时的构象和活力变化生物化学和生物物理学报,1989,21:
421~430
13黄伟坤.食品检验与分析.北京:
轻工业出版社,1989:
49~54
14赵新淮,冯志彪.大豆蛋白水解物水解度测定研究,东北农业大学
学报.1995,26
(2):
178~181
15陆文清,李德发,任继平,等.福林显色法测定饲料用蛋白酶活力的
要点分析U.饲料研究,2003,9:
28~29
16曾晓波.食品中生物活性肽:
生物恬性剂研究进展[J].食品工业科技,2004(25):
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17LowryOH,RosebroughNJ,FarrAL,etal.ProteinmeasurementwiththeFolinphenolreagent[J].JBiolChem,1951,193(5):
265-275
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2.本课题要研究或解决的问题和拟采用的研究手段(途径)
1 研究或解决的问题
本课题以猪肺为实验材料,实验确定猪肺中血管紧张素转换酶的提取纯化工艺,希望寻找出一种更有效的制备ACE酶的方法。
同时分析不同来源的ACE的质量;研究ACE酶的提取纯化工艺;研究ACE酶的制备过程中不同匀浆时间、缓冲液pH值、离心速度、离心时间对ACE酶的活力的影响;然后,通过试验,得到ACE酶的最佳制备方案。
最后分析ACE酶的活力质量。
2材料和方法
2.1原料与设备
2.1.1原料
新鲜猪肺(购于淮安城南市场)、硼酸缓冲液、硼酸、硼酸钠、马尿酰组氨酰亮氨酸(HHL)、NaCl溶液、乙酸乙酯、NaOH溶液
2.1.2设备
可见分光光度计、高速冷冻离心机、离心管、冰箱、捣碎机、容量瓶、玻璃棒
2.2试验方法
2.2.1工艺流程
制备猪肺粗提物→ ACE酶活力测定→ACE酶的保藏
2.2.2操作方法
1制备猪肺粗提物(肺匀浆上清制备)
新鲜猪肺购回后置冰箱冷藏室约10h,使组织充分冷却,同时将配好的足量不同pH8.3、8.8、9.3、0.1mol/L硼酸缓冲液冷却至4℃。
然后,将猪肺清洗,去除大的血管、脂肪,切为小块,得猪肺组织。
放入组织捣碎机,加入预冷的缓冲液1000mL,间歇均浆2min、4min、6min,将浆液置冰箱冷藏5h以使浸提物充分溶解。
分别在4℃,10000r/min、9000r/min、8000r/min、7000r/min离心20min、15min、10min,得上清液,测ACE活力。
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酶活力单位定义为:
在此条件下1U=1nmol马尿酸/(mL·min),或1nmol马尿酸/mg蛋白质
2.2.3试验设计方法
2.2.3.2单因素试验设计方法
(1)匀浆时间对ACE酶活力的影响
固定缓冲液pH值8.3、离心速度10000r/min、离心时间15min,匀浆时间水平见表1设计,做匀浆时间的单因素实验,考察匀浆时间对ACE酶活力的影响。
表1匀浆时间对ACE酶活力的影响(min)
因素
水平
匀浆时间
2
4
6
8
10
(2)缓冲液pH值对ACE酶比活力的影响
固定匀浆时间2min、离心速度10000r/min、离心时间10min,缓冲液PH值水平见表2
设计,做缓冲液pH值的单因素实验,考察缓冲液pH值对ACE酶活力的影响。
表2缓冲液pH值对ACE酶活力的影响
因素
水平
缓冲液pH值
8.3
8.5
8.8
9.0
9.3
(3)离心速度对ACE酶比活力的影响
固定缓冲液pH值8.5、匀浆时间4min、离心时间20min,离心速度水平见表3设计,做离心速度的单因素实验,考察离心速度对ACE酶比活力的影响。
表3离心速度对ACE酶比活力的影响(r/min)
因素
水平
离心速度
10000
9000
8000
7000
(4)离心时间对ACE酶活力的影响
固定缓冲液pH值9.0、匀浆时间6min、离心速度10000r/min,离心时间水平见表4设计,做离心时间的单因素实验,考察离心时间对ACE酶活力的影响。
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表4离心时间对ACE酶活力的影响(min)
因素
水平
离心时间
25
20
15
10
5
2.2.3.2正交试验设计方法
由单因素实验看出离心时间对酶活力的影响不显著,所以为了进一步确定最佳工艺参数,对缓冲液pH值、匀浆时间、离心速度,3个因素做正交试验设计,利用正交表来安排与分析多因素试验。
试验采用四因素三水平L9(34)的试验设计方法,分别以缓冲液pH值、匀浆时间、离心速度为研究因素,因素水平设计见表5,以ACE酶的活力作为考察指标实施正交实验,确定最佳加工工艺参数组合。
表5正交试验因素水平设计表
水平
因素
A缓冲液pH值
B离心速度
(r/min)
C匀浆时间(min)
1
9.3
10000
6
2
8.8
9000
4
3
8.3
8000
2
2.2.4检测方法
在ACE酶提取的单因素试验和正交试验中,以ACE酶活力为试验指标,根据酶活力的大小分别确定匀浆时间,缓冲液pH值,离心速度和离心时间。
实验在2mL的试管中进行。
往试管中加入0.1mLHHL溶液,再加入0.15mL粗酶提取液,用旋涡混合器混合,37℃保温60min,再加入0.25mL的HCl溶液终止反应,放置5min。
加入乙酸乙酯1.2mL,在旋涡混合器上混合,在10000r/min条件下离心5min,静置后用移液器吸取0.5mL乙酸乙酯层于10mL试管中,在120℃烘箱中烘干,用移液器吸取3.0mL,0.1mol/LNaCl将之溶解,在旋涡混合器上混合,放置15min,在波长228nm处测定该溶液的吸收值A1。
空白管中在反应之前加入0.25mLHCl溶液,其余操作相同A0。
计算公式:
ACE(U)=(A1-A0)*3.0/[10.6*10-3*0.88*0.15*(0.5/1.2)*60]公式中:
A1:
ACE粗酶溶液反应后在228nm波长下的吸光度
A0:
实验空白对照反应后在228nm波长下的吸光度
3.0:
比色溶液的体积mL
指导教师意见:
1.对“文献综述”的评语:
该论述观点明确,写作较为规范,内容全面,反映出该生收集,调研,综述各种信息的能力和较为扎实的语言文字功底。
2.对本课题的深度、广度及工作量的意见和对设计(论文)结果的预测:
本课题研究思路明确,符合本专业的培养方向,工作量适度,内容具有一定的深度和广度;本课题以猪肺为实验材料,实验匀浆时间、缓冲液pH值、离心速度、离心时间等因素对提取液中ACE酶比活力的影响,确定猪肺中血管紧张素转换酶的提取纯化工艺,为血管紧张素转换酶抑制肽的提取纯化及特性研究提供重要的物质基础。
年
月
日
指导教师:
所在专业审查意见:
负责人:
年
月
日
毕业设计(论文)开题报告
毕业设计(论文)开题报告
10.6*10-3:
马尿酸透过系数
0.88:
乙酸乙酯对于马尿酸的提取率
0.15*(0.5/1.2):
供试样品量mL
60:
反应时间min
2.2.5达到预测结果
1、以猪肺为原料,以硼酸缓冲液为主要浸提溶液,原料来源丰富,价格便宜,提取工艺及设备都较为简单,过程容易控制,提取出的ACE酶是一种在分子组成、酶学性质及蛋白特性等方面与人类肺组织,内皮组织ACE极为相似的酶,从某种意义上说,猪肺ACE与人肺及内皮ACE同源性很高,因而在体外研究中可以利用提纯的猪肺ACE为研究对象,得到的研究结果在一定范围内可以推广到其它来源的ACE上,还可为血管紧张素转换酶抑制肽的提取纯化及特性研究提供重要的物质基础,以满足降血压药物—ACE抑制剂的开发研究工作的需要,故具有良好的应用和开发前景。
2、不同匀浆时间、缓冲液pH值、匀浆时间、离心时间的对ACE酶比活力有较大的影响,其中预测考察因素对试验指标ACE酶活力的影响由强到弱的顺序为缓冲液pH值>离心速度>匀浆时间>离心时间。
3、通过实验确定最佳工艺参数。
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