水稻类病斑突变体lmm4的鉴定及其基因定位.docx
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水稻类病斑突变体lmm4的鉴定及其基因定位
水稻类病斑突变体lmm4的鉴定及其基因定位
邱结华1 马宁1,2 蒋汉伟1,2 圣忠华1 邵高能1 唐绍清1 魏祥进1,∗ 胡培松1,∗
(1中国水稻研究所/农业部水稻生物学与遗传育种重点实验室/水稻生物学国家重点实验室,杭州310006;2杭州师范大学生命与环
境科学学院,杭州310036;∗通讯联系人,EGmail:
weixiangjin@caas.cn;hupeisong@caas.cn)
IdentificationandGeneMappingofaLesionMimicMutantlmm4inRice
QIUJieGhua1,MANing1,2,JIANGHanGwei1,2,SHENGZhongGhua1,SHAOGaoGneng1,TANGShaoGqing1,
WEIXiangGjin1,∗,HUPeiGsong1,∗
(1StateKeyLaboratoryofRiceBiology,KeyLaboratoryofRiceBiologyandBreedingofMinistryofAgriculture,ChinaNational
RiceResearchInstitute,Hangzhou310006,China;2CollegeofLifeandEnvironmentalSciences,HangzhouNormalUniversity,
Hangzhou310036,China;∗Correspondingauthor,EGmail:
weixiangjin@caas.cn;hupeisong@caas.cn)
QIUJiehua,MANing,JIANGHanwei,etal.Identificationandgenemappingofalesionmimicmutantlmm4inrice.
ChinJRiceSci,2014,28(4):
367G376.
Abstract:
Thelesionmimicmutantlmm4wasidentifiedfromanEMSGinducedNipponbaremutantlibrary.Brown
lesionswerefirstobservedonthetipoflmm4leavesattheinitialtilleringstage,andspreadedgraduallydownwardto
thewholeleafbladeandeventheleafsheath.Comparedwiththewildtype,thechlorophyllandthenetphotosynthetic
rateoflmm4weresignificantlyreduced.Theplantheight,paniclelength,seedsettingrate,grainweightwerealso
decreasedsignificantly.Theshadingassayshowedthatthelesionsonlmm4leaveswereinducedbynaturallight.The
histologicalstainingassayindicatedthatthelesionsonlmm4leaveswerecausedbyprogrammedcelldeathand
hydrogenperoxideaccumulatedinlmm4leaves.Thelmm4displayedhigherresistancetoblastraceC7andG1when
comparedwiththewildtype.Inaddition,pathogenesisGrelatedgenePOC1,PAL,PBZ1,PR1werefoundtobeupG
regulatedinlmm4.Geneticanalysissuggestedthatthephenotypeoflmm4wascontrolledbyasinglerecessivenuclear
locus.BasedamapGbasedcloningstrategy,thelmm4wasnarroweddowntoa235kbregionbetweenIndG4andIndG6
nearthecentromereofchromosome5.
Keywords:
lesionmimicmutant;blastresistance;genemapping;rice
邱结华,马宁,蒋汉伟,等.水稻类病斑突变体lmm4的鉴定及其基因定位.中国水稻科学,2014,28(4):
367G376.
摘 要:
在EMS诱变的日本晴突变体库中,筛选到一个类病斑突变体.该突变体类病斑出现于分蘖始期,而后慢慢扩散至
叶鞘、茎秆,最后至整个植株,属于扩散型类病斑突变体.相比野生型,突变体的lmm4的株高明显降低,有效穗数减少,穗长
缩短,结实率、每穗实粒数、千粒重均显著降低.遮光处理实验表明,突变体lmm4类病斑的产生受自然光诱导.突变体
lmm4的光合色素含量和净光合速率明显低于野生型.电子显微镜观察发现突变体类病斑部位叶肉细胞中的叶绿体结构发
育异常.台盼蓝染色实验表明突变体类病斑部有大量的死亡细胞.二氨基联苯胺染色实验表明类病斑部位有过氧化氢沉
积.稻瘟病抗性鉴定结果表明,与野生型相比,突变体lmm4对C7和G1等稻瘟病菌生理小种的抗性明显增强.实时PCR
分析证明在突变体lmm4中防卫反应相关基因POC1、PAL、PBZ1、PR1的表达量显著提高.遗传分析表明突变体表型符
合单隐性核基因控制的遗传规律.lmm4定位在第5染色体着丝粒附近IndG4和IndG6之间大约235kb的区域内.
关键词:
类病斑突变体;稻瘟病抗性;基因定位;水稻
中图分类号:
Q343.5;Q754;S435.111.3+9 文献标识码:
A 文章编号:
1001G7216(2014)04G0367G10
植物类病变(lesionmimicmutant)突变体是指
在无明显逆境或病原物侵染时,植物叶片或叶鞘上
自发形成大小、形状和颜色各异的斑点的一类突变
体[1].又因为多数类病变突变体形成的斑点与无毒
病原物浸染时产生的病斑类似,并且大多数斑点的
颜色为褐色,也常被称之为类病斑(lesionsimulaG
tingdisease)突变体.类病斑突变体的表型多与病
原菌侵染后的超敏反应(hypersensitiveresponse,
HR)症状类似[2],而且许多类病变突变体对某些植
物病原物表现出了一定的抗性[3G5].因此,对这类突
收稿日期:
2014G01G16;修改稿收到日期:
2014G03G01.
基金项目:
国家自然科学基金资助项目(31201193,31201195);国家863计划资助项目(2011AA10A101,2012AA101101).
763
中国水稻科学(ChinJRiceSci),2014,28(4):
367-376
http:
//www.ricesci.cn
DOI:
10.3969/j.issn.1001G7216.2014.04.005
变体的研究可以为水稻抗病防御体系和细胞程序性
死亡机制的研究提供借鉴,同时可以为水稻抗性育
种提供有用的种质资源.
水稻类病斑突变体的研究已有大量报道,到目
前为止,已经发现了50多个类病斑突变体[3].其
中,绝大部分呈单隐性核基因遗传规律,少部分表现
为双隐性核基因或显性核基因遗传规律[6],但被克
隆的类病斑基因却为数不多.在水稻中第一个被克
隆的类病斑基因是SPL7[7],该基因编码一个热激
转录因子,spl7突变体在该基因非常保守的DNA
结合域发生突变,从而导致其斑点叶表型的发生.
随后不同研究者利用图位克隆、同源基因克隆、TG
DNA序列标签等方法克隆与分离了Spl1、Spl18、
Spl28、OsLSD、OsPti1a、OsNPR1、OsSSI2、OsG
ACDR1、RLIN1、RLS1等多个水稻类病斑性状相
关基因[8G17].这些已经克隆基因的突变体表现出不
同类型、不同程度的类病斑表型,部分突变体还表现
出比其野生型更好的稻瘟病、白叶枯病抗性.如水
稻类病斑突变体lsd1对毒性稻瘟病菌小种的抗性
明显增强[9];而水稻突变体npr1和acdr1对白叶枯
病的抗性提高[10,11].水稻类病斑突变体spl11[8]、
spl18[12]、ttm1[13]、spl28[5]和ssi2[14]同时对稻瘟病
和白叶枯病产生抗性.同时,类病斑基因大多直接
调控或间接影响水稻的防卫反应与细胞程序性死亡
过程[8].类病斑基因的克隆与功能研究表明类病变
过程非常复杂,涉及到许多生化代谢过程.因此,挖
掘更多的类病斑突变体,克隆更多的相关基因,并开
展详细的功能研究,有助于全面了解类病变发生机
制,同时为研究水稻细胞程序性死亡和抗病机制提
供借鉴.
本研究以粳稻品种日本晴EMS诱变产生的一
个稳定遗传的类病斑突变体lmm4为材料,详细描
述了该突变体的形态学特征、生理学特性,并对该突
变基因进行了精细定位,以期为该基因的克隆、功能
研究及应用提供理论依据.
1 材料与方法
1.1 实验材料
从日本晴EMS诱变突变体库中筛选到一个类
病斑突变体lmm4,经多代自交后类病斑性状在海
南和杭州都能稳定遗传.以lmm4与籼稻品种南京
11和培矮64杂交衍生的F1及F2群体对lmm4进
行遗传分析,利用lmm4与南京11、培矮64衍生的
F2群体对突变体基因进行分子定位.所有材料均于
正季种植于中国水稻研究所富阳试验基地,田间管
理同大田生产.
1.2 遮光处理
在大田自然条件下,用宽度约2cm的锡箔纸对
突变体lmm4分蘖时期的叶片进行包裹遮光,分别
对未发和已发生类病斑的叶片遮光一周;然后对遮
光处揭掉锡箔纸恢复光照,跟踪观察类病斑变化.
1.3 叶绿素含量的测定
分别取大田自然条件下突变体lmm4及其野生
型分蘖期、抽穗期和成熟期的叶片进行叶绿素含量
测定.将0.2g待测样品剪成2~3mm的小片浸泡
于10mL95%乙醇,黑暗条件下放置于4℃的冰箱
中,浸提48h左右.利用分光光度计测量乙醇溶液
的吸光值,每组取3份样品,每份样品重复测量3
次.按Lichtenthaler等[15]修正的Arnon法计算叶
片叶绿素含量.
1.4 光合作用相关指标的测定
使用LiG6400型便携式光合测定仪,于始穗期
晴天上午9:
00-11:
00分别测定突变体lmm4及其
野生型叶片的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸
腾速率(Tr)和胞间CO2浓度(Ci).突变体和野生
型各测定3片具代表性的剑叶,光合测定仪使用红
蓝光源,光量子密度1200μmol/(m2s),流速500
μmol/s.
1.5 叶绿体结构电镜观察
分别取分蘖期野生型正常叶片与突变体lmm4
发生类病斑叶片,置于2.5%戊二醛固定液中,抽真
空使固定液完全渗入叶片中,电镜样品制备参照吕
典华等[16]的方法,样品制备好后利用HITACHI
7650型透射电子显微镜对叶肉细胞中叶绿体的显
微结构进行观察.
1.6 叶片死亡细胞检测
参照Yin等[17]的方法分别取分蘖期有类病斑
表型的突变叶片以及相应位置的野生型正常叶片用
台盼蓝染色,使用体视镜(LeicaDM1000)观察突变
体和野生型叶片中染色情况并拍照.
1.7 叶片H2O2沉积检测
参照ThordalGChristensen等[18]的方法检测突
变体叶片中是否有H2O2的积累.
863中国水稻科学(ChinJRiceSci) 第28卷第4期(2014年7月)
1.8 突变体抗性鉴定
为了了解类病斑突变体lmm4对稻瘟病的抗
性,将lmm4和野生型品种浸种、催芽后,按顺序分
别播种在50×25×5的有孔、装有细土的塑料盘中,
每盆播31个,每1个供试品种播10粒~15粒,设1
个重复,接种前3d施氮肥,保持嫩绿;在秧苗3~4
叶期接种;选择A49、A57等致病性较强和致病频率
较高20个菌株对lmm4及其野生型秧苗喷雾接种,
病菌浓度约为2×105个孢子/mL.接种量以所有
叶片上布满孢子液为限,覆盖黑色湿布保湿24h,
然后取出,定时喷雾保湿.7d后当感病对照品种
丽江新团黑谷病级达7级以上时进行调查.
1.9 基因定位
从突变体lmm4与南京11衍生F2群体中首先
挑选出22株表型为类病斑的分离单株用于lmm4
的连锁分析.利用本实验室均匀分布于12条染色
体的512对公共引物对亲本进行筛多态分析,所用
引物来自Matsumoto等采用的公共序列[19].初步
确定目标基因所在的染色体位置.然后在与目标基
因连锁标记附近进一步开发了10对存在多态的
SSR标记或Indel标记(表1),以1182株表现出类
病斑表型的分离单株对突变体基因lmm4进行进一
步定位.为了更精细定位lmm4突变体基因,同时
利用突变体与培矮64衍生的F2群体中表现突变体
性状的3936个分离个体对突变体基因进一步精细
定位.亲本和定位群体F2的植株基因组的DNA采
用SDS法[21]提取,10μL的PCR体系包括DNA1
μL,10×PCR缓冲液1μL,正反向引物(10μmol/
L)各0.5μL,dNTPs(10μmol/L)0.1μL,Taq酶0.
1μL,加ddH2O补足10μL.PCR程序如下:
94℃
下预变性3min;95℃下30s,55℃下30s,72℃下
40s,35个循环;最后在72℃下延伸3min.PCR产
物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳,电泳
结束后银染显色并读胶.
1.10 防卫反应相关标记基因的表达分析
采用Trizol法提取突变体和野生型植株分蘖
期叶片总RNA.以经过DNaseⅠ处理过的总RNA
为模板,采用ReverTraAceFskG100kit(TOYOBO)
反转录合成cDNA第1链.然后利用实时荧光定
量PCR方法分析各基因在突变体和野生型中的表
达量.内参基因为Actin(GenBank登录号为
X16280).实时荧光定量PCR反应体系(20μL)包
含cDNA模板1μL,2×SYBRqPCRMix(TOYOG
BO)10μL,前后引物(10μmol/L)各1μL,ddH2O
7μL.每个样品3个重复.PCR扩增程序如下:
95℃下30s;95℃下5s,60℃下30s,72℃下15s,
40个循环.以2-△△CT计算各基因相对表达量.用
于检测防卫反应相关标记基因的表达引物见表2.
2 结果与分析
2.1 突变体lmm4的表型
在大田自然条件下,突变体lmm4苗期叶片与
表1 定位突变体基因lmm4所用的引物序列
Table1.Primersequenceusedforlmm4mapping.
标记
Marker
前引物
Forwardprimer
后引物
Reverseprimer
Q1TTCCATGGCACACAAGCCCTGTGCACGAACTTCCAAAG
Q2TGGCGCAATATCTCTCTCATTCCTGCCACTTGTGTGTTGTTCTGC
Q3CGAGGGGATTCGATCGACATCCCTTCACACTGCTCCAC
Q4GGCGTAAAGGTTTTGCATGTATGATGCCATGAAGGTCAGC
Q5CGTAAACACGAGCACACAAAGGACACACAACAGCTGCTCACTGG
IndG2ATGTCCTAATTTTCACCCAGATTTCCATAGCAGACTTATTTCAG
IndG3GCCTAGTGGTGGAAGCATTTAAACCGGCAGGTCTGA
IndG4TGGTTACAATAGTGCCTCACACATAATTGCTAGTAGTTAGAG
IndG6AGTTTCTGGGTTAGGGATGTTATGAGGGTGCTGTTGG
IndG12AAAGTCAAACGTGGACAAGCACTGGCAATTCGCTCA
IndG13CCAAAAGTCAACCTGGAACACAAATTAAATTAGGCATG
IndG14AAATCCGAAGCGCCACTATTGATGCGGCACATCCTA
Q1~Q5是SSR标记;Ind2~Ind14是插入缺失标记.
Q1toQ5areSSRmarkers;Ind2toInd14areinsertGdeletemarkers.
963邱结华等:
一个水稻类病斑突变体lmm4的鉴定及其基因定位
A-野生型(左)和突变体lmm4(右)分蘖期的植株表型;B-野生型(左)和突变体lmm4(右)的分蘖期叶片;C-野生型(左)和突变体lmm4
(右)成熟期的植株表型;D-野生型(左)和突变体lmm4(右)的成熟期叶片.
A,Phenotypeofwildtype(left)andthelmm4(right)duringthetilleringstage;B,Leafphenotypeofwildtype(left)andthelmm4(right)
duringthetilleringstage;C,Phenotypeofwildtype(left)andthelmm4(right)duringthematuritystage;D,Leafphenotypeofwildtype
(left)andthelmm4(right)duringthematuritystage.
图1 类病斑突变体lmm4的表型
Fig.1.Phenotypesoflmm4mutant.
其野生型一致,并没有类病斑,但是在分蘖期后期
lmm4植株上部叶片从叶尖开始出现红褐色类病斑
(图1GA~B).随着水稻的生长,类病斑的数量逐渐
增加并向整片叶片扩张,同时单个类病斑的面积也
会不断变大(图1GC~D),因此,突变体lmm4属于
扩散型类病斑突变体.另外,相比野生型突变体,
lmm4植株较为矮小,株高明显降低,结实率显著降
低,每穗实粒数、千粒重均减少.相对于野生型,
表2 防卫反应标记基因表达分析引物
Table2.TheprimersforRTGPCRofpathogenesisGrelatedmarkergenes.
基因
Gene
前引物
Forwardprimer
后引物
Reverseprimer
登录号
AccessionNo.
PR1GTAAACAGGTCCACGGTCCATACCCCAGTGACAACTGACAAGGCAAAU89895
PBZ1CGGGCACCATCTACACCAGCCATAGTAGCCATCCACD38170
PALGGCATCCAGGGCGGCTTCTTCGGTCTTGCTTCGGCTTCATCAGX87946
POC1TTCAACAACGGCAGCACGGACAATGGAACAAGAAACAGAGCAAGGCAAATCAF247700
POX22.3AGTGCCAGAACTTCAGGGACAGGATCTACAACAACGAACGCATCCCGTCATACTACTCCAF014467
ActinCATGCTATCCCTCGTCTCGACCTCGCACTTCATGATGGAGTTGTATX16280
表3 突变体和野生型的主要农艺性状
Table3.Theagronomictraitsoflmm4andwildtype(WT).
材料
Material
株高
Plantheight/cm
结实率
Seedsettingrate/%
千粒重
1000Ggrainweight/g
每穗实粒数
No.offilledgrainsperpanicle
野生型WT85.7±2.166.7±0.924.15±0.1969.5±1.1
突变体lmm472.1±2.3∗∗45.5±1.7∗22.80±0.63∗∗56.6±1.3∗
∗,∗∗分别表示野生型与突变体在0.05和0.01水平下差异显著.
∗,∗∗significantdifferencebetweenwildtypeandthemutantat0.05and0.01levels,respectively;Mean±SD(n=25).
073中国水稻科学(ChinJRiceSci) 第28卷第4期(2014年7月)
表4 突变体lmm4与野生型始穗期剑叶的光合特性
Table4.Photosyntheticcharactersoflmm4mutantandwildtype(WT)atheadingstage
材料
Material
净光合速率(Pn)
Netphotosyntheticrate
气孔导度(Gs)
Stomatalconductance
蒸腾速率(Tr)
Transpirationrate
胞间CO2浓度(Ci)
IntercellularCO2concentration
野生型WT24.63±1.080.29±0.048.29±0.40212.33±7.09
突变体lmm48.37±1.50∗∗0.15±0.01∗5.00±0.21∗280.33±14.57∗∗
∗,∗∗分别表示野生型与突变体在0.05和0.01水平下差异显著.
∗,∗∗significantdifferencebetweenwildtypeandthemutantat0.05and0.01levels,respectively.Mean±SD(n=30).
A,日本睛;B,遮光前lmm4;C,未发生斑点部位遮光7d后;D,遮
光部位恢复光照7d后;E,已发生斑点部位遮光7d后.
A,Nipponbare;B,Leafoflmm4beforeshading;C,Leafwithout
lesionaftershadingfor7days;D,Leafshadedfor7daysthenunder
normallightfor7days;E,Leafwithlesionaftershadingfor7days.
图2 遮光对突变体lmm4叶片的影响
Fig.2.EffectsofShadingonlmm4leaves.
lmm4表现一定的早衰现象(图1GA,表3).
2.2 突变体lmm4类病斑发生受光照诱导
对突变体lmm4只在叶尖出现少量类病斑的叶
片未产生类病斑部位用锡箔纸遮光一周后发现,整
张叶片其他部位都产生了明显的类病斑,但是遮光
处并没有类病斑产生(图2GA~C);恢复光照一周
后,原本没有类病斑的遮光处产生了明显的类病斑
(图2GD);同时,对已经产生的类病斑的叶片进行遮
光,一周后发现已产生的类病斑并不会消失,但是其
他部位类病斑扩散严重,遮光处没有扩散(图2GE).
该结果表明突变体lmm4的类病斑发生受自然光照
诱导,适当的遮光可以阻止或减轻类病斑的发生或
扩散.
2.3 光合色素含量及光合速率分析
对大田自然环境下分蘖期、抽穗期和成熟期三
个时期野生型和突变体lmm4叶片叶绿素、类胡萝
卜素含量进行测定,结果表明,在分蘖期(类病斑起
始期),突变体和野生型各色素指标差异不大,但在
抽穗期(类病斑已形成),lmm4的叶绿素、类胡萝卜
素含量明显低于野生型,到成熟期,突变体的各色素
含量都极显著低于野生型(图3).表明lmm4的突
变导致了水稻叶绿素、类胡
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- 水稻 类病斑 突变体 lmm4 鉴定 及其 基因 定位
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