兔颞下颌关节盘前移位后凋亡调控信号Bcl2及Bax在髁突软精.docx
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兔颞下颌关节盘前移位后凋亡调控信号Bcl2及Bax在髁突软精
520Joumalof0ralscienceResearch,0ct.2008,V01.24,No.5
兔颞下颌关节盘前移位后凋亡调控信号BcI一2
及Bax在髁突软骨细胞表达的研究
肖进h
刘登峰1徐兴侨1詹静2谷志远3
325027;
(1.温州医学院附属口腔医院口腔颌面外科浙江温州
2.浙江大学附属绍逸夫医院口腔科;3.浙江大学附属口腔医院)
[摘要】
目的:
研究颞下颌关节盘前移位后凋亡调控基因bcl一2及b腿在髁突软骨细胞表达的变化。
方法:
17只
日本大白兔随机分组,实验组行右侧颞下颌关节手术,人工造成颞下颌关节盘前移位,分别经1、2、4周后处死动
物,We9t唧blot检测侧髁突软骨bcl一2及ba】【表达。
结果:
实验组较对照组ba)【蛋白含量增加,且随着术后时间的
延长而增加。
bcl一2蛋白则相反,实验组较对照组动物关节软骨内表达减少,且随着术后时间的延长而进一步递减。
结论:
在颞下颌关节盘前移位后软骨凋亡过程中bcl一2/b缸可能起一定调控作用。
[关键词】颞下颌关节关节盘前移位细胞凋亡Bcl一2[中图分类号]
R782.6
B缸
[文献标识码]A[文章编号]1671—765l(2008)05—0520—03
Exp懈si蚰0fBd一2
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Tempomm粕dibuljoint
Ant谢or
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Bcl一2B胍
细胞凋亡是一个主动的、受多种基因调控、多种酶参与的复杂过程,涉及一系列信号传递系统的调节。
Bcl一2家族是凋亡信号调节中最重要的基因家族,此家族成员按功能不同可分为抗凋亡和促凋亡两大类。
Bcl一2和Ba】【是此家族中两个最重要成员,它们表达量的变化对细胞存亡有重要影响。
研究发现Bcl一2/B缸两种蛋白之间的比例是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素…,Bcl一2可与Ba】【形成同源或异源蛋白二聚体.而特定的蛋白二聚体可作为细胞死亡信号通路上的分子开关。
通过研究我们已经明确了颞下颌关节盘前移位后关节软骨细胞凋亡增加,且与Fas/F鹊L的相互作
作者简介肖进(1卯3一),男,安徽人.讲师,医学博士,主要从事口
腔颌面外科学临床和基础研究。
・通讯作者肖进,电话:
(0577)8806303I
用有密切关系。
但Bcl一2、Ba)【在颞下颌关节盘前移位后软骨细胞的表达及其变化等尚未见报道。
本实验对颞下颌关节盘前移位后关节软骨细胞表达Bcl一2、Ba)【进行研究,初步探讨颞下颌关节盘前移位后关节软骨细胞凋亡可能的调控因素。
l材料与方法
1.1动物分组及模型建立
日本大白兔17只,由
浙江大学动物实验中心提供,1年龄,雌雄不限,体重2.5—3.okg。
随机抽取其中2只作空白对照组,不作任何处理。
随机抽取模拟手术组大白兔6只,均分为3组,在其右侧颞下颌关节作模拟手术,但不移动关节盘,并于手术后1、2、4周分别处死各l组。
其余9只作为实验手术组,均分为3组,作右侧颞下颌关节盘前移位模型,并分别于术后l、2、4周处死。
动物模型建立如文献[2,3]。
j
1.2标本制备、蛋白提取动物按期空气针静脉栓
口腔医学研究2008年lO月第24卷第5期
塞法处死,完整取得右侧颞下颌关节软骨,双蒸水漂洗,立即置入Eppendorf管中,一80℃储存。
储存的软骨组织生理盐水冲洗一遍,加500mL蛋白质提取液并转移到匀浆器中,置冰水上研磨,4℃12000r/
min离心lOmin,转移上清到另一新离心管。
吸取
50斗L蛋白,加lO斗L6×蛋白加样缓冲液。
1.3
Wstemblotting
1.3.1抗体及其工作浓度兔抗Bcl一2、兔抗Ba】【(stressgen,加拿大),工作浓度分别为1:
1500及1:
1000。
山羊抗Actin购买于(Santacruz,美国),工作浓度为l:
2000。
二抗为鼠抗兔IgG,工作浓度为l:
2000;Actin的二抗为抗羊IgG,工作浓度为1:
2000。
1.3.2
WestemBlotting用5%的脱脂奶粉室温封
闭2h,加入一抗,一抗按照不同抗体稀释,室温结合
2
h。
用TBST洗膜室温洗膜3次,每次10min。
加
入二抗(1:
2000),室温结合1h。
用TBsT洗膜室温洗膜4次,每次10
lIlin。
ECL
solution显色,加底物
显色液,结合1min,将膜速封,放人X光片盒,在暗室中放人X光胶片1min,使胶片与膜接触曝光。
放入显影液中l万方数据
min,清水漂洗,放入定影液中,透明为止。
吹干,分析。
1.3.3图像分析及数据处理B—Actin作为内参照,Biosens6c300软件扫描,比较各组westem
blot—
ting各组结果相对光密度值。
实验数据结果采用石;t5进行表示,£检验比较两组之间差异,P<0.05为显著性水平。
2结果
2.1
Bcl一2蛋白Westemblotting结果Bcl一2分
子量约为26KD,在电泳膜上相对处可见相应条带。
比较可见在免疫印迹的PVDF膜上正常对照组、模拟手术组颞下颌关节软骨细胞中Bcl一2表达条带稍宽,手术后1周表达与正常对照组、模拟手术组相似;术后2周表达有下降,术后4周其表达进一步下降,见图l。
B—actin作为内参照,定量检测其表达。
正常对照组Bcl一2表达的相对A值为3236±149.5,模拟手术组为2920±394.6,颞下颌关节盘前移位手术后1周Bel一2表达为2877±126,手术后2周其表达相对A值为2185±184.9,手术后4周则为1506±185.4。
£检验对照组与模拟手术组之间差异无统计学意义;模拟手术组之间差异无统计学意义;对照组、模拟手术组与手术后l周组之间差异无统计学意义;对照组、模拟手术组与手术后2周与手术后4周之间差异有统计学意义;手术后l周与手术后2周、4周之间差异有统计学意义。
52l
l:
正常对照组;2:
模拟手术组;3、4:
颞下颌关节盘前移位后1周;6:
颞下颌关节盘前移位后2周;7、8:
颞下颁关节盘前移位后4周
图l
Bcl一2在颗下颌关节软骨细胞中的表达情况
№.1111e唧嘲Bion
0fBcl一2
in舢chondrocyteB
1:
正常对照组;2:
模拟手术组;3、4:
颞下颌关节盘前移位后l周;6:
颞下颌关节盘前移位后2周;7、8:
颞下颌关节盘前移位后4周
围2B“在颞下颌关节软骨细胞中表达情况
F毡.2
The懿岬si蛐of8旺in咖ch仰dIocyt船
2.2
Ba】【蛋白Westemblotting结果Ba】【分子量为
2lKD,在电泳膜上相对处可见相应条带。
比较可见在免疫印迹的PVDF膜上正常对照组、模拟手术组颞下颌关节软骨细胞中表达相对较少,颞下颌关节盘前移位手术后1周关节软骨细胞中Bax表达上调;术后2周表达明显增加,术后4周与术后2周相比表达进一步增加,见图2。
B—actin作为内参照,定量检测其表达。
Ba】【蛋白表达在正常对照组相对4值为2152±257.9,模拟手术组为2186±208.6,手术后l周其表达为2668±77.6,手术后2周为2826±67。
手术后4周则为3169±95。
8。
£检验对照组与模拟手术组之间差异无统计学意义;模拟手术组之间差异无统计学意义;对照组、模拟手术组与手术后l周、2周、4周各组之间差异有统计学意义;手术后1周与手术后4周、手术后2周与4周之间差异有统计学意义;手术后1周与2周组之间差异无统计学意义。
裹l各组Bcl一2与BⅡ之间比值
ThbIel
The
r丑tioof
Bcl一2/Baxi±s
2.3
Bcl一2/Bax比值各组Bcl一2与Bax之间比
值呈逐渐减小的趋势,见表l。
3讨论
本研究中我们观察到Bcl一2在颞下颌关节盘
前移位后软骨细胞中表达减弱,且随着时间延长减
522
弱更加明显;Bax在软骨细胞中表达则与此相反,手术组较对照组及模拟手术组表达增高,且随着时间延长增加更加明显。
颞下颌关节盘前移位后Bcl一2/B缸比例减小,提示Bcl一2及Bax参与了颞下颌关节盘前移位后软骨细胞凋亡的调控。
Bcl一2家族中抑制和促进细凋亡两类蛋白的比例决定了细胞在受到凋亡刺激信号时是否发生凋亡。
研究发现Bcl一2/Ba)【两种蛋白之间的比例是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素,在Bcl一2表达较少的情况下,Ba)【之间形成同源二聚体,促进凋亡发生,当Bcl一2表达过量时,Bcl一2和Bax分子形成异源二聚体,抑制凋亡发生¨’4o。
Bcl一2的表达受到复杂的调控。
bel一2基因在转录和蛋白质翻译等各个阶段都受到严格的调控。
Bcl一2基因有两个启动子,其中主要起作用的是第一个启动子(pmmoter1,p1)”J。
研究发现在
bcl一2启动子区存在一个受p53间接调控的位
点∞J,它的激活可以抑制bcl一2的Pl转录活性。
进一步的研究显示在一些不表达p53基因的细胞中,如果给予外源性p53会导致bcl一2mRNA及其蛋白质水平下降,说明p53对bcl一2的表达起负调万方数据
控作用。
此外,p53基因还可以与ba)【基因的顺式作用元件结合从而上调其表达"J。
C—Myb则可以正调控bcl一2的表达。
Bcl一2蛋白的翻译及翻译后修饰也是调节其表达,从而也是调控细胞调亡的关键因素之一。
Caspases是在细胞凋亡过程中起关键作用的蛋白酶家族,它们对BcI一2家族的蛋白质具有重要的酶解修饰作用,从而达到调节作用。
bcl一2等的表达也受到细胞因子的调控¨J。
颞下颌关节盘前移位后关节内应力等环境的改变如果长期存在,可能会导致凋亡信号产生并启动,与此同时多种基因表达发生变化,研究表明p53、c—myc等在变性的关节软骨细胞中表达明显高于正常一.10J。
这些可能都会引起bcl一2基因家族在其转录、翻译等阶段即开始适应新的变化了的环境,从而启动其新的表达方式。
颞下颌关节盘前移位后casp鹊es表达的增高对bcl一2基因家族的表达也有重要影响。
Bcl一2及Bax在细胞凋亡过程中起重要的调控作用。
颞下颌关节盘前移位后软骨细胞凋亡增加,本研究发现颞下颌关节盘前移位后Bcl一2在软骨细胞表达减弱,且随着时间的延长而更加明显,Bax的凋亡则与此相反。
提示Bcl一2与B戕参与了颞下颌关节盘前移位后软骨细胞凋亡的调控。
Bcl
J叫咖l“0ral
scienceResearch,0ct.2008,V01.24,No.5
一2及Bax本身在其基因的转录、翻译及蛋白质的表达等阶段也受到复杂、精确的调控,推测颞下颌关节盘前移位后关节内环境的改变、细胞因子的释放、c鼬pases的增加等都对Bcl一2及Bax的表达产生影
响。
因此进一步的研究是必要的,如凋亡信号与
Bcl一2及Bax基因互相影响的机制,Bcl一2基因家族表达的调控因素以及干预其基因的表达是否会产
生治疗效果等等。
另外,力学因素对软骨细胞已有
所影响¨1|,其中是否有凋亡基因的参与,也有待进一步研究。
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[收稿日期:
2008一oI一23】(本文编辑李四群)
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