酶工程笔记.docx

酶工程笔记.docx

《酶工程笔记.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《酶工程笔记.docx（36页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

酶工程笔记

第一章酶工程概述

酶工程：

利用酶或细胞的催化作用，在特定的细胞反应器中，将原料转化成所需产品并应用于社会生活的一门科学技术。

酶工程包括：

酶的生产、酶的改造、酶的应用三个方面。

酶：

是由活细胞产生的，在细胞内一定条件下起催化作用的具有高效率和高度专一性的蛋白质。

按国际标准，酶分为六大类：

氧化还原酶类、水解酶类、转移酶、聚合酶、异构酶、合成酶。

核酶：

唯一的非蛋白酶，是一类特殊的RNA，能够催化RNA分子中的磷酸酯键的水解及其逆反应。

酶的命名：

E.C.x.y.z.n酶学委员会，大类，亚类，亚亚类，顺序号

酶的催化特点：

1、催化效率高2、高度专一性3、活性可调节4、活性不稳定

影响酶催化作用的因素：

1、底物浓度的影响2、产物浓度3、酶浓度4、温度5、pH6、抑制剂7、激活剂（1、无机离子激活剂2、小分子的有机化合物3、生物大分子激活剂）

酶活力：

酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力，酶活力可用酶催化的某一化学反应的速率来表示。

酶活力单位（U）：

在特定条件下，每分钟催化1umol的底物转化为产物的酶量。

国际酶活单位—催量（kcat）：

在最适条件下，每秒钟催化1mol底物转化为产物的酶量。

1kcat=6*107U

酶的比活力（specificactivity）：

在特定条件下，单位质量的酶所具有的酶活力单位数称为酶的比活力。

转换数（Kcat）：

又称分子活性，或称摩尔催化活性，指单位时间内，酶分子的每个活性中心或每个酶分子所能转化的底物分子数，单位1/min。

是酶催化效率的一个指标。

催化周期（T）：

指酶进行一次催化所需的时间。

酶的催化周期为转换数的倒数。

酶活力测定方法：

终止反应法或连续反应法。

终止反应法：

在恒温系统中进行酶促反应，间隔一段时间后，终止酶反应，然后测定反应物的消耗量或产物的生成量，从而计算出酶活性。

具有化学法、放射性化学法、酶偶联法等方法测定。

连续反应法：

连续法测酶活活力。

不需要取样终止反应，而是基于反应过程中光谱吸收、气体体积、酸碱度、温度等的变化，用仪器跟踪监测反应，记录结果，算出酶活。

酶反应动力学：

是研究酶反应速率规律以及各种因素对酶反应速度影响的科学。

影响酶反应速率的因素：

浓度、外部因素、内部因素。

米氏方程与米氏常数。

米氏方程的意义

（1）通过酶反应动力学常数可以反映出反应性质、反应条件、反应速度之间的关系。

（2）反映出反应速度与底物浓度之间的关系。

（3）反映出反应速度与酶浓度之间的关系。

米氏常数的意义

1、Km是酶的一个特性常数，Km大小只与酶性质有关，而与酶浓度无关。

当底物确定，反应温度，pH及离子强度一定时，Km值为常数，可用来鉴别酶。

2、Km值可用于判断酶的专一性和天然产物，若一个酶有几种底物就有几个Km值，其中Km值最小的底物称为该酶的最适底物，又称天然底物。

3、1/Km可近似表示酶与底物亲和力的大小。

4、已知Km可由[S]计算v，或由v计算[S]。

5、Km可帮助推断某一代谢反应的方向和途径。

米氏方程的四种变形式。

抑制剂：

分为不可逆抑制与可逆的抑制作用。

（1）不可逆的抑制作用抑制剂与酶以共价键结合，不能用透析、超滤等物理方法去除抑制剂而使酶复活。

（2）可逆的抑制作用抑制剂与酶以非共价键结合，可以用透析、超滤等物理方法去除抑制剂而使酶复活。

分为竞争性可逆抑制（Km增大、Vm不变）、非竞争性可逆抑制（Km不变、Vm降低）、反竞争性可逆抑制（Km减小，Vm降低）。

第二章酶的发酵工程

第一节酶生物合成的调节机制

基因表达随环境变化情况，可大致把基因表达分为两类：

1、组成型表达2、适应性表达（诱导、阻遏）。

基因表达的调控主要表现在：

1、转录水平的调控2、转录后水平的调控，包括mRNA加工成熟水平的调控及翻译水平上的调控。

诱导物：

诱导酶起始合成的物质。

辅阻遏物：

阻遏酶产生的物质。

调节蛋白：

调节基因产生的一种变构蛋白。

两个结合位点：

操纵基因结合位点、效应物结合位点。

两种类型：

阻遏蛋白、阻遏蛋白原。

前导肽：

前导序列（trpL）可以产生一个含义14个AA的多肽，在翻译水平上调控前导区转录的终止。

这个假设的多肽称为前导肽，具有两个相邻的2个Trp密码子。

终产物阻遏：

某一代谢合成途径的终产物阻遏合成途径中酶的合成的现象。

分解代谢物的阻遏作用：

当培养基中存在两种碳源时，容易利用的碳源的分解代谢产物阻遏分解代谢另一种碳源的酶的合成的现象。

葡萄糖效应：

葡萄糖抑制微生物利用其它碳源（底物）的现象。

端粒（telomere）是真核细胞染色体末端具有的特殊结构，由许多成串的短的重复序列组成。

使正常染色体端部间不发生融合，保证每条染色体的完整性。

细胞每复制一次，末端DNA就缩短若干个端粒重复序列，当端粒缩短到一定程度时即引起细胞衰老，故端粒又被视为“生命时钟”。

端粒酶（telomerase）是一种延长端粒末端的核糖蛋白酶，是基本的核蛋白逆转录酶，含有引物特异识别位点，能以自身RNA为模板，合成端粒DNA并加到染色体末端，使端粒延长，从而增强细胞的增殖能力，延长细胞的寿命甚至使其永生。

基因扩增：

是通过增加基因拷贝数而调节基因表达的一种方式，为特定蛋白质编码的基因拷贝数选择性地增加，而其他基因并未按比例增加的过程。

它可以发生在个体发育的某一阶段或细胞分化的某一过程。

增强子：

是一段能够提高转录效率的特定的DNA序列，长度约100-200bp，核心组件8-12bp，单拷贝或者多拷贝串联存在。

增强子的作用特点：

1、提高同一条DNA链上的基因的转录效率，可远距离发挥作用，在基因的上游或者下游均可起作用。

2、与其序列的正反方向无关。

3、要有启动子才能发挥作用，但对启动子没有严格专一性。

4、必须与特定的蛋白质因子结合才能发挥作用，具有组织或细胞特异性。

第二节酶的发酵技术

酶的发酵技术主要包括：

菌种的选育与种子的培养、培养基的配配制、培养条件控制、发酵方法。

产酶菌种的要求：

（1）酶的产量高；

（2）容易培养和管理，产酶细胞容易生长繁殖，适应性强，便于管理；

（3）菌株遗传性能稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体，保证生产的稳定性；

（4）菌株能利用廉价原料，发酵周期短，生产成本低；

（5）有利于酶产品的分离纯化，最好是分泌型的胞外酶；

（6）菌株安全可靠，非病原菌，不产毒素及其它有害物质，不影响生产人员的身体健康；

（7）基因工程菌必须符合安全性要求。

产酶微生物的分离：

1、含菌样品的采集（产酶微生物的分步规律：

（1）相近菌种产生的酶性质一般相近或相似

（2）胞外酶的稳定性和最适条件通常和菌的最适生长条件接近（3）为获得能降解某种物质的产酶菌株，一般可从该物质分布比较丰富的地方寻找）

2、菌种的分离纯化（平板划线法、稀释涂布分离法）

3、产酶性能的测定（初筛（平板培养透明圈法）、复筛（液体或固体进行发酵，测定产酶水平））

4、菌种的选育（诱变育种、代谢控制育种、原生质体融合育种、基因工程育种、基因组改组）

菌种的退化与复壮

（1）菌种退化现象：

随着菌种保藏时间的延长或多次的转接传代，菌种本身所具有的优良遗传性状发生了不利于发酵生产的遗传变异现象。

（2）防止退化措施：

创造合适的培养条件，采取有效的菌种保藏方法，尽量减少传代次数。

（3）退化菌种的复壮：

纯种分离和性能测定。

包括已发生退化菌种的复壮和菌种退化之前的复壮和提高。

基因工程菌秀带的外源基因具有存在于染色体上和质粒上两种形式。

外源基因整合到染色体上，其遗传性较为稳定；如果存在于质粒上，由于质粒的不稳定性，在繁殖过程中质粒会部分甚至完全丢失，外源基因丢失的可能性大大增加。

通常，低温有利于重组质粒的稳定遗传。

为了保持携带外源基因质粒的基因工程菌产酶稳定性，常采取以下措施

（1）组建合适载体和受体菌：

选择能稳定传代的载体和受体菌组合。

（2）适当宿主施加选择压力：

利用某些生长条件，只让那些具有一定遗传特性的细胞才能够生长，例如，添加抗生素或其他措施。

（3）诱导表达，控制基因过量表达：

由于外源基因表达水平越高，重组菌往往越不稳定。

因此一般采用两阶段培养法，即在发酵前期控制外源基因不过量表达，使重组质粒稳定地遗传；在发酵产酶期，通过提高质粒的拷贝数或转录翻译效率，使外源基因高效表达。

发酵：

在无氧条件下，底物脱氢后产生的还原力不经过呼吸链而直接交给某一内源性的中间代谢产物的一类低效能反应。

工业微生物中的发酵实质上是指利用微生物形成产物的任何过程。

产酶促进剂：

表面活性剂（0.1%吐温80）、植酸钙镁、洗涤剂LS、聚乙烯醇、EDTA等。

培养基中的C/N比高，发酵液倾向于酸性；C/N比低，发酵液倾向于碱性，较低的C/N比常有利于蛋白酶产量提高。

临界氧浓度：

不影响细胞正常代谢的最低氧浓度。

溶氧浓度是由溶氧速率和耗氧速率来决定。

调节控制：

①调节氧分压改变进气压力或罐压，改变氧含量，添加氧载体

②增加通气量

③延长气液接触时间，增加气液接触面积

④改变培养液的性质改变组分或浓度，添加消泡剂

泡沫对产酶的影响及控制：

泡沫的不利影响：

1、阻碍CO2的排出，影响O2的溶解2、发酵罐溢出，造成原料浪费，易引起杂菌污染3、发酵罐装料量受限，降低发酵罐的利用率。

控制泡沫的方法：

1、选育不易产生泡沫的菌种2、调节培养基营养成分，减少或缓加易气泡的原料3、机械消泡或添加化学消泡剂。

发酵方法按发酵基质状态分为：

液体深层发酵和固体发酵。

按物料交换情况可分为：

分批发酵、连续发酵、补料分批发酵。

分批发酵特点：

操作简单；发酵初期营养物过多可能抑制微生物的生长，中后期可能因为营养物的减少及有害代谢产物的积累而降低培养效率

连续发酵优点：

可有效实现自动化，降低劳动强度，设备利用率高，可消除反馈阻遏作用，酶产率高。

适合于与生长相偶联的发酵产物的生产。

缺点：

菌种易变异退化，易染杂菌。

原料利用率低，生产成本增加。

补料分批发酵优点：

可解除营养基质的抑制和分解代谢物阻遏作用；可改善好氧发酵的溶氧状况；减少菌体生成量，提高有用产物的转化率；菌丝减少可降低发酵液的粘度，便于发酵培养物的输送及后处理；不易产生菌种退化和变异，杂菌污染易控制；使用范围广。

提高产酶措施：

1、添加诱导物（诱导物类型：

作用底物、反应产物、底物类似物）2、降低阻遏物浓度（分解代谢物阻遏、末端产物（反馈阻遏））3、添加表面活性剂（非离子型表面活性剂如吐温80）4、添加产酶促进剂（植酸钙镁、聚乙烯醇等）

第三节酶发酵动力学

细胞生长动力学

Monod方程

X为细胞浓度（g/L）；S为限制性基质的浓度（g/L）；μ为比生长速率（h-1），是单位菌体在单位时间内增殖量；μm为最大比生长速率（h-1），是指限制性基质浓度足够大时的比生长速率，也即是当S＞＞Ks时，μ=μm。

Ks为细胞对基质的半饱和常数（g/L），相当于比生长速率达到最大比生长速率一半时的限制性基质浓度。

发酵动力学

1、同步合成型（生长偶联型）

同步合成型是指：

酶合成与细胞生长同步。

当细胞进入对数生长期，酶大量生产；当细胞生长进入平衡期后，酶的合成停止。

所以，同步合成型又称为生长偶联型。

属于这种类型的酶，其生物合成可被诱导，但不受分解代谢产物和尾产物阻遏，而且，当除去诱导物或细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止。

这表明，这类酶所对应的mRNA是很不稳定的。

2、延续合成型

延续合成型是指：

酶的合成伴随着细胞生长而开始，但在细胞进入平衡期后，酶还可以延续合成较长的一段时间。

此类型的酶可受诱导，但不受尾产物阻遏和降解代谢产物阻遏，其对应的mRNA是相当稳定的，可在生长平衡期后一段时间内继续用于酶的合成。

3、中期合成型

中期合成型是指：

酶的合成在细胞生长一段时间以后才开始，而在进入细胞平衡期之后，酶的合成也终止。

这类酶受到尾产物阻遏，其对应的mRNA是很不稳定的。

4、滞后合成型

这种类型只有当细胞生长进入平衡期之后，酶才开始合成并大量积累。

许多水解酶类属于此类。

它们在细胞对数生长期不合成，可能是受到分解代谢产物阻遏作用的影响。

当阻遏解除后，酶开始合成，其对应的mRNA稳定性高。

综上所述，mRNA的稳定性以及培养基中阻遏物的存在，是影响酶生物合成模式的主要因素。

其中：

（1）mRNA稳定性高的，可在细胞停止生长后继续合成其对应的酶。

（2）mRNA稳定性差的，随着细胞停止生长而终止酶的合成。

（3）不受培养基中阻遏物阻遏的，可随着细胞生长而开始酶的合成。

（4）受阻遏的酶，要在细胞生长一段时间或进入平衡期后，解除阻遏，酶才开始合成。

在酶的工业生产中，为了提高酶产率和缩短发酵周期，最理想的是哪种类型?

是延续合成型。

因为细胞开始生长就有酶产生，细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续生成一段时间。

对于其他合成类型的酶，要在细胞选育上并在工艺条件方面加以适当调节：

（1）对于同步合成型，尽量提高对应的mRNA的稳定性，如降低发酵温度等。

（2）对于滞后合成型，要尽量减少阻遏物，使酶的合成提前开始。

（3）对于中期合成型的酶，则要从提高mRNA的稳定性以及解阻遏两方面进行。

产酶动力学方程式：

X——细胞浓度（g/L）α——生长偶联的比产酶系数（U／g）β——非生长偶联的比产酶速率（U／h·g）E——酶浓度（U/L）t——时间（h）

同步合成型酶

同步合成型的酶，其产酶与细胞生长偶联。

在平衡期产酶速率为零，即非生长偶联的比产酶速率β=0。

所以其产酶动力学方程为：

dE/dt=αμX

中期合成型酶

中期合成型的酶，其合成模式是一种特殊的生长偶联型。

在培养液中有阻遏物存在时，α＝0，无酶产生。

在细胞生长一段时间后，阻遏物被细胞利用完，阻遏作用解除，酶才开始合成，在此阶段的产酶动力学方程与同步合成型相同。

滞后合成型酶

滞后合成型的酶，为非生长偶联型，生长偶联的比产酶系数α＝0，其产酶动力学方程为：

dE/dt=βX

延续合成型酶

延续合成型的酶，在细胞生长期和平衡期均可以产酶，产酶速率是生长偶联与非生长偶联产酶速率之和。

其产酶动力学方程为：

dE/dt=αμX+βX

第三章酶的分离工程

酶的分离纯化过程包括四个阶段：

预处理、粗分离、细分离、成品化

第一节预处理

发酵液预处理的目的：

1、改变发酵液的物理性质，以提高固液分离的效率；2、尽可能使产物集中到便于后处理的某一相中（多数是液相）；3、去除发酵液中的部分杂质。

预处理的方法：

1、加热降低发酵液的粘度，使某些杂质变性，使发酵液容易过滤2、凝聚（agglomeration）在溶液中加入电解质，使非目标产物凝聚成较大的颗粒或胶团，更容易沉降或过滤。

3、絮凝（flocculation）利用高分子聚合物的桥联作用，将胶体粒子联结成网状絮凝团的过程。

聚丙烯酰胺4、添加助滤剂使胶体粒子吸附在固体助滤剂上，随助滤剂一起被截留。

硅藻土和珍珠岩

细胞破碎的方法：

机械破碎法（捣碎法、研磨法、匀浆法）、物理破碎法（温差法、压差法、超声波法）、化学破碎法（有机溶剂破碎法、表面活性剂破碎法）、酶促破碎法（溶菌酶破碎革阳、枯草杆菌，葡聚糖酶破碎酵母，几丁质酶破碎霉菌）

第二节酶的提取

酶的提取方法：

1、盐溶液提取法（盐浓度控制在0.02~0.5mol/L。

酵母醇脱氢酶0.5mol/L磷酸氢二钠溶液；枯草杆菌碱性磷酸酶0.1mol/L氯化镁溶液；霉菌脂肪酶用清水）2、酸溶液提取法（pH控制在2—6，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶用0.12mol/L硫酸溶液提取）3、碱溶液提取法（pH控制在8—12，细菌L-天冬酰胺酶用pH11.0~12.5碱性溶液提取）4、有机溶剂提取法（乙醇、丙酮、丁醇，琥珀酸脱氢酶、胆碱酯酶、细胞色素氧化酶：

丁醇。

核酶：

苯酚-水溶液）

影响酶提取的主要因素：

1、温度为防止酶的变性失活，提取时温度不宜过高。

特别是采用有机溶剂提取时，整个提纯操作应尽可能在低温下（0—10℃）进行。

2、pH在保持酶稳定的前提下，提取溶液的pH应远离酶的等电点。

碱性蛋白质提取体系的pH选在偏酸一侧，以增大蛋白质溶解度，提高提取效果。

但不宜过酸过碱以防酶变性失活。

3、搅拌温和搅拌

4、污染防止微生物污染及细胞内存在的蛋白酶水解。

另外，重金属污染也能引起酶失活

5、提取液的体积为含酶原料体积的3—5倍，少量多次，得到更好提取效果

第三节酶的分离纯化

将目标产物酶与各种杂质成分相互分离的过程成为酶的分离纯化。

目的：

①除杂；②浓缩。

原理：

利用目标产物酶与各种杂质成分在物理、化学及生物学性质上的差异。

方法：

离心、沉淀、过滤与膜分离、萃取、层析、电泳。

评价指标：

①总活力的回收率；②比活力提高倍数；③重现性。

检测：

酶活力与纯度

依据性质

方法

溶解度

盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、溶剂萃取

电荷极性

电泳、离子交换层析、等电聚焦、色谱聚焦

分子大小

离心、透析、凝胶过滤、超滤

亲和专一性

亲和层析、共价层析、免疫吸附层析、

染料配体亲和层析

离心分离：

离心机的种类按用途可分为制备、分析及分析—制备两用离心机。

按结构来分类可分为管式、碟片式、转鼓式、吊兰式。

按照转速可分为低速（转速不高于8000r/min，相对离心力不高于104g）、高速（转速1—2.5*104r/min，离心力104—106g）、超速（转速2.5—12*104r/min，离心力5*106g）三种。

离心分离方法可分为：

差速离心（differentialcentrifugation）：

通过控制不同的转速，使不同颗粒大小的物质先后沉降，从而使不同颗粒大小的物质得以分离。

密度梯度离心（densitygradientcentrifugation）：

是指将样品在密度梯度介质中进行离心，从而使沉降系数很接近的颗粒分离开来的一种区带离心方法。

等密度梯度离心（sedimentationequilibritiumcentrifugation）：

基于密度梯度离心的原理，根据颗粒密度的不同而进行分离的一种区带分离方法。

沉淀分离：

通过改变某些条件或添加某种试剂，使酶的溶解度降低，以沉淀的形式从溶液中析出，从而与其它溶质分离的技术。

蛋白质分子表面是由一系些分布不均匀的荷电区、亲水区和疏水区所组成。

蛋白质是两性电解质，在不同pH条件下带有不同的电荷。

蛋白质溶液是胶体溶液，维持其胶体溶液稳定性的因素有两个：

①蛋白质分子周围的水化层；②同种电荷的排斥作用。

盐析沉淀：

通过加入高浓度无机盐，使酶的溶解度降低，从而使之从溶液中沉淀析出的过程或现象称为盐析沉淀。

机理：

①破坏了蛋白质分子表面的水化层，使蛋白质分子表面的疏水基团暴露，蛋白质分子通过疏水作用相互聚集而沉淀；②无机盐中和了蛋白质分子表面的电荷，使蛋白质分子之间的电荷排斥作用消失，蛋白质分子的聚集作用增强。

影响因素：

无机盐的种类及浓度、温度、pH值，常用的无机盐：

硫酸铵、氯化钠、硫酸钠，脱盐处理：

透析、超滤、层析。

等电点沉淀法：

通过调节溶液的pH值，使其达到酶或蛋白质的等电点，从而使酶或蛋白质从溶液中沉淀析出的过程或现象称为等电点沉淀（isoelectricprecipitation）。

机理：

等电点时，蛋白质分子所带的净电荷为零，蛋白质分子之间的同种电荷排斥作用消失，蛋白质分子的聚集作用增强。

蛋白质在等电点的溶解度最小。

有机溶剂沉淀：

通过加入一定浓度的有机溶剂（乙醇、丙酮），使酶或蛋白质从溶液中沉淀析出的过程或现象称为有机溶剂沉淀法。

降低水溶液的介电常数，蛋白质分子之间的引力增加，蛋白质分子相互聚集而沉淀。

带电离子基团之间的作用力随介电常数的减小而增大。

水的介电常数较高，有机溶剂的较低。

优点：

有机溶剂密度较低，沉淀易于分离；沉淀物不需进行脱盐处理；有机溶剂易蒸发除去；沉淀物色泽较好。

缺点：

有机溶剂容易导致蛋白质变性失活，且易燃易爆，故必须在低温条件下进行操作，且沉淀物应迅速与有机溶剂分离，以减少酶的变性失活率。

沉淀能力:

丙醇>异丙醇>乙醇>甲醇。

工业上常用乙醇。

选择性变性沉淀法：

选择一定的条件使溶液中的杂蛋白变性沉淀而目标蛋白不受影响的方法称为选择性变性沉淀法。

选择性变性方式：

热变性，pH变性和有机溶剂变性。

其他沉淀方法：

非离子型聚合物沉淀法：

PEG，单宁，机理与有机溶剂相似。

聚电解质沉淀法：

机理为絮凝作用。

膜分离

加压膜分离——静压差，微滤、超滤、反渗透

电场膜分离——电场，电渗析

扩散膜分离——扩散作用，透析

透析：

以浓度差作为传质推动力，利用透析膜的膜孔截留作用使不同大小溶质分子相互分离的技术或方法。

特点：

以浓度产作为传质推动力，透过通量很小，分辨率不高，主要用于样品的脱盐，且局限于实验室，难以大规模使用。

萃取分离：

根据两相的状态，萃取可分为：

液液萃取、液固萃取、液气萃取、超临界流体萃取。

液液萃取：

有机溶剂萃取、双水相萃取、反胶团萃取、液膜萃取。

双水相萃取：

某些亲水性高分子聚合物在水溶液中混合达到一定的浓度后，可自发形成分别富含有两种不同聚合物的两个相，由于两个相都是水溶液（相），称为双水相系统。

利用双水相系统进行的萃取称为双水相萃取。

特点：

可用于酶或蛋白质等生物大分子的萃取，操作条件温和，不易导致目标产物的变性失活，可从细胞破碎液中直接萃取胞内目标产物，相平衡时间短。

成本较高，选择性不高，分离后产物浓度低。

萃取原理：

利用样品中不同溶质组分在两相中溶解度或分配比的不同来实现不同组分的相互分离。

影响因素：

1、双水相体系的组成成分和两相溶液的比例2、高分子聚合物的相对分子量、浓度和极性3、电解质、温度和pH4、酶的分子量、电荷性以及外加电场等。

反胶团萃取（reversedmicellarextraction，ATPS）：

表面活性剂分子在有机溶剂中达到一定的浓度后，可自发地形成疏水性尾部朝外亲水性头部朝内，含有水分子内核，纳米级透明的热力学稳定的聚集体，称为反胶团（reversedmicelles）。

利用反胶团进行的萃取称为反胶团萃取。

萃取原理：

利用酶或蛋白质等电解质与反胶团中表面活性剂分子亲水性头部所带荷电基团之间的静电作用以及反胶团的空间排阻作用来促使目标产物向反胶团中溶解。

操作过程分为：

正萃取与反萃取。

影响因素：

1、水相pH值、离子强度及其种类2、表面活性剂、助表面活性剂和有机溶剂3、温度和相比4、蛋白质的等电点、大小、种类和浓度。

层析分离（色谱法）：

原理：

混合液中各组分的理化性质（分子大小、吸附力、亲和力、带电等）不同，固定相对不同组分的作用力（方式,大小等）不同，随着流动相相对于固定相运动,各组分在固定相上移动速度不同,从而彼此分离开来。

分类：

根据流动相状态分类：

分为气相色谱和液相色谱，液相色谱又可分为常压液相色谱及高压液相色谱。

根据分离介质不同分为：

柱色谱，纸色谱，薄层色谱，毛细管色谱。

层析分离的方法：

凝胶层析（相对分子质量与形状）、吸附层析（吸引力）、分配层析（分配系数）、离子交换层析（离子交换）、亲和层析（亲和力）、层析聚焦（等电点）、疏水层析（疏水作用）。

常见的凝胶层析固定相：

葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺。

分配层析（partitionchromatography）是利用样品中的组分在两相间的分配系数不同而实现分离的一种技术。

其中，分配系数指的是溶质在互不相溶的固定相和流动相中溶解达到平衡后，固定相中溶质的浓度与流动相中溶质的浓度的比值。

根据层析支持物的不同，采用两种分配层析：

纸层析和薄层层析。

离子交换层析：

利用离子交换剂上的可解离基团对各种离子的亲和力不同，而使不同物质分离。

离子交换剂由两部分组成：

高分子聚合物构成的惰性骨架和可发生离子交换的