人血小板生成素TPO酶联免疫分析报告.docx
- 文档编号:27521032
- 上传时间:2023-07-02
- 格式:DOCX
- 页数:10
- 大小:38.04KB
人血小板生成素TPO酶联免疫分析报告.docx
《人血小板生成素TPO酶联免疫分析报告.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《人血小板生成素TPO酶联免疫分析报告.docx(10页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
人血小板生成素TPO酶联免疫分析报告
人血小板生成素(TPO)酶联免疫分析
试剂盒使用说明书
本试剂仅供研究使用目的:
本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中血小板生成素(TPO)的含量。
实验原理:
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人血小板生成素(TPO)水平。
用纯化的人血小板生成素(TPO)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入血小板生成素(TPO),再与HRP标记的血小板生成素(TPO)抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的血小板生成素(TPO)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中人血小板生成素(TPO)浓度。
试剂盒组成:
试剂盒组成
48孔配置
96孔配置
保存
说明书
1份
1份
封板膜
2片(48)
2片(96)
密封袋
1个
1个
酶标包被板
1×48
1×96
2-8℃保存
标准品:
270pg/ml
0.5ml×1瓶
0.5ml×1瓶
2-8℃保存
标准品稀释液
1.5ml×1瓶
1.5ml×1瓶
2-8℃保存
酶标试剂
3ml×1瓶
6ml×1瓶
2-8℃保存
样品稀释液
3ml×1瓶
6ml×1瓶
2-8℃保存
显色剂A液
3ml×1瓶
6ml×1瓶
2-8℃保存
显色剂B液
3ml×1瓶
6ml×1瓶
2-8℃保存
终止液
3ml×1瓶
6ml×1瓶
2-8℃保存
浓缩洗涤液
(20ml×20倍)×1瓶
(20ml×30倍)×1瓶
2-8℃保存
样本处理及要求:
1.血清:
室温血液自然凝固10-20分钟,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。
仔细收集上清,保存过程中如出现沉淀,应再次离心。
2.血浆:
应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂,混合10-20分钟后,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。
仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应该再次离心。
3.尿液:
用无菌管收集,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。
仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4.细胞培养上清:
检测分泌性的成份时,用无菌管收集。
离心20分钟左右(2000-3000转/分)。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时,用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液,细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右(2000-3000转/分)。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
5.组织标本:
切割标本后,称取重量。
加入一定量的PBS,PH7.4。
用液氮迅速冷冻保存备用。
标本融化后仍然保持2-8℃的温度。
加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或匀浆器将标本匀浆充分。
离心20分钟左右(2000-3000转/分)。
仔细收集上清。
分装后一份待检测,其余冷冻备用。
6.标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融.
7.不能检测含NaN3的样品,因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。
操作步骤:
1.标准品的稀释与加样:
在酶标包被板上设标准品孔10孔,在第一、第二孔中分别加标准品100μl,然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl,混匀;然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl,混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉,再各取50μl分别加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul,混匀;混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl,混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl,混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。
(稀释后各孔加样量都为50μl,浓度分别为180pg/ml,120pg/ml,60pg/ml,30pg/ml,15pg/ml)。
2.加样:
分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、待测样品孔。
在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。
加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。
3.温育:
用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液:
将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用。
5.洗涤:
小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。
6.加酶:
每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外。
7.温育:
操作同3。
8.洗涤:
操作同5。
9.显色:
每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟.
10.终止:
每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。
11.测定:
以空白空调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。
测定应在加终止液后15分钟以内进行。
注意事项:
1.试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。
2.浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶,洗涤时不影响结果。
3.各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。
一次加样时间最好控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。
4.请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔。
如标本中待测物质含量过高(样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值),请先用样品稀释液稀释一定倍数(n倍)后再测定,计算时请最后乘以总稀释倍数(×n×5)。
5.封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
6.底物请避光保存。
7.严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8.所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9.本试剂不同批号组分不得混用。
10.如与英文说明书有异,以英文说明书为准。
计算:
以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,
在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD
值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释
倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标
准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值
代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释
倍数,即为样品的实际浓度。
(此图仅供参考)
试剂盒性能:
1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990以上。
2.批内与批见应分别小于9%和11%
检测范围:
5pg/ml-220pg/ml
保存条件及有效期:
1.试剂盒保存:
;2-8℃。
2.有效期:
6个月
HumanTPO
FORRESEARCHUSEONLY
DrugNames
GenericName:
HumanTPOELISAKit.
Purpose
ThiskitallowsforthedeterminationofTPOconcentrationsinHumanserum,bloodplasma,andotherbiologicalfluids.
Principleoftheassay
ThekitassayHumanTPOlevelinthesample,usePurifiedHumanTPOantibodytocoatmicrotiterplatewells,makesolid-phaseantibody,thenaddTPOtowells,CombinedTPOantibodywhichWithHRPlabeled,becomeantibody-antigen-enzyme-antibodycomplex,afterwashingCompletely,AddTMBsubstratesolution,TMBsubstratebecomesbluecolorAtHRPenzyme-catalyzed,reactionisterminatedbytheadditionofasulphuricacidsolutionandthecolorchangeismeasuredspectrophotometricallyatawavelengthof450nm.TheconcentrationofTPOinthesamplesisthendeterminedbycomparingtheO.D.ofthesamplestothestandardcurve.
Materialsprovidedwiththekit
Materialsprovidedwiththekit
48determinations
96determinations
Storage
Usermanual
1
1
Closureplatemembrane
2
2
Sealedbags
1
1
Microelisastripplate
1
1
2-8℃
Standard:
270pg/ml
0.5ml×1bottle
0.5ml×1bottle
2-8℃
Standarddiluent
1.5ml×1bottle
1.5ml×1bottle
2-8℃
HRP-Conjugatereagent
3ml×1bottle
6ml×1bottle
2-8℃
Samplediluent
3ml×1bottle
6ml×1bottle
2-8℃
ChromogenSolutionA
3ml×1bottle
6ml×1bottle
2-8℃
ChromogenSolutionB
3ml×1bottle
6ml×1bottle
2-8℃
StopSolution
3ml×1bottle
6ml×1bottle
2-8℃
washsolution
(20ml×20fold)
×1bottle
(20ml×30fold)
×1bottle
2-8℃
Specimenrequirements
1.serum-coagulationatroomtemperature10-20mins,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,Ifprecipitationappeared,Centrifugalagain.
2.plasma-usesuitedEDTAorcitrateplasmaasananticoagulant,mix10-20mins,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,Ifprecipitationappeared,Centrifugalagain.
3.Urine-collectsueasterilecontainer,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,Ifprecipitationappeared,Centrifugalagain.TheOperationofHydrothoraxandcerebrospinalfluidReferencetoit.
4.cellculturesupernatant-detectsecretorycomponents,collectsueasterilecontainer,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,detectthecompositionofcells,DilutcellsuspensionwithPBS(PH7.2-7.4),Cellconcentrationreached1million/ml,repeatedfreeze-thawcycles,damagecellsandreleaseofintracellularcomponents,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,Ifprecipitationappeared,Centrifugalagain.
5.Tissuesamples-Aftercuttingsamples,checktheweight,addPBS(PH7.2-7.4),Rapidlyfrozenwithliquidnitrogen,maintainsamplesat2-8℃aftermelting,addPBS(PH7.4),HomogenizedbyhandorGrinders,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant.
6.extractassoonaspossibleafterSpecimencollection,andaccordingtotherelevantliterature,andshouldbeexperimentassoonaspossibleaftertheextraction.Ifitcan’t,specimencanbekeptin-20℃topreserve,Avoidrepeatedfreeze-thawcycles.
7.Can’tdetectthesamplewhichcontainNaN3,becauseNaN3inhibitsHRPactive.
Assayprocedure
1.DiluteandaddsampletoStandard:
set10StandardwellsontheELISAplatescoated,addStandard100μltothefirstandthesecondwell,thenaddStandarddilution50μltothefirstandthesecondwell,mix;takeout100μlformthefirstandthesecondwellthenaddittothethirdandtheforthwellseparately.thenaddStandarddilution50μltothethirdandtheforthwell,mix;thentakeout50μlfromthethirdandtheforthwelldiscard,add50μltothefifthandthesixthwell,thenaddStandarddilution50μltothefifthandthesixthwell,mix;takeout50μlfromthefifthandthesixthwellandaddtotheseventhandtheeighthwell,thenaddStandarddilution50μltotheseventhandtheeighthwell,mix;takeout50μlfromtheseventhandtheeighthwellandaddtotheninthandthetenthwell,addStandarddilution50μltotheninthandthetenthwell,mix,takeout50μlfromtheninthandthetenthwelldiscard(addSample50μltoeachwellafterDiluting,(density:
180pg/ml,120pg/ml,60pg/ml,30pg/ml,15pg/ml)
2.addsample:
Setblankwellsseparately(blankcomparisonwellsdon’taddsampleandHRP-Conjugatereagent,othereachstepoperationissame).testingsamplewell.addSampledilution40μltotestingsamplewell,thenaddtestingsample10μl(samplefinaldilutionis5-fold),addsampletowells,don’ttouchthewellwallasfaraspossible,andGentlymix.
3.Incubate:
AfterclosingplatewithClosureplatemembrane,incubatefor30minat37℃.
4.Configurateliquid:
30-fold(or20-fold)washsolutiondiluted30-fold(or20-fold)withdistilledwaterandreserve.
5.washing:
UncoverClosureplatemembrane,discardLiquid,drybyswing,addwashingbuffertoeverywell,stillfor30sthendrain,repeat5times,drybypat.
6.addenzyme:
AddHRP-Conjugatereagent50μltoeachwell,exceptblankwell.
7.incubate:
Operationwith3.
8.washing:
Operationwith5.
9.color:
AddChromogenSolutionA50ulandChromogenSolutionBtoeachwell,evadethelightpreservationfor15minat37℃
10.Stopthereaction:
AddStopSolution50μltoeachwell,Stopthereaction(thebluecolorchangetoyellowcolor).
11.assay:
takeblankwellaszero,Readabsorbanceat450nmafterAddingStopSolutionandwithin15min.
Importantnotes
1.Thekittakesoutfromtherefrigerationenvironmentshouldbebalanced15-30minutesintheroomtemperature,ELISAplatescoatedifhasnotuseupafteropened,theplateshouldbestoredinSealedbag.
2.washingbufferwillCrystallizationseparation,itcanbeheatedthewaterhelpsdissolvewhendilute.Washingdoesnotaffecttheresult.
3.addSamplewithsamplerEachstep,Andproofreaditsaccuracyfrequently,avoidstheexperimentalerror.addsamplewithin5mins,ifthenumberofsampleismuch,recommendtouseVolley.
4.ifthetestingmaterialcontentisexcessivelyhigher(ThesampleODisbiggerthanthefirststandardwell),pleasediluteSample(n-fold),Pleasediluenteandmultipliedbythedilutionfactor.(×n×5).
5.Closureplatemembraneonlylimitsthedisposableuse,toavoidcross-contamination.
6.Thesubstrateevadethelightpreservation.
7.Pleaseaccordingtouseinstructionstrictly,Thetestresultdeterminationmusttakethemicrotiterplatereaderasastandard.
8.Allsamples,washingbufferandeachkindofrejectshouldaccordingtoinfectivematerialprocess.
9.Donotmixreagentswiththosefromotherlots.
Takethestandarddensityasthehorizontal,theODvalueforthevertical,drawthestandardcurveongraphpaper,FindoutthecorrespondingdensityaccordingtothesampleODvaluebytheSamplecurve
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 血小板 生成 TPO 免疫 分析 报告