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内蒙古自治区地方标准
内蒙古自治区地方标准
《尖叶胡枝子总黄酮质量标准》
编制说明
标准起草组
二0一六年六月
一、工作简况
1、任务来源
为了进一步认真贯彻和落实《标准化事业发展十二五规划》,根据内蒙古自治区质量技标监督局关于征集2016年内蒙古自治区自治区地方标准制修订计划项目的函要求,中国农业科学院草原研究所申报了《尖叶胡枝子总黄酮质量标准》内蒙古自治区地方标准制定项目,并被列为内蒙古自治区质量技术监督局2016年内蒙古自治区地方标准制修订计划。
2、标准主要起草单位及起草人
主要起草单位:
中国农业科学院草原研究所
主要起草人:
阿拉木斯、吴洪新、王育青、乌兰巴特尔、赵金梅、戴雅婷、张晓庆、常春、孙娟娟、刘洪林。
二、目的意义
尖叶胡枝子具有抗旱、耐寒、耐瘠薄及适应性广等特性,是良好的水土保持植物,作为生态草和优良牧草,近年来受到格外重视。
另外,《全国中草药汇编》中记载尖叶胡枝子全株入药,苦,微寒,可止泻利尿,止血,主治痢疾,遗精,吐血,子宫下垂。
本人对尖叶胡枝子化学成份进行了系统研究,发现黄酮类是尖叶胡枝子的主要活性物质,占干物质的2-4%。
黄酮类化合物广泛存在于高等植物中,但受含量、资源与成本的限制,真正用于开发黄酮类化合物的植物资源有限,尖叶胡枝子作为黄酮的提取原料具有黄酮含量高且活性好、资源丰富、价格低廉及无毒的优势,研究表明在内蒙古地区均适宜种植,且栽培技成熟,为产业化提供原料成为可能。
尖叶胡枝子中不仅含有丰富的黄酮,而且含有大量的其它代谢产物如多糖,生物碱等,这些次生代谢产物往往是重要的生理活性物质,可开发成药物、功能性食品、食品添加剂等对人类的健康具有重要的意义。
另外,提取完的残渣可以制成草颗粒用于畜养的饲料,减少原料的浪费,可实现尖叶胡枝子的综合开发与利用,大大提高尖叶胡枝子的经济附加值。
尖叶胡枝子黄酮若成功实现综合开发与利用会带动农牧民大面积种植,不仅增加绿地和绿色屏障,对区域环境产生显著的生态效益,同时也会为巩固生态治理及发展区域经济做出积极的贡献。
尖叶胡枝子总黄酮以碳苷黄酮(荭草素、异荭草素、牡荆苷和异牡荆苷)为主,鉴定得到8个黄酮类化合物分别为:
荭草素、异荭草素、牡荆苷、异牡荆苷、异杨梅树皮苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷6-xylopyranosylluteolin,结构如图所示。
这些化合物均有较好的生理活性:
具有一定的保肝及抗氧化作用、可抑制甲状腺过氧化酶活性及抗甲状腺和致甲状腺肿作用、具有抗Para3(副流感病毒)病毒的活性、对金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌有较强的抑制作用、对人类癌细胞显示了一定的细胞毒作用、对心血管疾病有一定的效果。
另外,本课题组的研究结果显示尖叶胡枝子总黄酮具有显著的抗氧化活性,能够有效清除机体内的自由基,提高机体的抗氧化能力;可以有效提高肉鸡的免疫器官指数,对法氏囊(体液免疫)和胸腺(细胞免疫)均有显著的增强作用。
尖叶胡枝子的价值就是为医药、保健、食品及饲料添加剂提供高效、优质、价廉的黄酮类化合物原料,为人类健康做出积极长远的贡献。
要实现尖叶胡枝子资源有效开发与利用,研制出集食用、医疗、营养与保健于一体的高档绿色尖叶胡枝子黄酮系列产品,确保尖叶胡枝子总黄酮的安全性、有效性和质量的稳定均一性以及尖叶胡枝子研究开发的科学性,必须制定尖叶胡枝子总黄酮的质量标准,有效控制尖叶胡枝子总黄酮的质量,为尖叶胡枝子总黄酮的开发利用奠定基础。
三、编制原则和依据
本标准的编制遵循“适用性,专业化、生产环节的精细化、规范性”原则,重点突出在理化、安全指标上,并注重标准的可操作性,严格按GB/T1的要求进行编写。
目前,黄酮的生产技术工艺、黄酮提取分离纯化方法均已成熟,且有产业化的黄酮产品,如银杏叶黄酮、大豆异黄酮、葛根黄酮、竹叶黄酮、沙棘总黄酮等。
目前总黄酮质量没有对应的国家标准、行业标准和地方标准发布实施,编制人员在充分考虑实际情况的基础上,参考相近类似标准GB/T251742010饲料添加剂4′,7-二羟基异黄酮;NY/T1252-2006大豆异黄酮,编制了此项标准。
标准制定的依据:
水分:
按照水分测定法(《中国药典》2005年版一部附录IXH第一法)测定;
炽灼残渣:
根据《中华人民共和国药典》2005年版一部附录IXJ炽灼残渣检查法;
重金属检测:
根据《中华人民共和国药典》2005年版一部附录IXE进行了重金属含量检测;
砷盐检测:
根据《中华人民共和国药典》2005年版一部附录IXF第一法(古蔡氏法)进行了砷盐检测。
四、编制过程
1.成立起草小组
2014年3月20日,中国农业科学院草原研究所组织召开《尖叶胡枝子总黄酮质量标准》编制方案论证会,确定编制原则、编制框架、内容和拟制定、修订的标准,并进行分工,确定了参与标准编制的相关部门及主要人员。
2.广泛调研,拟定大纲,
标准起草小组全体人员收集了相关国家标准、行业标准和省外标准,在对收集的标准和资料进行认真整理的基础上,主要编制人员对需要编制的标准进一步论证和研讨,提出了制订《尖叶胡枝子总黄酮质量标准》的调研计划。
自2014年5月底到2014年8月,标准起草小组成员先后分头考察了相关企业,类似研究的高等院校及科研机构等。
调研过程中,标准起草小组走访了相关研究的专家,认真听取并记录了专家们对标准编制提取的意见与建议。
结合前期收集的资料,拟定了标准编写大纲。
3.整理归纳,编写初稿
在广泛调研掌握一手资料的基础上,起草小组对掌握的材料进行整理、分析、归纳,紧密围绕编写大纲,参考相近行业类似标准和其它省区地方标准的编制情况,在与相关部门和专家就标准内容进行多次研讨的基础上,于2015年1月底完成标准初稿。
4.反复修改,优化结构,探讨标准初稿,形成征求意见稿
标准初稿完成后,后续又召开了多次标准起草工作组会议,会上邀请了众多相关专家,标准起草人员与相关学者专家共同对标准的整体框架及部分内容进行了探讨,对编制中遇到的疑问进行了分析和总结。
标准起草小组按照讨论意见和建议对标准进行了多次反复修改、对各部分的框架做出了优化调整,并于2016年6月最终形成征求意见稿,向社会广泛征求意见。
五、主要条款说明
5.1尖叶胡枝子总黄酮质量标准主要包括以下几个部分(如下表1)
序号
名称
1
命名
2
尖叶胡枝子总黄酮制法
3
性状
4
尖叶胡枝子总黄酮的鉴别
5
检查(水分、重金属、砷盐)
6
尖叶胡枝子总黄酮含量测定
尖叶胡枝子总黄酮质量地方标准范围中明确规定了尖叶胡枝子总黄酮的制法、性状、鉴别及总黄酮中的水分、重金属及砷盐的含量,同时对尖叶胡枝子总黄酮进行了详细的试验方法和检验规则设定。
试验方法包括尖叶胡枝子总黄酮的化学鉴别、总黄酮的含量测定及水分、重金属和砷盐的检查。
严格按国家的相关标准进行试验检测。
5.2标准主要技术指标修订说明
【名称】以植物材料名称加所得中间体的来源形式命名为尖叶胡枝子提取物,其相应的拼音名称为jianyehuzhiziTiquwu。
【拉丁名】TotalflavonoidsofLespedezahedysaroides.
【制法】取干燥尖叶胡枝子,粉碎,用70%乙醇,加热温度为70℃,料液比为1:
20回流提取三次,合并提取液,回收乙醇至无醇味,用石油醚萃取3次除叶绿素,并浓缩至适量,加于已经处理好的D101大孔吸附树脂柱上,依次用水及80%乙醇洗脱,收集相应的乙醇洗脱液,回收乙醇,浓缩成稠膏,真空干燥,粉碎即得。
提取方法的选择:
以总黄酮含量为指标,比较了加热醇提法和水提法及甲醇提取法,综合提取效果、提取效率、产品安全等因素考察,以加热醇提法最优,所以最终选择醇热提法作为提取方法。
分别选取浸提时间、醇浓度、温度及固液比这四个因素进行单因素试验,根据单因素试验结设计正交试验L16(45),确定了最佳提取条件。
乙醇浓度为70%、温度为70℃、料液比为1:
20、提取时间为2h为尖叶胡枝子黄酮类化合物的最佳提取条件。
大孔树脂的纯化:
比较了9种不同型号大孔树脂(HP-20、AB-8、D-101、XAD7HP、XDA-16、LS-300、LS-302、LS-303、LS-300B型大孔吸附树脂)对总黄酮的吸附及洗脱效果情况,结果显示D101的吸附量及洗脱效率优于其它树脂,是一种较为理想的吸附剂。
以总黄酮的得率为指标,通过比较不同吸附与洗脱流速、及不同浓度的乙醇洗脱程序,确定了大孔树脂纯化尖叶胡枝子总黄酮的洗脱程序。
D101型大孔吸附树脂纯化尖叶胡枝子总黄酮工艺的验证:
平行纯化3次,算出洗脱率和纯度,根据相对标准偏差,精制度(醇洗干膏纯度/样品纯度),考察其重现性。
D101型大孔吸附树脂纯化尖叶胡枝子黄酮的工艺验证结果表
编号
上样黄酮量mg
洗脱黄酮量
洗脱率
%
样品干膏重g
样品纯度%
醇洗干膏重g
醇洗干膏纯度%
精制度%
1
383
366.21
95.62
3.27
11.74
1.083
35.36
301.93
2
383
365.89
95.53
3.26
11.75
1.076
35.59
302.97
3
383
364.85
95.26
3.25
11.78
1.065
35.96
305.16
RSD%
0.19
0.306
0.845
0.54
结果表明:
D101大孔吸附树脂纯化尖叶胡枝子总黄酮的效果良好,精制度高,重现性好。
【性状】根据目视观测,尖叶胡枝子提取物3批样品均为棕黄至棕褐色粉末,气淡,味苦。
【鉴别】尖叶胡枝子提取物中主要活性成分是黄酮类化合物,因此可以用黄酮类化合物的特征化学反应对其进行鉴别。
黄酮的化学鉴别
黄酮鉴别法盐酸—镁粉反应和氯化铝反应。
提取物的甲醇溶液为黄色,经盐酸—镁粉反应后变为红色,经氯化铝反应后变为明亮的黄绿色,现象明显,易于观察。
薄层色谱鉴别
经过文献考察与反复摸索以氯仿-甲醇-水(8:
1:
1)混合液作展开剂在正相硅胶板上展开,以5%硫酸醇溶液为显色剂,斑点清晰,易于鉴别。
【检查】按《中国药典》2005年版一部附录要求及常规规定,选择以下四种检查项作为规定检查项目。
1.尖叶胡枝子总黄酮
称取尖叶胡枝子总黄酮粉末(过80目筛)约100.0mg,精密称取,加甲醇使溶解并定容至50mL,摇匀,微孔滤膜滤过,作为供试品溶液,备用。
本品主要成分为黄酮,采用分光光度法(中国药典2005年版一部附录VA),建立尖叶胡枝子总黄酮的含量测定方法。
芦丁标准贮备液的制备:
精密称取120℃干燥至恒重的芦丁标准样品20mg,用70%乙醇溶解后移至100mL棕色容量瓶中,用70%乙醇定容至刻度,放入冰箱中备用。
供试品溶液的制备:
称取尖叶胡枝子总黄酮样品约0.5g,精密称定,置于50mL容量瓶中,加70%乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀,备用。
测定波长的选择:
精密吸取对照品溶液1mL于10mL容量瓶中,加入1%ALCL32mL,用50%乙醇稀释至刻度,摇匀,室温放置15min,以相应试剂为空白,在200-600nm范围内扫描,结果显示最大吸收波长为510nm。
精密吸取尖叶胡枝子总黄酮供试品溶液1mL,按上述步骤操作,结果在510nm有吸收峰。
因此,选择510nm为测定波长。
测定方法:
分别吸取对照品溶液与供试品溶液适量,按照分光光度法(中国药典2005年版一部附录VA)测定。
本品按干燥品计含尖叶胡枝子总黄酮不得少于35.06%。
2.水分
按照水分测定法(《中国药典》2005年版一部附录IXH第一法)测定,计算3批尖叶胡枝子提取物水分含量:
3.46%、3.69%、3.58%,水分的限量标准可暂定为5.0%。
3.炽灼残渣检查
炽灼残渣检查按《中国药典》2005年版一部附录IXJ“炽灼残渣检查法”检查。
限定其炽灼残渣不得超过1.0%。
4.重金属检查
取炽灼残渣项下遗留的残渣,按《中国药典》2005年版一部附录IXE“重金属检查法”第二法检查,重金属限量不得过百万分之五。
5.砷盐检查
取炽灼残渣项下遗留的残渣,按《中国药典》2005年版一部附录IXF“砷盐检查法”第一法之古蔡法检查,砷盐限量不得过百万分之一。
【功能】体内外活性研究表明尖叶胡枝子提取物具有显著的抗氧化活性。
分别使用Fenton反应法、邻苯三酚自氧化法和碘—硫代硫酸钠滴定法测定尖叶胡枝子黄酮对羟自由基、超氧阴离子的清除作用和抑制猪油、菜油、亚油酸的氧化酸败作用。
结果显示:
尖叶胡枝子黄酮对羟自由基有较强的清除作用,而且在一定的浓度范围内,清除作用随着黄酮浓度的增加清除效果增强,当添加浓度为1mg/mL时清除率高达98.5%;尖叶胡枝子黄酮对超氧阴离子有较强的清除作用,一定的浓度范围内随着黄酮浓度升高,对邻苯三酚自氧化速率的抑制作用越明显;通过测猪油的POV值发现,尖叶胡枝子黄酮具有一定的抗氧化性,抗氧化性初期表现为逐渐增强的趋势,随着时间的延长,POV值增加的趋势越不明显,即抗氧化效果越强;菜油中添加尖叶胡枝子黄酮可显著抑制菜油的氧化酸败,随着尖叶胡枝子黄酮添加量的增加,菜油的过氧化值升高速度变慢,抗氧化效果更显著;亚油酸中添加尖叶胡枝子黄酮可显著性地抑制亚油酸的自氧化,随着时间的延长,抑制效果越显著。
【贮藏】影响因素(高温、高湿、光照)试验、初步稳定性试验表明尖叶胡枝子提取物性质稳定,只需按常规方式密封,避光,置于干燥阴凉处贮藏即可。
六、重大意见分歧及处理依据和结果
标准起草小组前期对内蒙古自治区相关行业进行了充分的准备和调研,并做了大量的数据调查论证、信息分析和行业研讨,将标准征求意见稿向代表性的行业企业及相关单位广泛征求意见。
本标准制定过程中无重大分歧意见。
七、本标准未采用国际标准或国外先进标准。
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